Herstellung von Ratten Oligodendrozyten Vorläuferkulturen und Quantifizierung von Oligodendrogenesis Mit Doppel-Infrarot-Fluoreszenz-Scanning

Zusammenfassung

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.

Zusammenfassung

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.

Einleitung

Efficient Nervenleitung in der Säugetiere Zentralnervensystem (ZNS) erfordert Myelinisierung von Axonen durch Oligodendrozyten. Während der Entwicklung entstehen Oligodendrozyten aus einem Pool von Oligodendrozyten-Progenitorzellen (OPC), die gedacht werden, von den ventrikulären Zonen der Entwicklung des Vorderhirns und Neuralrohr ¹ zu migrieren. Nach der Migration OPCs zu reifen unterscheiden, myelinisierenden Oligodendrozyten, die nicht nur effizient Impulsausbreitung zu erleichtern, sondern auch Axone mit trophischen Unterstützung ² liefern. Die adulten ZNS unterhält eine reichliche Population von OPCs, die während der grauen und weißen Substanz dispergiert sind, die ungefähr 5-8% aller Zellen ^3. Nach einer demyelinisierenden Beleidigung, wandern OPCs zu der Stelle der Verletzung, vermehren und differenzieren verlorenen oder beschädigten Myelinscheiden an exponierten Axone zu ersetzen. Doch in einigen Krankheit / Verletzung Einstellungen wird dieses Verfahren ineffizient zu sein oder ganz ausfallen ⁴ gefunden. Währendchronische Demyelinisierung wird gedacht, um die Krankheitslast, effiziente oligodendrogenesis und Remyelinisierung kostenlos in ^fünf Symptome zu lindern. Es ist daher von Interesse gewesen OPCs in vitro zu studieren die Wirkung der experimentellen Faktoren auf oligodendrogenesis zu bestimmen.

Einblick in die verschiedenen Phasen der Oligodendrozyten-Differenzierung wurde durch die Identifizierung von Stufe spezifische Zellmarker ermöglicht worden. Selbst erneuernden frühen Vorläuferzellen durch ihre Expression von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor-Rezeptor alpha (PDGFRα), neuronalen / Glia-Antigen 2 (NG2) und A2B5 ⁶ definiert sind ^{- 8.} Als OPC ihre Differenzierungsprogramm und ziehen sich aus dem Zellzyklus einleiten, herunterregulieren sie Expression dieser Marker und beginnen Proteine ​​zu exprimieren bezeichnend für Oligodendrozyten mit zyklisch-Nukleotid-3'-Phosphodiesterase (CNPase) und O4 premyelinating. Schließlich deren Differenzierung in reiferen oligodendrocytes wird durch die Expression von Myelin-assoziierten Proteine, einschließlich Myelin-assoziiertes Glykoprotein (MAG), Proteolipidprotein (PLP) und basisches Myelinprotein (MBP) aus. MBP ist ein intrazelluläres peripheren Membranprotein und ein Hauptbestandteil der Myelinscheide. Mäuse entwickeln fehlt MBP einen schweren Phänotyp, in dem CNS Myelinisierung deutlich zu Zittern verringert führt, ist, Krämpfe und frühen Tod ^9,10. Diese wichtige Rolle der MBP in Myelinisierung hat zu seiner Verwendung als ein Marker für Oligodendrozyten Differenzierung führte sowohl in vitro als auch in vivo ^11.

Quantifizierung von MBP kann mit verschiedenen Methoden erreicht werden. RT-PCR und Western Blot-Analyse ermöglichen eine Quantifizierung der MBP-Niveaus unter verschiedenen Behandlungsschemata. Immunzytochemie ist eine gemeinsame qualitative Ansatz, der auch quantitativ sein können, wenn die Kamera-basierte Mikroskopie Ansätze verwendet werden. Obwohl diese Systeme sind zuverlässig und grundlegenddas Studium der Oligodendrozyten-Differenzierung, sie haben jeweils ihre eigenen Nachteile, die ihre Verwendung in Arzneimittel-Screening begrenzen. Erstens, die Menge der primären OPCs, die für RT-PCR und Western Blot-Analyse erforderlich sind, reduziert die Anzahl der Variablen, die gleichzeitig untersucht werden können. Während die Zelle Voraussetzung für Immunzytochemie viel niedriger ist, müssen erhebliche Zeit zu jedem Experiment gewidmet werden, wenn die Quantifizierung ist das Ziel. Zahlreiche Bilder müssen experimentelle Analyse zu erleichtern eingefangen und dann quantifiziert werden. Diese Einschränkungen werden wichtige Hindernisse für Studien zu berücksichtigen, die einen hohen Durchsatz Beurteilung erfordern. Hier beschreiben wir eine Methode, die grundlegenden Aspekte von nutzt sowohl der Immunzytochemie und Western Blot Methoden zur Quantifizierung Myelin, während erheblich sowohl die Anzahl von Zellen erforderlich ist und die Zeit zu reduzieren quantitative Analyse durchzuführen.

Protokoll

Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) und Johns Hopkins School of Medicine zugelassen.

1. Herstellung von Assay-Platten, Stammlösungen und OPC-Basismedien

Hinweis: Die Ratte OPC Basis (Sato) hier beschriebenen Medien wurde von bisher veröffentlichten Studien ^12,13 abgeleitet. Alternative Medien Formulierungen können auch mit diesem Verfahren kompatibel sein.

1. Resuspendieren Poly-L-Lysin (PLL) auf eine Konzentration von 10 ug / ml in sterilem deionisiertem Wasser. Pipette 400 ul der verdünnten PLL in jede Vertiefung einer schwarzen Wänden, klarer Boden 24-Well-Gewebekulturqualität Gericht.
2. Coat-Gewebekulturschalen für 2 Stunden in einem 37 ° C Brutschrank oder über Nacht in einen 4ºC Kühlschrank.
3. Saugen PLL aus beschichtetem Geschirr mindestens 20 Minuten vor der Beschichtung. Lassen Sie die restlichen PLL aus dem Bohrloch zu trocknen, indem Platten mit 24 Vertiefungen mit dem Deckel teilweise offen in einer GewebekulturHaube. Stellen Sie sicher, dass die Brunnen vor dem Beschichten isoliert OPC vollständig trocken sind. Die Zellen werden nicht an Kunststoff haften, die Flüssigkeit PLL Gegenwart hat.
4. Bereiten N-Acetyl-L-Cystein (NAC) Stammlösung (1,000x): Man löst 100 mg N-Acetyl-L-Cystein (NAC) in 20 ml Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM). Aliquotieren und bei -20 ° C.
5. Bereiten Sie Hydrocortison-Stammlösung (1,000x): 1 ml Ethanol zu 1 mg Hydrocortison und Wirbel zu lösen. In 19 ml DMEM, mischen Sie die Lösung, aliquoten und bei -20 ° C. Der Zusatz von Hydrocortison zum Basismedium wurde ¹⁴ das Überleben von Gliazellen zu verbessern gezeigt.
6. Bereiten d-Biotin-Stammlösung (5.000-facher): Man löst 2,5 mg d-Biotin in 50 ml PBS. Hinzufügen 1-2 x 5 ul Tropfen 0,1 N NaOH in Lösung zu unterstützen. Aliquotieren und bei -20 ° C.
7. Bereiten Insulin-Stammlösung (100x): Man löst 25 mg Insulin in 50 ml Gewebekulturqualität Wasser. In 250 ul of 1 N HCl und mischen, bis die Lösung klar ist. Sterilisieren mit einem 0,22-um-Filter und lagern bei 4 ° C für bis zu 6 Wochen.
8. Bereiten Sato Stammlösung (100x):
   1. Bereiten Progesteron-Stammlösung (25 ug / ul): Man löst 2,5 mg Progesteron in 100 ul Ethanol.
   2. Bereiten Natriumselenit-Stammlösung (400 ng / & mgr; l): Man löst 4 mg Natriumselenit in 100 ul 0,1 N NaOH. 10 ml DMEM und mischen.
   3. Zu 100 ml DMEM, fügen 1 g Human apo-Transferrin, 1 g Rinderserumalbumin und 160 mg Putrescin und mischen vollständig aufzulösen. In 25 ul Progesteron-Stammlösung, 1000 ul von Natriumselenit Stammlösung und mischen. Aliquotieren und bei -20 ° C.
9. Bereiten OPC Basis Medium: pro 100 ml DMEM (mit 4,5 g / L D-Glukose, L-Glutamin und 110 mg / L Natriumpyruvat), 100 ul NAC, 100 & mgr; l Hydrocortison, 20 & mgr; l d-Biotin, 1 ml Insulin, 1 ml Sato Lager, 100 ul Spurenelemente B,2 ml B-27 Supplement (50x), und 1 ml Penicillin / Streptomycin (100x). Sterilisieren mit einem 0,22-um-Filter und lagern bei 4 ° C.
10. Bereiten PDGF-AA-Stammlösung (1,000x): Man löst 250 & mgr; g in 12,5 ml PBS mit 0,1% Rinderserumalbumin (BSA), um eine 20 ug / ml Lösung herzustellen. Aliquotieren und bei -80 ° C.
11. Bereiten OPC Proliferation Medien: OPC-Basismedium, ergänzt mit 20 ng / ml PDGF-AA.
12. Bereiten OPC Differenzierung Medien: OPC-Basismedium mit 45 nM Trijodthyronin ergänzt.
13. Bereiten Säulenpuffer: Zu 500 ml PBS, fügen Sie 2,5 g BSA und 2 ml 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und der pH-Wert auf 7,2. Sterilisieren mit einem 0,22-um-Filter und lagern bei 4 ° C.

2. Rattenhirn Dissection

Hinweis: P5-P7 Rattenjungen in diesem Protokoll verwendet werden. Jede Ratte Welpen Kortex ergibt etwa 1,5 bis 2,0 x 10 ⁶ A2B5-positiven Zellen.

1. Sterilisieren Sie alle Dissektion die Einrichtung 250 mit6; C erhitzt Perle Sterilisator.
2. Hinzufügen 15-20 ml PBS (ohne Ca ^{2+ und Mg 2+)} zu 50 ml konischen Röhrchen. Ein 50 ml konischen Röhrchen reicht für 3-4 Rattenjungen Rinden. Zeigen 50 ml konischen Röhrchen auf Eis. Verwenden Sie 50 ml konische Röhrchen beim Präparieren gewürfelt Kortex Gewebe zu halten.
3. In kaltem PBS zu einer 10 cm Petrischale. Dieses Gericht wird für die Präparation unter dem Lichtmikroskop verwendet werden.
4. Opfern Rattenjungen durch Enthauptung mit großen chirurgischen Schere. Sprühkopf mit 70% Ethanol.
5. Entpacken Sie die Whole-Brain
   1. Mit einer kleinen Schere schneiden Sie die Haut nach unten der Mittellinie und hinter den Ohren und Haut Klappen zurück. Schneiden Sie die Schädel der Mittellinie vom Hirnstamm ausgehend nach unten und an den Augen endet. Achten Sie darauf, nicht zu tief zu schneiden, um die Struktur des zugrunde liegenden Kortex zu bewahren.
   2. Machen Sie zwei seitliche Schnitte zum Kleinhirn unterlegen durch kleine chirurgische Schere in das Foramen magnum eingefügt wird. Machen Sie einen zusätzlichen Schnitt zwischen den Augen, Ameiseerior zu den Riechkolben.
   3. Sie vorsichtig jede Hälfte des Schädels zurück. Entfernen Sie das gesamte Gehirn und in den 10 cm Petrischale mit kaltem PBS gefüllt.
6. Unter dem Lichtmikroskop Dissektion, entfernen Sie die Riechkolben und Kleinhirn mit feinen chirurgischen Pinzette.
7. Flip das Gehirn, so dass die Bauchseite unter dem Lichtmikroskop sichtbar ist.
8. Mit feinen gerade Zange führen eine stumpf durch geschlossene Zangenspitzen zwischen dem Kortex und Hypothalamus etwa 2/3 des Gehirns zu einer Tiefe platzieren. Sobald Zange vorhanden sind, lassen sich die Enden zu öffnen. Wiederholen Sie für die andere Halbkugel.
9. Necken die Rinde aus dem Hypothalamus und Mittelhirn Regionen.
10. Entfernen Sie den Hypothalamus, Thalamus und Mittelhirn durch das Mittelhirn an seiner hinteren Fläche halten und es in Richtung des vorderen Endes des Gehirns Peeling. Sever die vorderen Verbindungen.
11. Entfernen Sie den Hippocampus von ihr nach außen läuten und dann Abtrennen seiner Verbindung mit derRinde mit feinen gebogen Dissektion Zange.
12. Reste des Striatum, indem sie es von der darunter liegenden Kortex nach außen Diagonale Bewegung mit feinen gebogen Dissektion Zange Verschrottung.
13. Löschen Sie alle Blutgefäße und Hirnhaut von der ventralen Oberfläche des Kortex.
14. Flip das Gehirn, so dass die Rückenfläche sichtbar ist. Hirnhäute und Blutgefäße sollte offensichtlich sein. Peel Hirnhaut von der darunter liegenden Kortex mit feinen Sezierung Zange. Starten Sie von der Riechkolben Befestigungsstelle Peeling.
15. Führen Sie die Schritte 2,4-2,14 für insgesamt 3-4 Rattenjungen.
16. Zeigen 3-4 seziert Rattenjungen Kortex in einem trockenen Petrischale und hacken mit einem sterilisierten Rasierklinge bis 1 mm x 1 mm Brocken erreicht werden. Sammeln Gewebe nach Spezialitäten mit PBS aus einem 50 ml konischen Röhrchen (Schritt 2) legen Sie dann wieder auf Eis zu spülen.

3. Die enzymatische und mechanische Gewebedissoziation

Hinweis: Bei diesem Schritt wird ein Papain basierten neuronalen Dissoziation Kit empfohlen. Mit Neural Dissoziation Kit (P), spezielle Schritte, die für OPC Isolierung optimal sind beschrieben.

1. Bereiten Sie die erste Dissoziation Enzym durch Enzym P mit dem geeigneten Puffer verdünnt. Der Inhalt jeder 50 ml konischen (1 Probe) wird mit insgesamt 1950 ul Enzymmischung suspendiert werden. Platz in der Enzymmischung in einem 37 ° C Bad für 10 min.
   Ein Beispiel: 1900 ul Puffer + 50 ul Enzym Papain
2. Spin alle 50 ml konische Röhrchen 3-4 gewürfelte Rattenjungen Kortex bei 300 g für 3 min enthält.
3. Saugen Sie den Überstand und fügen 1950 ul Enzymlösung in jedes Röhrchen Probe und brechen das Pellet auseinander, indem das Röhrchen invertiert und leichtes Schütteln.
4. Inkubieren in einem 37 ° C Brutschrank für 15 min unter kontinuierlichem Rohrdrehung.
5. Während der letzten 5 Minuten der Inkubation bereiten das zweite Enzym-Mix A. das Enzym in seiner geeigneten Puffer verdünnen. Insgesamt 30 & mgr; l hinzugefügt werdenzu je 50 ml konischen Probenröhrchen.
   1 Probe: 20 ul Puffer + 10 & mgr; l der Enzym
6. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist 30 ul des zweiten Enzyms Mischung hinzufügen zu jedem Röhrchen und umkehren zu mischen.
7. Mit einem Glas Pasteur Pipette auf eine Pipette Controller angeschlossen, distanzieren mechanisch das Gewebe durch Pipettieren von 10 bis 15 Mal oder bis die Gewebestücke in der Größe reduziert, und die Lösung ist trüb. Bringen Sie die Probe auf die 37 ° C Gewebekultur-Inkubator für 15 min mit kontinuierlicher Rotation.
8. Pipette jedem Gewebehomogenat Probe 10-15 mal eine 1 ml Pipette.
9. Pipette jedem Gewebehomogenat Probe 15-20 mal mit einem 200 ul Pipette
10. Gibt alle Proben an das 37 ° C Gewebekultur-Inkubator für 10 min mit kontinuierlicher Rotation.
11. 10 ml PBS (mit Ca ^{2+ und Mg 2+)} zu jeder Probe und Filtern des Homogenats durch ein 40 & mgr; m Porenfilter gelegt über einen 50 ml Rohr. Spülen Sie den Filter mit zusätzlichen 1-2 ml PBS.
12. Pool alle der Homogenat Proben in einem 50 ml konischen Röhrchen und erwerben eine Gesamtzellzahl.
13. die Zellzahl nach der Durchführung, spaltete gleichmäßig des Homogenats in 15 ml konische Röhrchen (1 Röhrchen für jede Probe). Zentrifuge für 10 bis 12 Minuten bei 300 x g.

4. Anti-A2B5 Raupenauftrag, Säule Reinigung und Beschichtung

1. Durchführen von Berechnungen für Säulenpuffer und anti A2B5 Mikrokügelchen. ADD 7 ​​ul Säulenpuffer pro 1 x ^{10 6 Zellen.} Hinzufügen 2 & mgr; l Anti-A2B5 Mikroperlen pro 1 x ^{10 6 Zellen.}
2. Kombinieren all der Proben durch Resuspendieren der Zellen in einem Gesamtvolumen von 10 ml Säulenpuffer und Zentrifugieren bei 300 × g für 10-12 min.
3. Resuspendieren des Zellpellets in der entsprechenden Menge an Säulenpuffer als 4.1 in Schritt berechnet. Wenn das Pellet groß und locker ist, fügen Sie nur etwa die Hälfte des Volumens der Säulenpuffer des Anti zu haltenKörper in der geeigneten Konzentration in der Zelle Resuspension.
4. Inkubieren der Zellsuspension für 10 min bei 4 ° C.
5. Hinzufügen anti-A2B5 Microbeads (berechnet in Schritt 4.1), mehrfach invertiert und für 30-60 min bei 4 ° C inkubieren. Vorsichtig wird das Röhrchen alle 10 Minuten mehrmals. Längere Inkubationszeiten können Zellausbeuten erhöhen, sondern kann eine unspezifische Bindung zu erhöhen.
6. Hinzufügen 5 Volumina Säulenpuffer. Wenn die Zellen in einem Volumen von 1 ml resuspendiert, 5 ml Säulenpuffer, während, wenn die Zellen in 2 ml resuspendiert, mit 10 ml Säulenpuffer hinzuzufügen.
7. Zentrifuge für 10 min bei 300 x g.
8. Ermitteln Sie, wie viele LS Spalten werden für die Reinigung erforderlich sein. Ein LS-Säule reicht für 15-20 x 10 ⁶ Zellen insgesamt.
9. das Zellpellet in 1000 ul Säulenpuffer pro LS Säule resuspendieren verwendet wird.
10. Prime jeweils LS Säule durch Zugabe von 5 ml des Säulenpuffers. Sammeln des Durchflusses durch in einem 50 ml konischen Röhrchen. Nachdem die Säule buffer vollständig durch die obere Kammer geleitet, zu jeder Spalte 1000 ul der Zellsuspension auf und lassen die Zellen durch die Schwerkraft zu durchlaufen.
    Hinweis: Wenn die Dichte der Zellen zu hoch ist, kann die Säule langsam laufen.
11. Unmittelbar nach der Zellsuspension durch die Säule passiert hat, langsam mit 3 ml Säulenpuffer zu jeder Spalte die ungebundenen Zellen zu waschen. Wenn die Wasch leicht durch die Säule (1 Tropfen für alle 30-45 sec) laufen, wäscht noch zweimal mit 3 ml Säulenpuffer.
12. Entfernen Sie jede Spalte und legen Sie es auf einem 15 ml konischen Röhrchen. 5 ml Säulenpuffer eintauchen und den Puffer durch die Säule bei einer hohen Geschwindigkeit das Kunststoff Kolben verwenden, die mit der Säule gepackt ist. Eintauchen werden die gebundenen Zellen verdrängen sie aus der Säule freigibt.
13. Erhöhen Reinheit durch die Probe durch eine zweite Runde der LS Spalten läuft. Verwenden ein Drittel der Anzahl der Spalten während des ersten Durchgangs verwendet. Prime die Säulen mit 5 ml des Säulenpuffers.Lassen Sie den Säulenpuffer durch die obere Kammer zu übergeben.
14. Da das Volumen der Zellsuspension viel größer sein wird, gleichmäßig auftragen 1.000 ul zu jeder Spalte Zellsuspension und ermöglichen die Suspension durch die obere Kammer der Säule zu passieren, bevor mit weiteren 1000 ul aufzufüllen.
15. Nachdem die Zellsuspension in die zweite Runde der Spalten vollständig angewendet wurde, waschen 2-3 mal mit 3 ml Säulenpuffer.
16. Entfernen Sie jede Spalte und legen Sie es über einem sterilen 15 ml konischen Röhrchen. 5 ml Säulenpuffer und tauchen den Puffer, der die Kunststoff Kolben verwenden, die mit der Säule gepackt ist. Eintauchen werden die gebundenen Zellen verdrängen sie aus der Säule freigibt.
17. Zentrifugieren der Zellsuspension bei 300 g für 12 bis 15 min. Das Pellet sollte kompakt erscheinen.
18. Zellpellet in 5-10 ml vorgewärmtes OPC Proliferationsmedien (OPC Basis ergänzten Medium mit PDGF-AA 20 ng / ml).
19. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer.
20. Platte der Zellen. Verdünne die Zellen zu 60.000 Zellen / ml mit OPC Proliferationsmedien. In jedes schwarz, klarer Boden mit 24 Vertiefungen, Pipette 500 ul Zellen entlang der Seite der gut 30.000 Zellen pro Vertiefung zu erhalten. Mischen Sie die Zellen durch Schütteln der Platte horizontal mit einer Acht Bewegung. Wenn dem Test in 48, 96, oder 384-Well-Platten, fügen 15.000, 7.500 oder 1.500 Zellen pro Vertiefung auf. Diese Zahlen können je nach individuellen Plattenspezifikationen angepasst werden.
21. Bereiten Sie eine separate Platte für den Tag 0 Baseline-Kontrollkulturen. Diese Steuerplatte sollte wie in Abschnitt 5.7 beschrieben, mit 4% Paraformaldehyd fixiert werden, wenn die Differenzierung am Tag 0 begonnen wird.
22. Kultur die Zellen in OPC-Proliferation Medien bei 37 ° C für 3 Tage ohne Medienwechsel.

5. Induktion von OPC-Differenzierung und Fixierung mit 4% Paraformaldehyd

Hinweis: Wenn die Wirkung von kleinen Molekülen auf oligodendrogenesis Testen, wir routinemäßig dissolve Medikamente in Dimethylsulfoxid (DMSO) 1,000x Bestände herzustellen, die dann bei -80 ° C gelagert werden kann und direkt in SATO Medien verdünnt, um eine Endkonzentration von 0,1% DMSO zu erhalten. Wir haben beobachtet, keine Veränderungen in entweder OPC Proliferation oder Differenzierung mit dieser DMSO-Konzentration (Daten nicht gezeigt).

1. Pre-warmen OPC Basis Medien bis 37 ° C und medikamentöse Behandlung Bestände auf Raumtemperatur auftauen. Bei Behandlungen in doppelter Ausführung durchführt, bereiten ungefähr 1,25 ml Medium pro Behandlungsgruppe in einem 1,5-ml-Tube. Für Dreifachproben, verwenden 2 ml Fassungsvermögen Zentrifugenröhrchen für schlaff zu berücksichtigen.
2. Bereiten Sie die Behandlung Master Mixes für replizieren Brunnen durch Behandlung Verdünnen Aktien direkt in OPC-Basismedien. Kurz Wirbel oder sanft jeden Mastermix mischen homogene Verteilung der Behandlung zu gewährleisten.
3. Vorbereitung 45 nM Triiodthyronin _{(T 3)} als positive Kontrolle und die betreffende Fahrzeug als negative Kontrolle. Verdünnen 10 mm T ₃ Lager1: 1000 in 1 ml OPC Basis Medien und dann weiter verdünnen bei der Behandlung Mastermix die endgültige Konzentration von DMSO gegebenenfalls zu reduzieren.
4. Saugen das Medium aus dem Kulturvertiefungen einer Behandlungsgruppe zu einer Zeit, so dass das Trocknen der Zellen zu vermeiden. Verwenden Sie ein 200 ul Pipettenspitze am Ende des Glaspasteurpipette zu vermeiden schwarz Material von den Seiten des Bohrlochs Abkratzen und in der Kultur.
5. Langsam 500 ul Behandlung Mastermix an der Seite des Brunnens einer 1 ml Pipette.
6. Inkubation der Kulturen für den gewünschten Zeitrahmen, einen vollständigen Medienaustausch mit frischem Behandlungsmedien alle 2-3 Tage durchführen. Wir routinemäßig eine 30-40% MBP ⁺ Kultur nach 4 Tagen in Differenzierung Medien beobachten.
7. Am Ende des Behandlungszeitraums gewünscht, bereiten frisch 4% Paraformaldehyd (PFA) oder eine gefrorene Lager auf Raumtemperatur auftauen. ACHTUNG: PFA ist extrem giftig und muss in einem Abzug hergestellt werden.
8. Saugen Sie die Medien und langsam mit 4001; l von PFA auf der Seite der gut um die Zellen zu fixieren. Inkubiere die Platte für 20 min bei Raumtemperatur.
9. Absaugen PFA und füge langsam 500 ul sterilem D-PBS (mit Ca ^{2+ und Mg 2+)} zur Seite der Vertiefung, die Zellen zu waschen. Wiederholen Sie den Wasch insgesamt zwei weitere Male. Sie nicht die letzte Waschanzusaugen.
10. Wickeln Sie die Platte in Parafilm und lagern bei 4 ° C für die spätere Verarbeitung oder gehen Sie direkt zum nächsten Schritt. Platten können für mehrere Wochen gelagert werden.

6. Immuncytochemie und Quantifizierung von Myelin Basic Protein

Hinweis: Wenn Sie in den 24-Well-Platten Liquid-Handling-Verfahren durchgeführt wird, ist es empfehlenswert, schnell zu arbeiten, um zu vermeiden, dass die Zellen zu trocknen. Hierbei ist die Verwendung einer Mehrkanal-Vakuumstrahlpumpe und Mehrkanal-Pipette werden empfohlen.

1. Bringen Sie die Platte auf Raumtemperatur, saugen Sie den Brunnen, und fügen 250 ul D-PBS (mit Ca ^{2+ und Mg 2+),} die 0,1% Triton X-100 und 5%normalem Ziegenserum (NGS). Die Platte bei Raumtemperatur für 1 Stunde unter leichtem Schütteln Orbital.
2. Bereiten Sie die Primär Inkubationslösung durch Verdünnen von monoklonalen Maus-anti-MBP-Antikörper 1: 1000 und polyklonalen Kaninchen-anti-Actin-Antikörper 1: 200 in D-PBS (mit Ca ^{2+ und Mg 2+),} das 5% NGS. Alternativ polyklonalen Kaninchen-Anti-Olig2 bei 1: 1000 kann für Oligodendrozyten spezifisch Normalisierung in gemischten Glia-Kulturen verwendet werden. Bereiten Sie genügend primäre Lösung 250 ul pro Vertiefung unterzubringen.
3. Inkubieren primären Antikörpern bei 4 ° C über Nacht für 16-18 Stunden unter leichtem Schütteln Orbital.
4. Saugen Sie das primäre Inkubation Lösung und waschen Sie die Zellen 3 x 10 min mit 500 ul D-PBS (mit Ca ^{2+ und Mg 2+)} bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln Orbital.
5. Während dem Waschen der Platte, bereiten die sekundäre Inkubation Lösung durch Verdünnung anti-Maus 680 und Anti-Kaninchen-800 Antikörper 1: 500 in D-PBS (mit ^{Ca 2+} und ^{Mg 2+),} das 5% NGS. Minimieren Umgebungslicht, wenn diese Lösung vor.
6. Saugen Sie das letzte Wäsche und fügen 250 ul sekundären Inkubation Lösung. Schützen Sie die Platte aus Licht und Inkubation für 1 Stunde unter leichtem Schütteln Orbital bei Raumtemperatur.
7. Saugen Sie das sekundäre Inkubation Lösung und waschen Sie die Wells 3 x 10 min mit 500 ul D-PBS (mit Ca ^{2+ und Mg 2+)} bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln Orbital.
8. Scannen der Platte ein Abbildungssystem zum Aufspüren von 700 nm und 800 nm Fluoreszenzemissionen. Als Ausgangspunkt, setzen Sie den Schwerpunkt auf 1,5 bis 3 und Empfindlichkeiten Offset für MBP, 5,0 für Actin, und 3,5 für Olig2. Passen Sie die Empfindlichkeitswerte bei Bedarf Signalüberbelichtung zu vermeiden.
9. Quantifizieren das Ausmaß der oligodendrogenesis mit semi-automatische Software-basierten Methoden.
   1. Mit der Software, stellen Sie die Platte Analyse-Modus auf "24 Well" und richten Kreise um ter äußeren Umfang der gescannten Brunnen. Stellen Sie die Normalisierung Kanal auf "800" und exportieren Sie die Gesamtzahl und Fluoreszenzintensitäten für die 700 nm (MBP) und 800 nm (Olig2 / Actin) Kanäle.
   2. Teilen die Intensität bei 700 nm durch die Intensität bei 800 nm die normalisierte MBP-Expression in relativen Fluoreszenzeinheiten zu geben. Berechnen Sie den Durchschnitt von Wiederholungsmessungen und skaliert den Ausdruck auf den Tag 0 + PDGF Kontrollen wie für die Analyse benötigt wird.

Ergebnisse

A2B5-positiven OPCs werden durch positiven Zellselektion isoliert eine magnetische Trennsäule System. Vor dem Isolierungsverfahren wird das gesamte Gehirn von Rattenjungen entfernt, die zwischen P5 und P7 sind. Sobald das gesamte Gehirn erfolgreich vom Schädel gelöst wird, werden die Riechkolben und Kleinhirn unter Verwendung von feinen chirurgischen Pinzette (1A) entfernt. Um sich durch sorgfältige Dissektion (1B) ausgeschnitten Gehirnrindengewebe d...

Diskussion

Das Protokoll hier vorgestellte beschreibt ein schnelles und zuverlässiges Verfahren zur Isolierung von Ratten-OPCs und in vitro oligodendrogenesis in Reaktion auf experimentelle Faktoren zu quantifizieren. Mit positiven Selektion, hohe Ausbeuten an lebensfähig und rein OPCs werden direkt zu Versuchszwecken verwendet. Dieses Verfahren vereinfacht die Isolierung, Kultivierung und Differenzierung Schritte in 1-wöchige Zeitrahmen und fixierten Zellen können bequem bei 4 ° C über mehrere Wochen ohne Verlust a...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection Materials
PBS without Ca2+ and Mg2+	Mediatech	21-040-CV	1x
10 cm Polystyrene Petri Dishes	Fisherbrand	0857512
Light Dissection Microscope	Motic	SM2-168
Dissociation Materials
Tube Rotator	Miltenyi Biotec	130-090-753	Dissociation Tube Rotator
Neural Tissue Dissociation Kit (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628	Enzymatic Dissociation Kit
PBS with Ca2+ and Mg2+	Corning	20-030-CV	1x
40 μm Cell Strainer	Corning	352340
A2B5 Column Purification
Anti-A2B5 Microbeads	Miltenyi Biotec	130-097-864	Bead Bound A2B5 Antibody
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	Magnetic Selection Columns
EDTA	Corning	46-034-Cl	2 mM
PBS with Ca2+ and Mg2+	Corning	20-030-CV	1x
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9647	0.50%
Culture Materials
PDGF-AA	PeproTech Inc	100-13A	20 ng/ml
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650	Hybri-Max 100 ml
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T6397	45 nM
Clemastine fumarate salt	Sigma-Aldrich	SML0445-100MG	1 μM
Quetiapine hemifumarate salt	Sigma-Aldrich	Q3638-10MG	1 μM
N-acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165	5 μg/ml
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783	60 ng/ml
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P1524	10 μg/ml
Putrecine	Sigma-Aldrich	P7505	16 μg/ml
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S5261	40 ng/ml
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0135	50 ng/ml
d-Biotin	Sigma-Aldrich	B4639	10 ng/ml
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634	5 μg/ml
Apo-Transferrin	Sigma-Aldrich	T1147	100 μg/ml
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4161	100 μg/ml
Trace Elements B	Corning	25-022-Cl	1x
B-27 Supplement	Life Technologies	17504044	1x
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15140122	1x
DMEM	Life Technologies	11995-065	1x
24-well Black Visiplate with lid	Perkin Elmer	1450-605	Tissue culture grade
Immunocytochemistry and Quantification
PFA	Sigma-Aldrich	100-13A	4%
Triton X-100	Sigma-Aldrich	78787	0.10%
Normal Goat Serum	Jackson Immuno Research	005-000-121	5%
mouse monoclonal anti-MBP	Biolegend	SMI-99P	1:1,000 Dilution
rabbit polyclonal anti-Actin	Santa Cruz Biotecnology	SC-7210	1:200 Dilution
rabbit polyclonal anti-Olig2	Millipore	AB9610	1:1,000 Dilution
goat anti-mouse 680RD	Licor	926-68070	1:500 Dilution
goat anti-rabbit 800CW	Licor	926-32211	1:500 Dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse	Life Technologies	A11032	1:1,000 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit	Life Technologies	A11008	1:1,000 dilution
Prolong Gold antifade with DAPI	Life Technologies	P36931
DPBS with Ca2+ and Mg2+	Corning	21-030-CV
Licor Odyssey Clx Infared Imaging System	Licor