開発にターゲットマイクロインジェクションのテクニック<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;腎臓

要約

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

要約

アフリカツメガエル （カエル）の胚腎臓は、前腎は、単一ネフロンから構成されており、腎疾患のモデルとして使用することができる。 アフリカツメガエル胚は、外部開発、大型であり、かつ容易に微量注入または外科的処置によって操作することができます。また、運命のマップは初期のアフリカツメガエル胚のために確立されています。最終的に関心のある器官または組織に上昇を与える個々の割球への標的型マイクロインジェクションは、選択的胚の残りの二次的影響を減少させること、この制限領域内の遺伝子発現を過剰発現またはノックダウンするために使用することができます。このプロトコルでは、我々は4と8細胞胚の特定の割球へのマイクロインジェクションを介して、開発アフリカツメガエルの腎臓（前腎）を、標的とするために設立されたアフリカツメガエルの運命マップを利用する方法について説明します。系統トレーサーの注入は、注入の特異的標的の検証を可能にします。胚は38ステージに開発した後 - 40を、ホールマウント免疫染色は前腎の開発を可視化するために使用され、前腎への標的細胞による寄与を評価することができます。同技術は、前腎に加えて他の組織タイプを標的とするように適合させることができます。

概要

アフリカツメガエル胚腎臓、前腎は、腎臓の開発と疾患を研究するための優れたモデルです。胚は、外部開発サイズが大きく、大量に製造することができ、かつ容易に微量注入または外科的処置を介して操作されます。また、哺乳類や両生類における腎臓発生を支配する遺伝子が保存されています。胚両生類は前腎を持っており、大人の両生類は後腎を持っていながら、前腎、中腎、および後腎^1：哺乳類の腎臓は三つの段階を経て進行します。これらの腎臓形の基本フィルタリング部はネフロンで、両方の哺乳類や両生類は腎形成^2、3を受けるために、同じシグナル伝達カスケードおよび誘導のイベントを必要としている。 アフリカツメガエルの前腎は、近位の単ネフロン、中間遠位端との接続細管が含まれ、 （哺乳動物の糸球体に類似）とグロムス^1、4-6（ 図1 ）。 アフリカツメガエルの前腎に存在する単一の大きなネフロンは腎臓の開発と疾患過程に関与する遺伝子の研究のための単純なモデルとして、それが適しています。

細胞運命マップは初期のアフリカツメガエル胚のために設立され、Xenbase ^7-11オンラインで自由にご利用いただけますされています。同技術は、心臓や目などの他の組織を標的とするように適合させることができるが、ここでは、発展途上アフリカツメガエル前腎を対象とする系統のトレーサーのマイクロインジェクションのための技術が記載されています。リネージュトレーサーは、開発中にその細胞の子孫の可視化を可能にする、初期の割球に注入することができる（生体染色色素を含む、蛍光標識されたデキストラン、組織化学的に検出可能な酵素、およびmRNAは、蛍光タンパク質をコードする）ラベルです。このプロトコルは、系統のトレーサーとして膜対象と赤色蛍光タンパク質^12をコードする、MEM-RFPのmRNAを利用しています。対象となるマイクロインジェクション技術ここで説明した4および8細胞胚における個々の割球のためのniquesは、目的の遺伝子を過剰発現するように遺伝子発現、または外因性RNAとをノックダウンするモルフォリノの注射のために利用することができます。腹側、植物割球に注入することにより、主に胚の前腎が発育コントロールとして、対前腎を残して、標的にされるであろう。トレーサーの同時注射は正しい割球を注入し、胚における組織ショーは前腎のターゲティングを検証し、注入された割球から生じたかどうかを確認します。前腎の免疫染色は、前腎細管が標的にされているどれだけの可視化を可能にします。過剰発現およびノックダウン効果は、その後発達対照として胚の反対側に対してスコア付けすることができ、前腎指標^13を計算するために使用することができます。細胞運命マップの利用可能性は、この標的マイクロインジェクション技術はOTH組織を標的化するために使用されることを可能にしますえー前腎、および蛍光トレーサーの同時注射よりも、各組織を標的とするマイクロインジェクション分析する前に確認することができます。

胚のマイクロインジェクションの間に、発達の温度はアフリカツメガエルの開発の速度が¹⁴に大きく依存することを考えると、厳密に調節されるべきです。開発時間が遅くなるため、4および8細胞注射のために - （16°C 14）胚は低い温度でインキュベートされるべきです。 16で3ステージする°Cの開発時間は約4時間である22℃で、3（4細胞）ステージの段階1（1セル）から現像時間は、約2時間です。これは、22℃で8細胞（ステージ4）胚に4細胞期胚から行くのに約15分かかりますが、16℃で約30分かかります。同様に、22℃で、それだけで16細胞期胚（ステージ5）に進むに8細胞期胚のために30分かかります。この時間は、16℃で45分間に増加されます。ザrefore、胚、16細胞期に進行する前に8細胞期での注射のために十分な時間を可能にするために胚の発達の速度を遅くするのに有用です。腎臓が完全に発達するまでさらに、成長温度、速度または遅い胚発生を調節することができます。

オタマジャクシ期アフリカツメガエル胚の表皮は、郭清または組織¹⁵のクリアせずに開発する前腎の容易なイメージングを可能にする、比較的透明です。 アフリカツメガエル胚の相対的な透明度に、ライブセルイメージングはまた^、16,17実現可能です。前腎 ​​を可視化するために免疫染色ホールマウント近位にラベルを確立する抗体、ステージの中間、遠位端と接続する細管38で可能です- アフリカツメガエル胚^18-20における遺伝子発現の標的操作の後に前腎開発の評価を可能にする40の胚。

プロトコル

以下のプロトコルは、施設ケアと使用委員会（：HSC-AWC-13から135のプロトコル番号）として機能し、実験動物医学動物福祉委員会、のためのヒューストンのセンターでテキサス大学健康科学センターによって承認されています。

腎臓を標的とする注射用の1割球の同定および選択を

1. 胚を生成する前に、胚における初期の細胞分裂の方向性を理解するために、アフリカツメガエルの開発²¹の正常な表を使用しています。 Xenbase ¹¹上のアフリカツメガエルの初期の発達段階の代わりに、アクセス図。
2. マイクロインジェクションの対象とされる割球を選択するXenbase ¹¹上のインタラクティブアフリカツメガエル細胞運命のマップにアクセスします。
3. 単一細胞胚は暗く着色された動物極と白と卵黄のようなある植物極を、持っていることを確認します。なお、卵黄eとして知られている保護膜、nvelope、胚をカバーしています。
4. 最初の切断は、典型的には、胚の左側と右側との間で発生していることに注意してください。これらの細胞は、前腎系統に均等に寄与する。
5. 第二の切断は4細胞期胚につながる、胚の背側と腹側の半分を分割することに注意してください。背側細胞が小さく、腹側細胞（ 図2Aおよび図3A）未満の顔料を持っています。
   1. 左右に、背側よりも発展途上の腎臓に多くを貢献（D;小型、軽量細胞）割球（ 図2A）、腹側割球（大、ダーク細胞V）を特定します。
   2. 4細胞期胚に注入する場合は、左腎臓（ 図3Aおよび第3節）を標的とするために、左腹側割球を注入します。
6. 第三の開裂は、8細胞胚を生じ、動物および植物の側面を二等分します。この時点で、4動物割球[左右の腹があります（V1）と背側（D1）]と4植物腹左右の割球[（V2）と背側（D2）]（ 図2Bおよび図3B）。
   1. 腹、植物割球（V2）を見つけます。これらの割球は、この段階で、他の細胞（ 図2B）を開発し、腎臓に多くを貢献しています。 8細胞期胚の左腎臓を標的とするために、左V2の割球（ 図3B及び第3項）に注入。
7. 第四及び第五の切断は、動物や植物割球を二分することに注意してください。二つの子孫は16細胞期胚を生じ、各割球から生成されます。細胞は、その前身にちなんで命名されています。例えば、8細胞期からV2の割球は、16細胞期（ 図2C）でV2.1とV2.2の子孫を生じさせます。 16細胞期でのV2.2セルは、発展途上の腎臓に貢献する細胞の大部分を提供します。
8. （注）第六及び第七の切断は、32セルエンブリーになりますO。ここでも、2子孫は、その前身で、次の名前が付けられ、各割球から生成されています。例えば、16細胞期からV2.2の割球は、32細胞期でのV2.2.1およびV2.2.2を生じさせます。そこ細胞は（植物に動物から）A、B、C、およびDの4行で識別される32細胞期での代替的な命名システムであり、4列に1、2、3、及び4（AS背側から腹側へ）。このように、開発前腎に最も貢献V2.2.2の割球は、この代替ネーミングシステム（ 図2D）の下でC3と呼ばれています。

胚の作製

1. Dejelly液（pH 8.0から2パーセントシステイン、NaOHを）の50ミリリットルを準備します。
2. 標準的なプロトコル¹⁴に従って、単一の男性のカエルからの両方の精巣を分離します。 0.1MのNaCl、2 mMの塩化カリウム、1mMのMgSO ₄を、2 mMの、10ミリリットル精巣ストレージソリューション（1×マークの改変リンガー[MMRで満たされた60ミリメートルペトリ皿に精巣を配置CaCl _2、5mMのHEPES pH8の、0.1mMのEDTA] ^12、1％ウシ血清アルブミン、50μg/ mlのゲンタマイシン）。 4°Cで睾丸を保管してください。
   注： - 4℃で10日間が、受精率が長く精巣が格納されている減少する精巣は約7のために保存することができます。
3. 標準的なプロトコル¹⁴に従って卵を得るために、女性のカエルを絞ります。 100ミリメートルペトリ皿に卵を収集します。余分な水分をオフに注ぎます。
4. それは鉗子やカミソリの刃を使用して、精巣ストレージソリューションでありながら、精巣の1/4をカット。卵を含むペトリ皿に精巣の一部を転送します。精巣が格納されているどのくらいの精巣の大きさを考慮するために使用される精巣部分のサイズを調整し、どのように多くの卵を受精されるべきです。一般的に卵の一方のクラッチを肥やすためにたて解剖精巣の1/3に¼を使用しています。
5. 鉗子やカミソリの刃を使用して小片に精巣部分をカットします。十分な0.3XのMMRを追加します。卵をカバーするペトリ皿に+を30mg / mlのゲンタマイシン。ミックスする皿にMMRを旋回。
6. 受精は室温で行われるようにするために約30分を待ちます。動物半球（胚の着色された側）が有効受精時に胚の上に座ることに注意してください。そして、トランスファーピペットを用いて、ペトリ皿からMMRを削除します。胚をカバーするために皿に十分なDejellyソリューションを追加します。
7. 次の数分間にわたって、静かに断続的に料理を旋回。この時点で皿の激しく振盪は、軸の欠陥を引き起こす可能性があります。  胚上のゼリーコートが溶解し、そして胚が渦巻く中に皿の中央に集まるだろう。胚が密接に皿の中央で互いに接触されると、転送ピペットでDejellyソリューションを削除します。より長い5分間Dejellyソリューションで胚を放置しないでください、または胚が破損する恐れがあります。
8. 0.3Xで5回 - dejellied胚3を洗います慎重に注ぐまたはMMRオフピペッティングし、新しいMMRと皿を充填することによってMMRは、+ 30 mg / mlでのゲンタマイシン。皿からMMRのすべてを削除しないでください、または胚が破損する恐れがあります。
9. トランスファーピペットを用いて、ペトリ皿から任意の未受精卵や精巣の部分を削除します。
10. 14と22℃の間の胚を培養します。
    注：より低い温度で成長した胚は、より高い温度で成長した胚よりもゆっくりと開発しています。発達段階のタイミングはXenbase ²²で見つけることができます。
    1. その開発外空間に、ペトリ皿内の単一の受精から胚の場所の半分を14℃に維持し、ペトリ皿中の胚の他の半分を18℃に維持しました。これは、単一の受精から4細胞もしくは8細胞胚に注射二組のを可能にします。

注射液および胚のマイクロインジェクションの調製

1. 0.01を含む注射液を調製NG / NL膜結合型赤色蛍光タンパク質（MEM-RFP）のmRNA ⁹胚は4セルまたは8細胞期に開発されています。注射する準備が整うまで氷上で注射液を保管してください。
2. プル」800への熱＃2の値を設定します。針プラーケースの上部に揃え交換チューブの上部で、ニードルプラーに交換用ガラス毛細管、および650プレスへのプル値「7のロード「針を引っ張るためのボタン。これは、単一の7から2針を作成する「ガラス毛細管。
3. デュモンのピンセットで引っ張っ針の先端をチョキンと切ります。
   注意：針を引っ張った後、先端が閉じ封入されていると切り開かなければなりません。それが切断された針のポイントに近い、より小さな直径針の先端になります。先端の直径は、ここで使用されるマイクロインジェクションシステムとの注入量には影響しませんが、大径の先端は、胚を損傷する可能性が高いです。
4. メートルスリップ針の背面上にicropipetteコレット。次に、コレットの背後にある針の背面に大きな穴Oリングをスリップ。
5. 針で気泡を取得しないように注意しながら、27ゲージの皮下注射針を使用して、鉱物油と針を埋めます。
6. プランジ​​ャーにインストールされている白いプラスチック製スペーサーの大きな穴に針を座席、マイクロインジェクターのプランジャーの上に針をスリップ。プランジ​​ャは白いスペーサー、大きな穴Oリング、およびコレットに続くマイクロインジェクターの身体に最も近い小さなOリングを、持っている必要があります。コレットを締めて、針を固定します。それが適切に確保されていることを確認するために、針をゆっくりと引き出します。
7. 2ビープ音がなくなるまで長押しすると、マイクロインジェクターコントロールボックスの「空」のボタンを押し続けます。
8. パラフィルムの一部の上に注射液のピペット3μlの。パラフィルム上の注射液のビードに針の先端を挿入します。長押しすると、microiのボタンを「埋める」開催しますnjectorコントロールボックスは、針への注射液を描画します。
9. 500ミクロンのポリエステルミリグラム/ mlのゲンタマイシン30 + 0.3XのMMRで5％フィコールとメッシュの裏地付き60ミリメートルペトリ皿を埋めます。皿に30 4細胞もしくは8細胞期胚 - 慎重に20をピペット。
10. 髪のループ^14を使用して、割球が注入されるように胚を操作すると、針に直面しています。 4細胞胚または8細胞期胚の左側V2の割球の左腹側割球は、針を向くように、左腎臓を標的とするために、胚をラインアップ。
11. 皿中の各胚の選択割球に注射液の10 NLを注入します。
    注：ペトリ皿の底部にメッシュが胚を安定化し、それらを安定化するためのヘアループを使用せずに注入できるように、圧延するのを防止します。
12. 転送は、0.3XのMMR +を30mg / mlのゲンタマイシン、5％フィコールで満たされている培養プレートのウェルに胚を注入しました。注入された胚をインキュベート癒すために注入された割球を可能にするために、少なくとも1時間16℃で秒。
13. ステージ9（前原腸形成する）ことにより、0.3XのMMR + 30 mg / mlでのゲンタマイシンで満たされた新しい培養プレートのウェルに癒さ胚を移します。
14. 40 ²¹ -胚がステージ38に到達するまで22°C - 14で胚をインキュベートします。

4.固定および胚の免疫染色

1. MOPS / EGTA /硫酸マグネシウムを50mlを調製/ホルムアルデヒド緩衝液[MEMFA：100mMのMOPS（pH7.4）中、2mMのEGTA、1mMの_硫酸マグネシウム、3.7％（v / v）のホルムアルデヒド]。
2. ガラスバイアル中で40胚 - 20段38 - トランスファーピペットを使用して、10を置きます。混合するためにバイアルと反転バイアルに100％エタノールに10μlの5％のベンゾカインを追加します。胚を麻酔するために10分を待ちます。
3. ガラスピペットを用いて、バイアルからMMRを削除します。同時に複数のバイアルを処理する場合は、バイアルを24ウェル細胞培養プレート中で直立に保持することができます。
4. ガラス管とMEMFAでバイアルを埋めます。室温で1時間、3次元ロッキングプラットフォーム上でバイアルを置きます。
5. ガラスピペットを用いて、バイアルからMEMFAを削除します。 100％のメタノールでバイアルを記入してください。室温で10分間、三次元揺動プラットフォーム上でバイアルを置き。この洗浄ステップをもう一度繰り返し、-20℃で100％のメタノールで一晩胚を格納します。
6. 調製1×リン酸緩衝生理食塩水、ウシ血清アルブミン、トリトン（PBT）：1×PBS、2ミリグラム/ mlのウシ血清アルブミン、0.1％トリトンX-100。
7. 1と10％ヤギ血清と1×PBT：マウスモノクローナル4A6抗体の5希釈（、中間遠位及び連結細管²⁰の膜を標識する）、マウスモノクローナル抗体3G8の午前1時30希釈の一次抗体溶液を準備します（近位尿細管²⁰のラベルの内腔へ）、および1：ウサギポリクローナルRFP抗体の250希釈（MEM-RFPトレーサーを標識します）。 4℃で保存。
8. secondaを準備RY抗体溶液：10％ヤギ血清で1×PBT、1：500のAlexa 488ヤギ抗マウスIgG（ストック濃度を2mg / mlで標識4A6及び3G8）は、1：500のAlexa 555ヤギ抗ウサギIgG（ストック濃度2 mg / mlで、MEM-RFPトレーサーを標識します）。光から保護するためにホイルでチューブをカバーし、4℃で保管してください。
9. また、染色後の一次および二次抗体を収集し、今後の実験に再利用するために4℃で保存します。抗体は、再利用のために保存される場合、0.01％アジ化ナトリウムを加えます。
10. 確立されたプロトコル^18を使用して胚を免疫染色。

ターゲット前腎組織の胚および分析5.可視化

1. 正しい割球は、1Xでの蛍光実体顕微鏡下でトレーサーの蛍光を見ることにより、注入されたことを確認するために免疫染色した胚を選別（胚全体を表示する）と5X倍率（腎臓を表示します）。我々にマルチウェルガラスプレートに胚を置きますカットオフチップで転送ピペットを用いて1×PBTで満たさLLS。髪のループを持つ胚を操作します。遺伝子の過剰発現やノックダウン分析のための胚の左側に前腎に同時注入トレーサーの存在を持つ胚（ 図3C、Fおよび図4C、F）のみを使用してください。
2. ガラスバイアルに胚を配置し、マレーのクリアでバイアルを充填することによって：代わりに、マレーのクリア（1部のベンジルアルコール2部の安息香酸ベンジル）で胚をオフにします。ガラスウェルプレートを使用して胚を視覚化します。
   注：マレーのクリアは、有機溶媒であり、取り扱いに注意する必要があります。手袋を着用し、唯一のマレーのクリアでガラスバイアルとピペットを使用しています。
3. 3週間 - 2のための1X PBTで4℃で保存胚。胚の長期保存のために、室温で10分間、100％メタノールで2回洗浄することにより、胚を脱水します。 100％メタノール中で-20℃で胚を保管してください。

結果

MEM-RFP mRNAと4と8細胞アフリカツメガエル胚のマイクロインジェクションは、前腎への標的の異なるレベルを示す。図4に示すステージ正しいMEM-RFPのmRNAの発現パターンを有する40胚を図 。胚は、左の腹側割球（ 図4A）に注入し、MEM-RFPのmRNAの適切な発現パターンのために選別しました。近位にMEM-RFPを発現していることに加え?...

ディスカッション

アフリカツメガエル胚の開発の前腎を標的とすることは識別し、正しい割球を注入することに依存しています。 8細胞胚のV2の割球の注入は、左の前腎^18を対象^としています。これは、内部​​コントロールとして、反対側の右側前腎を残します。モルホリノは、ノックダウンまたはRNAの過剰発現は、腎臓の発達を変更するために使用されている場合、反対側の右側前?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Fisher	S271-3
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Magnesium sulfate	Fisher	M63-500
Calcium chloride	Fisher	C79-500
HEPES	Fisher	BP310-500
EDTA	Fisher	S311-500
Gentamycin solution, 50 mg/mL	Amresco	E737-20ML
L-Cysteine, 99%+	Acros Organics	52-90-4
Ficoll	Fisher	BP525-100
100 mm x 15 mm Petri dish	Fisher	FB0875712
Mini Fridge II	Boekel	260009	Benchtop incubator for embryos.
Gap43-RFP plasmid			For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006.
Rhodamine dextran, 10,000 M.W.	Invitrogen	D1817	Tracer.
Molecular biology grade, USP sterile purified water	Corning	46-000-CI
7" Drummond replacement tubes	Drummond	3-000-203-G/XL	Microinjection needles.
Needle puller	Sutter Instruments	P-30
Fine forceps	Dumont	11252-30	For breaking microinjection needle tip.
Nanoject II	Drummond	3-000-204	Microinjector.
Mineral oil, heavy	Fisher	CAS 8042-47-5	Oil for needles.
27G monoject hypodermic needle	Covidien	8881200508	For loading mineral oil into microinjection needle.
5 mL Luer-Lok syringe	BD	309646	For loading mineral oil into microinjection needle.
60 mm x 15 mm Petri dish	Fisher	FB0875713A
800 micron polyester mesh	Small Parts	CMY-0800-C
Transfer pipets	Fisher	13-711-7M	For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette.
6-well cell culture plate	Nest Biotechnology
MOPS	Fisher	BP308-500
EGTA	Acros Organics	67-42-5
Formaldehyde	Fisher	BP531-500
15 mm x 45 mm screw thread vial	Fisher	03-339-25B	For fixing, staining, and storing embryos.
24-well cell culture plate	Nest Biotechnology
Benzocaine	Spectrum	BE130
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Methanol	Fisher	A412-4
Phosphate buffered saline (PBS) 1X powder	Fisher	BP661-50
Bovine serum albumen	Fisher	BP1600-100
Triton X-100	Fisher	BP151-500
3D mini rocker, model 135	Denville Scientific	57281
Goat serum, New Zealand origin	Invitrogen	16210064
Sodium azide	Fisher	S227I-25
Monoclonal 3G8 antibody	European Xenopus Resource Centre		Primary antibody to label proximal tubules.
Monoclonal 4A6 antibody	European Xenopus Resource Centre		Primary antibody to label distal tubule and duct.
anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit	MBL	PM005	Primary antibody to label Gap43-RFP tracer.
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG	Life Technologies	A11001	Secondary antibody to label distal tubule and duct.
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies	A21428	Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer.
9 cavity spot plate	Corning	7220-85
Benzyl benzoate	Fisher	105862500	Optional - for clearing embryos
Benzyl alcohol	Fisher	A396-500	Optional - for clearing embryos