تقنية لاستهداف حقن مكروي إلى البلدان النامية<em&gt; القيطم</em&gt; الكلى

Summary

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Abstract

الكلى الجنينية من القيطم المورق (ضفدع)، وسليفة الكلوة، يتكون من كليون واحد، ويمكن استخدامها كنموذج لأمراض الكلى. الأجنة القيطم كبيرة، وتطوير خارجيا، ويمكن التلاعب بها بسهولة عن طريق حقن مكروي أو العمليات الجراحية. وبالإضافة إلى ذلك، تم إنشاء خرائط مصير لأجنة القيطم مبكرة. حقن مكروي المستهدفة في قسيم أرومي الفردية التي من شأنها أن تؤدي إلى عضو أو نسيج من الفائدة في نهاية المطاف يمكن استخدامها لبإفراط بشكل انتقائي أو هدم التعبير الجيني داخل هذه المنطقة المحظورة، والحد من الآثار الثانوية في بقية الجنين النامي. في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية الاستفادة من إنشاء خرائط مصير القيطم لاستهداف القيطم الكلى تطوير (وسليفة الكلوة)، من خلال حقن مكروي إلى قسيم أرومي معين من الأجنة 4- و8 خلايا. حقن استشفاف النسب يسمح بالتحقق من استهداف معين من الحقن.بعد الأجنة قد وضعت لمرحلة 38-40، كلها جبل المناعية يستخدم لتصور تنمية سليفة الكلوة، ومساهمة من قبل خلايا تستهدف سليفة الكلوة يمكن تقييمها. يمكن تكييفها نفس الأسلوب لاستهداف أنواع الأنسجة الأخرى بالإضافة إلى سليفة الكلوة.

Introduction

الكلى الجنينية القيطم، وسليفة الكلوة، هو نموذج جيد لدراسة تطور أمراض الكلى و. تكوين الجنين من الخارج، كبيرة الحجم، يمكن أن تنتج بأعداد كبيرة، والتلاعب بها بسهولة من خلال حقن مكروي أو العمليات الجراحية. وبالإضافة إلى ذلك، يتم حفظها الجينات التي تحكم تطور الكلى في الثدييات والبرمائيات. الكلى الثدييات التقدم من خلال ثلاث مراحل: سليفة الكلوة، mesonephros، والكلوة التالية ^1، في حين البرمائيات الجنينية لديها سليفة الكلوة والبرمائيات الكبار لديهم الكلوة التالية. وحدة التصفية الأساسية لهذه الأشكال الكلى هي كليون، وكل من الثدييات والبرمائيات تتطلب نفس شلالات الإشارات والأحداث الاستقرائية للخضوع لتكون الكلية ^{2 و 3.} وسليفة الكلوة القيطم يحتوي على كليون واحد يتألف من الداني والمتوسط ​​والبعيد، وربط الأنابيب، والكبة (مشابهة لالكبيبة الثدييات) ^{1 و4-6} (الشكل 1 ). في واحد، كبير كليون موجودة في سليفة الكلوة القيطم يجعلها مناسبة كنموذج بسيط لدراسة الجينات المسؤولة عن عمليات التنمية الكلى والأمراض.

وقد وضعت خرائط مصير خلية للأجنة القيطم في وقت مبكر، وتتوفر على الانترنت في Xenbase ^7-11 بحرية. هنا، نحن تصف تقنية ل microinjection من استشفاف النسب لاستهداف سليفة الكلوة القيطم النامية، على الرغم من أن نفس الأسلوب يمكن تكييفها لاستهداف الأنسجة الأخرى مثل القلب أو العينين. استشفاف النسب هي تسميات (بما في ذلك الأصباغ الحيوية، dextrans fluorescently المسمى، والانزيمات التي يمكن اكتشافها الكيميائيه النسيجيه، ومرنا ترميز البروتينات الفلورية) التي يمكن حقنها إلى قسيم أرومي في وقت مبكر، والسماح للتصور من سلالة تلك الخلية خلال التنمية. يستخدم هذا البروتوكول MEM-طلب تقديم العروض مرنا، غشاء ترميز استهدف الحمراء بروتين فلوري ^12، والتتبع النسب. التكنولوجيا حقن مكروي المستهدفةniques لعن Blastomeres الفردية في الأجنة 4- و8 خلايا وصفها هنا يمكن أن تستخدم للحقن مع morpholinos لاسقاط التعبير الجيني، أو مع RNA خارجي لبإفراط عن الجين من الفائدة. عن طريق حقن في بطني، قسيم أرومي النباتي، في المقام الأول سيتم استهدفت سليفة الكلوة من الجنين، وترك سليفة الكلوة المقابل كعنصر تحكم التنموية. شارك في حقن التتبع يتحقق من أن قسيم أرومي الصحيح تم حقن، والعروض التي أنسجة في الجنين نشأت من قسيم أرومي حقن، والتحقق من استهداف سليفة الكلوة. المناعية للسليفة الكلوة يسمح تصور مدى تم استهداف الأنابيب سليفة الكلوة. ويمكن بعد ذلك Overexpression وضربة قاضية الآثار أن سجل ضد الجانب المقابل للجنين، والتي هي بمثابة السيطرة التنموية، ويمكن استخدامها لحساب مؤشر سليفة الكلوة ^13. توافر خرائط مصير خلية يسمح هذا الأسلوب حقن مكروي المستهدفة لاستخدامها لاستهداف الأنسجة أوراسكوم تليكوم القابضةإيه من سليفة الكلوة، وشارك في حقن التتبع الفلورسنت يسمح للحقن مكروي الموجه إلى كل الأنسجة ليتم التحقق منها قبل التحليل.

خلال حقن مكروي الجنين، ينبغي تنظيم درجة حرارة التنموية بإحكام، بالنظر إلى أن معدل التنمية القيطم يعتمد اعتمادا كبيرا عليها ^14. يجب حضنت الأجنة في درجات الحرارة (14-16 درجة مئوية) لحقن 4- و8 خلايا وذلك لأن سرعة تطور الزمن إلى أسفل. في 22 درجة مئوية، والوقت اللازم لتطوير من المرحلة 1 (1 الخلية) إلى مرحلة 3 (4 خلايا) ما يقرب من 2 ساعة، بينما في 16 درجة مئوية وقت التطوير إلى مرحلة 3 ما يقرب من 4 ساعات. يستغرق حوالي 15 دقيقة من نهاية المباراة من جنين 4 خلايا إلى 8 خلايا (المرحلة 4) الجنين في 22 درجة مئوية، ولكن يستغرق حوالي 30 دقيقة في 16 درجة مئوية. وبالمثل، في 22 درجة مئوية، فإنه يأخذ فقط 30 دقيقة لجنين 8 خلايا للتقدم إلى جنين 16 خلية (المرحلة 5). ويزداد هذا الوقت إلى 45 دقيقة في 16 درجة مئوية. الrefore، من المفيد أن يتباطأ معدل نمو الأجنة لتمكين ما يكفي من الوقت لحقن في مرحلة 8 خلايا قبل التقدم الأجنة إلى مرحلة 16 خلية. بالإضافة إلى ذلك، ودرجات حرارة النمو يمكن أن يكون منظم لتسريع أو إبطاء التطور الجنيني حتى وضعت الكلى تماما.

البشرة من الشرغوف مرحلة الأجنة القيطم شفافة نسبيا، مما يسمح للتصوير السهل من سليفة الكلوة النامية دون تشريح أو إزالة الأنسجة ^15. نظرا لشفافية النسبية للأجنة القيطم، ويعيش التصوير الخلية هو أيضا من الممكن ^16،17. كامل جبل المناعية لتصور سليفة الكلوة من الممكن مع الأجسام المضادة ثبت أن تسمية القريبة والمتوسطة، القاصي وربط الأنابيب من مرحلة 38-40 الأجنة التي تسمح لتقييم التنمية سليفة الكلوة بعد استهداف التلاعب في التعبير الجيني في الأجنة القيطم ^18-20.

Protocol

تمت الموافقة على بروتوكول التالية من جامعة تكساس مركز العلوم الصحية في مركز هيوستن للالطب المخبري جنة الحيوان رعاية الحيوان، والتي هي بمثابة الرعاية المؤسسية واللجنة الاستخدام (بروتوكول #: شهادة الثانوية العامة الائتلاف المناهض للحرب-13-135).

1. تحديد واختيار عن Blastomeres لحقن المستهدفة الكلى

1. قبل توليد الأجنة، استخدم الجدول العادي من القيطم التنمية ²¹ لفهم التوجه للانقسامات الخلية الأولى في الجنين. بدلا من ذلك، الرسوم البيانية الوصول للمراحل النمو المبكرة من القيطم على Xenbase ^11.
2. الوصول إلى القيطم خرائط مصير خلية التفاعلية على Xenbase ¹¹ لتحديد أي قسيم أرومي ستستهدف ل microinjection.
3. نلاحظ أن الجنين خلية واحدة لديه القطب الحيواني المصطبغة بحزن والقطب النباتي، لونه أبيض وyolky. لاحظ أن الغشاء الواقي، والمعروفة باسم المحي هnvelope، ويغطي الجنين.
4. لاحظ أن الانقسام الأول يحدث عادة بين الجانبين الأيمن والأيسر من الجنين. هذه الخلايا تساهم بنفس القدر على النسب سليفة الكلوة.
5. لاحظ أن الانقسام الثاني يقسم ظهري وبطني نصفين من الجنين، مما يؤدي إلى الجنين 4 خلايا. الخلايا الظهرية هي أصغر حجما والصباغ أقل من الخلايا بطني (الشكل 2A) والشكل (3A).
   1. تحديد عن Blastomeres البطنية (V، وكبيرة، زنازين مظلمة) على الجانبين الأيسر والأيمن، والتي تساهم أكثر لنمو الكلية من الظهرية (D، صغيرة، وخلايا ضوئية) عن Blastomeres (الشكل 2A).
   2. إذا حقن في جنين 4 خلايا، وضخ قسيم أرومي البطني الأيسر لاستهداف الكلية اليسرى (الشكل 3A والقسم 3).
6. الشق الثالث يشطر الجانبين الحيوانية والنباتية، مما أدى إلى الجنين ثمانية الخلايا. في هذه المرحلة، وهناك أربعة عن Blastomeres الحيوان [اليسار واليمين بطني(V1) والظهرية (D1)] وأربعة عن Blastomeres النباتية [اليسار واليمين بطني (V2) والظهرية (D2)] (الشكل 2B والشكل 3B).
   1. تحديد موقع بطني، عن Blastomeres النباتية (V2). هذه عن Blastomeres أسهمت في الكلى تطوير أي خلايا أخرى في هذه المرحلة (الشكل 2B). لاستهداف الكلية اليسرى من جنين 8 خلايا، وضخ في V2 قسيم أرومي اليسار (الشكل 3B والقسم 3).
7. لاحظ أن الانشقاقات الرابعة والخامسة شطر عن Blastomeres الحيوانية والنباتية. يتم إنشاء اثنين من ذرية من كل قسيم أرومي، مما أدى إلى الجنين 16 خلية. تتم تسمية الخلايا بعد السلف. على سبيل المثال، وقسيم أرومي V2 من مرحلة 8 خلايا يثير V2.1 وآله V2.2 في المرحلة 16 خلية (الشكل 2C). الخلية V2.2 في المرحلة 16 خلية توفر غالبية الخلايا المساهمة في الكلى النامية.
8. ملاحظة الانشقاقات السادسة والسابعة تؤدي إلى امبري 32 خليةس. مرة أخرى، يتم إنشاء اثنين من ذرية من كل قسيم أرومي، التي تتم تسمية التالية سابقيهم. على سبيل المثال، وقسيم أرومي V2.2 من المرحلة 16 خلية يثير V2.2.1 وV2.2.2 في المرحلة 32 خلية. هناك نظام تسمية بديل في المرحلة 32-الخلية التي يتم تحديد الخلايا في الصفوف الأربعة كما A، B، C، و D (من الحيوان الى نباتية)، وأربعة أعمدة 1، 2، 3، 4 ( من ظهري إلى بطني). وهكذا، فإن قسيم أرومي V2.2.2، الأمر الذي يسهم في معظم لسليفة الكلوة النامية، ويسمى C3 في ظل هذا النظام تسمية بديل (الشكل 2D).

2. إعداد الأجنة

1. تجهيز 50 مل من Dejelly الحل (2٪ السيستين، هيدروكسيد الصوديوم لدرجة الحموضة 8.0).
2. عزل كل من الخصيتين من الضفادع الذكور واحد وفقا لبروتوكولات القياسية ^14. وضع الخصيتين في صحن 60 ملم بيتري مليئة 10 مل الخصية حل التخزين (1X مارك في التعديل قارعو الأجراس [MMR؛ 0.1 M كلوريد الصوديوم، 2 مم بوكل، 1 ملي MgSO _4، 2 ممCaCl _2، 5 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 8، 0.1 ملي EDTA] ^12، 1٪ زلال المصل البقري، 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين). تخزين الخصيتين عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: يمكن تخزين الخصية ما يقرب من 7-10 أيام في 4 درجات مئوية، ولكن كفاءة التسميد يقلل من أطول تم تخزينها في الخصيتين.
3. يسجل الضفدع الإناث للحصول على البيض وفقا لبروتوكولات القياسية ^14. جمع البيض في 100 مم طبق بيتري. تخلصي من أي المياه الزائدة.
4. قطع ¼ من الخصية أثناء وجوده في الخصية حل التخزين باستخدام ملقط وشفرة حلاقة. نقل قطعة من الخصية إلى طبق بتري تحتوي على البيض. ضبط حجم الجزء الخصية تستخدم لحساب لحجم الخصية، متى تم تخزين الخصية، وعدد البيض هي أن المخصبة. عموما استخدام ¼ إلى 1/3 من الخصية تشريح حديثا لتخصيب مخلب واحد من البيض.
5. وقطع جزء من الخصية إلى قطع صغيرة باستخدام ملقط وشفرة حلاقة. إضافة ما يكفي من MMR 0.3x+ 30 ملغ / مل الجنتاميسين على طبق بيتري لتغطية البيض. دوامة معدل وفيات الأمهات في صحن خلط.
6. انتظر حوالي 30 دقيقة للإخصاب لتأخذ مكان في درجة حرارة الغرفة. لاحظ أن نصف الكرة الحيوان (الجانب المصطبغة الجنين) سوف يجلس على رأس الجنين على الإخصاب فعال. ثم، إزالة معدل وفيات الأمهات من طبق بيتري باستخدام ماصة نقل. إضافة ما يكفي من الحل Dejelly إلى الطبق لتغطية الأجنة.
7. خلال الدقائق القليلة القادمة، دوامة بلطف الطبق بشكل متقطع. اهتزاز قوي للطبق في هذا الوقت يمكن أن يسبب تشوهات محور.   ومعطف هلام على الأجنة حل، وسوف الأجنة يتجمعون في وسط الطبق خلال دوامات. مرة واحدة الأجنة ولمس عن كثب بعضها البعض في وسط الطبق، وإزالة الحل Dejelly مع ماصة نقل. لا تترك الأجنة في حل Dejelly لفترة أطول من 5 دقائق، أو قد يكون معطوبا الأجنة.
8. غسل الأجنة dejellied 3-5 مرات في 0.3xMMR + 30 ملغ / مل الجنتاميسين بصب بعناية أو pipetting لمن معدل وفيات الأمهات وملء الطبق مع MMR جديدة. لا تقم بإزالة كل من معدل وفيات الأمهات من الطبق، أو قد يكون معطوبا الأجنة.
9. إزالة أي بويضة غير مخصبة أو قطعة من الخصية من طبق بيتري باستخدام ماصة نقل.
10. احتضان الأجنة بين 14 و 22 درجة مئوية.
    ملاحظة: الأجنة نمت في درجات حرارة منخفضة تتطور ببطء أكثر من الأجنة نمت عند ارتفاع درجات الحرارة. توقيت مراحل النمو يمكن الاطلاع على Xenbase ^22.
    1. إلى مساحة من تنميتها، وأبقى مكان نصف الأجنة من الإخصاب واحد في طبق بيتري في 14 درجة مئوية، والنصف الآخر من الأجنة في طبق بيتري أبقى عند 18 درجة مئوية. وهذا يسمح لمجموعتين من الحقن في 4 خلايا أو 8 خلايا الأجنة من الإخصاب واحد.

3. إعداد حلول حقن وMicroinjection من الأجنة

1. تحضير محلول الحقن التي تحتوي على 0.01نانوغرام / نيكولا لانغ بروتين بغشاء أحمر فلوري (MEM-RFP) مرنا ⁹ في حين أن الأجنة تتطور إلى مرحلة 4 خلايا أو 8 خلايا. تخزين حل الحقن على الجليد حتى جاهزة للحقن.
2. تحميل "الأنابيب الشعرية استبدال الزجاج في مجتذب إبرة، مع الجزء العلوي من الأنبوب استبدال تتماشى مع الجزء العلوي من حالة إبرة مجتذب. تعيين الحرارة # 2 القيمة إلى 800، وقيمة سحب إلى 650. اضغط على" 7 سحب "زر لسحب الإبرة. هذا سيخلق 2 الإبر من واحد 7" أنبوب زجاجي الشعرية.
3. قص قبالة غيض من إبرة سحب مع زوج من ملقط دومون.
   ملاحظة: بعد سحب الإبرة، وختم طرف مغلقة ويجب قطع مفتوحة. كلما اقتربنا من نقطة الإبرة التي قطع عليه، وأصغر من قطر ورأس الإبرة يكون. على الرغم من أن قطر طرف لن يؤثر على حجم الحقن مع نظام حقن مكروي المستخدمة هنا، وهي غيض التي يبلغ قطرها أكبر من المرجح أن تضر الجنين.
4. زلة مicropipette كوليت على الجزء الخلفي من الإبرة. المقبل، زلة كبيرة حفرة يا الدائري على الجزء الخلفي من الإبرة وراء كوليت.
5. شغل الإبرة مع الزيوت المعدنية يستخدم قياس 27 إبرة تحت الجلد، والحرص على عدم الحصول على فقاعات الهواء في الإبرة.
6. زلة الإبرة على المكبس من microinjector، جلوس الإبرة في ثقب كبير من هل بلاستيكية بيضاء مثبتة على المكبس. يجب أن يكون الغطاس صغيرة يا الدائري أقرب إلى الجسم من microinjector، يليه فاصل الأبيض، كبيرة حفرة يا الدائري، وكوليت. تأمين إبرة من خلال تشديد كوليت. برفق على الإبرة للتأكد من أن يتم تأمينها بشكل صحيح.
7. اضغط مع الاستمرار على زر "فارغة" في السيطرة على المربع microinjector حتى هناك نوعان من الأصوات.
8. ماصة 3 ميكرولتر من محلول الحقن على قطعة من بارافيلم. إدراج غيض من الإبرة في حبة من محلول الحقن على بارافيلم. اضغط مع الاستمرار على "ملء" الموجود على microiمربع التحكم njector لرسم حل حقن الإبرة.
9. ملء طبق 60 ملم بيتري اصطف مع 500 ميكرون البوليستر شبكة مع 5٪ Ficoll في 0.3x MMR + 30 ملغ / مل الجنتاميسين. ماصة بعناية 20-30 أبريل خلية أو 8 خلايا الأجنة في طبق.
10. باستخدام حلقة الشعر ^14، والتلاعب في الأجنة بحيث قسيم أرومي ليتم حقنه تواجه الإبرة. لاستهداف الكلية اليسرى، يصطف الأجنة بحيث عن Blastomeres بطني اليسرى من الأجنة 4 خلايا أو اليسار عن Blastomeres V2 الأجنة 8 خلايا تواجه الإبرة.
11. ضخ 10 NL حل الحقن في قسيم أرومي مختارة من كل جنين في الطبق.
    ملاحظة: شبكة في الجزء السفلي من طبق بيتري تستقر الأجنة وتمنعهم من المتداول، والسماح لهم ليتم حقنه دون استخدام حلقة الشعر لتحقيق الاستقرار.
12. نقل حقن الأجنة في آبار لوحة الثقافة التي تم شغلها مع 5٪ Ficoll في 0.3x MMR + 30 ملغ / مل الجنتاميسين. احتضان الجنين حقنالصورة في 16 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل للسماح للعن Blastomeres حقن للشفاء.
13. نقل الأجنة تلتئم في آبار لوحة الثقافة الجديدة التي تم شغلها مع 0.3x MMR + 30 ملغ / مل الجنتاميسين من المرحلة 9 (قبل تكون المعيدة).
14. احتضان الأجنة في 14-22 درجة مئوية حتى الأجنة تصل إلى مرحلة 38-40 ^21.

4. التثبيت والمناعية من الأجنة

1. تجهيز 50 مل من كبريتات اجتماعات الأطراف / EGTA / المغنيسيوم / الفورمالديهايد العازلة [MEMFA: 100 ملي اجتماعات الأطراف (7.4 درجة الحموضة)، 2 ملي EGTA، 1 ملي MgSO _4، 3.7٪ (ت / ت) الفورمالديهايد].
2. باستخدام ماصة نقل، ووضع 10-20 مرحلة 38-40 الأجنة في قارورة زجاجية. إضافة 10 ميكرولتر 5٪ بنزوكاين في الإيثانول بنسبة 100٪ إلى القارورة وقلب قارورة لخلط. انتظر 10 دقيقة لتخدير الأجنة.
3. إزالة معدل وفيات الأمهات من القارورة باستخدام ماصة الزجاج. إذا تجهيز قوارير متعددة في نفس الوقت، ويمكن عقد قارورة تستقيم في 24-جيدا لوحة الثقافة الخلية.
4. مع أنابيب زجاجيةتتي، وملء قارورة مع MEMFA. ضع القارورة على منصة هزاز ثلاثية الأبعاد لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
5. إزالة MEMFA من القارورة باستخدام ماصة الزجاج. ملء قارورة مع الميثانول بنسبة 100٪. ضع القارورة على منصة هزاز ثلاثية الأبعاد لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كرر هذه الخطوة غسل واحد مزيد من الوقت، وتخزين الأجنة في الميثانول بنسبة 100٪ بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية.
6. إعداد 1X الفوسفات مخزنة المالحة-الأبقار مصل الزلال-تريتون (PBT): برنامج تلفزيوني 1X، 2 ملغ / مل زلال المصل البقري، 0.1٪ تريتون X-100.
7. إعداد حل الأجسام المضادة الأولية ما يلي: 1X PBT مع 10٪ مصل الماعز مع 1: 5 التخفيف من وحيدة النسيلة الماوس 4A6 الأجسام المضادة (لتسمية أغشية المتوسطة، القاصي وربط الأنابيب ^20)، وتخفيف 1:30 من الماوس وحيدة النسيلة الأجسام المضادة 3G8 (لمعة تسمية الأنابيب القريبة ^20)، والتخفيف 1: 250 الأرنب بولكلونل طلب تقديم العروض الأجسام المضادة (لتسمية التتبع MEM-RFP). تخزينها في 4 درجات مئوية.
8. إعداد SECONDAحل راي الأجسام المضادة هي: 1X PBT مع 10٪ مصل الماعز، 1: 500 اليكسا 488 الماعز المضادة للماوس مفتش (تركيز الأوراق المالية 2 ملغ / مل؛ والتسمية 4A6 و3G8)، و 1: 500 اليكسا 555 الماعز المضادة للأرنب مفتش (الأسهم تركيز 2 ملغ / مل؛ لتسمية التتبع MEM-RFP). مخزن في 4 درجات مئوية، وتغطي أنبوب في احباط للحماية من الضوء.
9. بدلا من ذلك، وجمع الأجسام المضادة الأولية والثانوية بعد التلوين، وحفظ في 4 درجات مئوية لإعادة استخدامها في التجارب المستقبلية. إذا كانت الأجسام المضادة ليتم حفظها لإعادة استخدامها، إضافة 0.01٪ أزيد الصوديوم.
10. Immunostain الأجنة باستخدام البروتوكولات المعمول بها ^(18).

5. التصور من الأجنة وتحليل المستهدفة الأنسجة سليفة الكلوة

1. فحص الأجنة immunostained للتحقق من أن قسيم أرومي الصحيح تم حقن عن طريق عرض مضان من التتبع تحت مجهر تشريحي الفلورسنت في 1X (لمشاهدة الجنين كله) و5X (لعرض الكلى) التكبير. مكان الأجنة في لوحة من الزجاج متعددة بشكل جيد مع أنناقطع LLS مليئة 1X PBT باستخدام ماصة نقل مع بلاغ. معالجة الأجنة مع حلقة الشعر. استخدام الأجنة فقط التي لديها حقن شارك التتبع موجودة في سليفة الكلوة على الجانب الأيسر من الجنين (الشكل 3C، F والشكل 4C، F) ل overexpression الجينات أو تحليل ضربة قاضية.
2. بدلا من ذلك، قم بإلغاء تحديد الأجنة في مسح موراي (2 أجزاء بنزوات البنزيل: 1 جزء البنزيل الكحول) عن طريق وضع الأجنة في قارورة زجاجية وملء قارورة واضح مع موراي. تصور أجنة باستخدام لوحة الزجاج جيدا.
   ملاحظة: واضح موراي هو المذيبات العضوية، وينبغي التعامل معها بحذر. ارتداء قفازات، وإلا استخدام قوارير الزجاج والماصات واضح مع موراي.
3. تخزين الأجنة عند 4 درجات مئوية في 1X PBT ل2-3 أسابيع. للتخزين على المدى الطويل من الأجنة، يذوى الأجنة عن طريق غسل مرتين في الميثانول بنسبة 100٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. تخزين الأجنة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية في الميثانول بنسبة 100٪.

النتائج

إبر دقيقة جدا من 4- و8 خلايا الأجنة القيطم مع MEM-طلب تقديم العروض مرنا تظهر مستويات مختلفة من استهداف للسليفة الكلوة. ويبين الشكل 4 المرحلة 40 الأجنة مع MEM-طلب تقديم العروض أنماط التعبير مرنا الصحيحة. تم حقن الأجنة في قسيم أرومي البطني الأي...

Discussion

استهداف سليفة الكلوة تطوير الأجنة القيطم تعتمد على تحديد وحقن قسيم أرومي الصحيح. حقن قسيم أرومي V2 الأجنة 8 خلايا يستهدف سليفة الكلوة اليسرى ^(18). هذا يترك سليفة الكلوة اليمنى المقابل باعتبارها الرقابة الداخلية. إذا morpholino ضربة قاضية أو يستخدم overexpression RNA لتغيي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Fisher	S271-3
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Magnesium sulfate	Fisher	M63-500
Calcium chloride	Fisher	C79-500
HEPES	Fisher	BP310-500
EDTA	Fisher	S311-500
Gentamycin solution, 50 mg/ml	Amresco	E737-20ML
L-Cysteine, 99%+	Acros Organics	52-90-4
Ficoll	Fisher	BP525-100
100 mm x 15 mm Petri dish	Fisher	FB0875712
Mini Fridge II	Boekel	260009	Benchtop incubator for embryos.
Gap43-RFP plasmid			For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006.
Rhodamine dextran, 10,000 M.W.	Invitrogen	D1817	Tracer.
Molecular biology grade, USP sterile purified water	Corning	46-000-CI
7" Drummond replacement tubes	Drummond	3-000-203-G/XL	Microinjection needles.
Needle puller	Sutter Instruments	P-30
Fine forceps	Dumont	11252-30	For breaking microinjection needle tip.
Nanoject II	Drummond	3-000-204	Microinjector.
Mineral oil, heavy	Fisher	CAS 8042-47-5	Oil for needles.
27 G Monoject hypodermic needle	Covidien	8881200508	For loading mineral oil into microinjection needle.
5 ml Luer-Lok syringe	BD	309646	For loading mineral oil into microinjection needle.
60 mm x 15 mm Petri dish	Fisher	FB0875713A
800 micron Polyester mesh	Small Parts	CMY-0800-C
Transfer pipets	Fisher	13-711-7M	For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette.
6-well cell culture plate	Nest Biotechnology
MOPS	Fisher	BP308-500
EGTA	Acros Organics	67-42-5
Formaldehyde	Fisher	BP531-500
15 mm x 45 mm Screw thread vial	Fisher	03-339-25B	For fixing, staining, and storing embryos.
24-well cell Culture plate	Nest Biotechnology
Benzocaine	Spectrum	BE130
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Methanol	Fisher	A412-4
Phosphate buffered saline (PBS) 1x powder	Fisher	BP661-50
Bovine serum albumen	Fisher	BP1600-100
Triton X-100	Fisher	BP151-500
3D Mini rocker, model 135	Denville Scientific	57281
Goat serum, New Zealand origin	Invitrogen	16210064
Sodium azide	Fisher	S227I-25
Monoclonal 3G8 antibody	European Xenopus Resource Centre		Primary antibody to label proximal tubules.
Monoclonal 4A6 antibody	European Xenopus Resource Centre		Primary antibody to label intermediate, distal and connecting tubules.
anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit	MBL	PM005	Primary antibody to label Gap43-RFP tracer.
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG	Life Technologies	A11001	Secondary antibody to label kidney tubules.
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies	A21428	Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer.
9 Cavity spot plate	Corning	7220-85
Benzyl benzoate	Fisher	105862500	Optional - for clearing embryos
Benzyl alcohol	Fisher	A396-500	Optional - for clearing embryos