Technique à la cible microinjection du Developing<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

Résumé

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Résumé

Le rein embryonnaire de Xenopus laevis (grenouille), pronéphros, se compose d'un seul néphron, et peut être utilisé comme modèle pour les maladies rénales. Embryons de Xenopus sont grandes, à développer l' extérieur et peuvent facilement être manipulés par micro - injection ou des interventions chirurgicales. En outre, les cartes du destin ont été établis pour les premiers embryons de xénope. microinjection ciblée dans le blastomère individu qui finira par donner naissance à un organe ou d'un tissu d'intérêt peut être utilisé pour surexprimer sélectivement ou renverser l'expression des gènes dans cette région restreinte, ce qui diminue les effets secondaires dans le reste de l'embryon en développement. Dans ce protocole, nous décrivons comment utiliser des cartes de destin Xenopus établies pour cibler le rein en développement Xenopus (les pronéphros), par microinjection dans blastomère spécifique d'embryons 4 et 8 cellules. L'injection de traceurs de lignée permet de vérifier le ciblage spécifique de l'injection.Après les embryons se sont développés à l'étape 38 - 40, toute monture immunocoloration est utilisé pour visualiser le développement pronephrique, et la contribution des cellules ciblées aux pronéphros peut être évaluée. La même technique peut être adaptée pour cibler d'autres types de tissus, en plus des pronéphros.

Introduction

Le rein embryonnaire de Xenopus, les pronéphros, est un bon modèle pour étudier le développement du rein et de la maladie. Les embryons se développent à l'extérieur, sont de grande taille, peuvent être produites en grand nombre, et sont facilement manipulés par microinjection ou des interventions chirurgicales. En outre, les gènes qui régissent le développement du rein chez les mammifères et les amphibiens sont conservés. Reins de mammifères progresser à travers trois étapes: les pronéphros, mésonéphros et métanéphros ^1, tandis que les amphibiens embryonnaires ont un pronéphros et amphibiens adultes ont un métanéphros. L'unité de filtrage de base de ces formes de rein est le néphron, et les mammifères et les amphibiens nécessitent les mêmes cascades de signalisation et des événements inductifs à subir néphrogenèse ^{2, 3.} Le pronéphros Xenopus contient un seul néphron composé de proximal, intermédiaire, distale et reliant tubules, et un glomus (analogue au niveau du glomérule chez les mammifères) , ^{1, 4-6} (figure 1 ). Le seul grand néphrons présent dans les pronéphros Xenopus le rend approprié comme un modèle simple pour l'étude des gènes impliqués dans les processus de développement du rein et de la maladie.

Cartes Cell sort ont été établis pour les premiers embryons de xénope et sont librement disponibles en ligne à Xenbase ^7-11. Ici, nous décrivons une technique de micro - injection de traceurs de la lignée de cibler pronéphros Xenopus développement, bien que la même technique peut être adaptée pour cibler d' autres tissus tels que le cœur ou les yeux. traceurs sont des marqueurs de la lignée (y compris les colorants vitaux, les dextranes marqués par fluorescence, des enzymes détectables par voie histochimique et l'ARNm codant pour des protéines fluorescentes, etc.) qui peuvent être injectés dans un blastomère précoce, permettant la visualisation de la descendance de cette cellule au cours du développement. Ce protocole utilise MEM-RFP ARNm, membrane de codage cible rouge protéine fluorescente ^12, comme traceur de la lignée. La technologie de micro-injection cibléeniques pour blastomères individuels dans des embryons de 4 et 8 cellules décrites ici peuvent être utilisées pour l'injection avec morpholinos pour abattre l'expression des gènes, ou avec de l'ARN exogène pour surexprimer un gène d'intérêt. En injectant dans la ventrale, blastomère végétale, principalement les pronéphros de l'embryon seront ciblés, laissant les pronéphros controlatéral comme un contrôle de développement. Co-injection d'un traceur vérifie que le bon blastomère a été injecté, et montre quels tissus dans l'embryon est née de la blastomère injecté, en vérifiant le ciblage des pronéphros. Immunocoloration des pronéphros permet la visualisation de la façon dont les tubules pronephrique ont été ciblés. Surexpression et knockdown effets peuvent ensuite être marqué contre le côté opposé de l'embryon, qui sert de contrôle du développement, et peuvent être utilisés pour calculer l'indice pronephrique ^13. La disponibilité des cartes du destin cellulaire permet cette technique de micro-injection ciblée pour être utilisée pour cibler les tissus OTHer que les pronéphros, et co-injection d'un traceur fluorescent permet de microinjection ciblée pour chaque tissu à vérifier avant l'analyse.

Pendant embryon microinjection, la température de développement doit être réglementé étroitement, étant donné que le taux de développement de Xenopus est très dépendante sur elle ^14. Les embryons doivent être incubés à des températures plus fraîches (14 - 16 ° C) pour les injections 4 et 8 cellules parce que le temps de développement est ralenti. A 22 ° C, le temps de développement de l'étape 1 (1 cellule) à l'étape 3 (4 cellules) est d'environ 2 heures, tandis que à 16 ° C le temps de développement à l'étape 3 est d'environ 4 heures. Il faut environ 15 minutes pour aller d'un embryon 4 cellules à une 8 cellules (stade 4) embryon à 22 ° C, mais il faut environ 30 minutes à 16 ° C. De même, à 22 ° C, il ne prend que 30 minutes pour un embryon de 8 cellules de progresser à un embryon de 16 cellules (étape 5). Ce temps est augmenté à 45 minutes à 16 ° C. lerefore, il est utile de ralentir le rythme des embryons de développement pour permettre assez de temps pour les injections au stade 8 cellules avant que les embryons progressent au stade 16 cellules. En outre, des températures de croissance peuvent être modulées pour accélérer ou ralentir le développement embryonnaire jusqu'à ce que le rein a pleinement développé.

L'épiderme des embryons de xénope têtard stade est relativement transparent, permettant une imagerie facile des pronéphros en développement sans dissection ou de compensation du tissu ^15. En raison de la relative transparence des embryons de xénope, imagerie des cellules vivantes est également possible ^16,17. Whole monture immunocoloration pour visualiser les pronéphros est possible avec des anticorps établis qui étiquettent proximale, intermédiaire, distale et tubules de connexion de l' étape 38 - 40 embryons qui permettent d'évaluer le développement pronephrique après manipulation de l' expression du gène ciblé dans les embryons de xénope ^18-20.

Protocole

Le protocole suivant a été approuvé par l'Université du Texas Health Science Center au centre de Houston pour des animaux de laboratoire Comité de médecine bien-être animal, qui sert de soins en établissement et l'utilisation Comité (protocole #: HSC-AWC-13-135).

1. Identification et sélection des blastomères pour Injections de rein ciblées

1. Avant de générer des embryons, utiliser le tableau normal du Xenopus développement ²¹ pour comprendre l'orientation des divisions cellulaires précoces dans l'embryon. Sinon, l' accès des diagrammes des premiers stades de développement Xenopus sur Xenbase ^11.
2. Accédez aux Xenopus cartes interactives du destin cellulaire sur Xenbase ¹¹ pour sélectionner blastomère sera ciblée pour la microinjection.
3. Observez que l'embryon de cellule unique a un pôle animal sombre pigmentée et un pôle végétal, qui est blanc et yolky. A noter qu'une membrane de protection, connue sous le vitelline envelope, couvre l'embryon.
4. Notez que la première coupure se produit généralement entre les côtés gauche et droit de l'embryon. Ces cellules contribuent également à la lignée pronephrique.
5. Notez que le deuxième clivage sépare la partie dorsale et ventrale moitiés de l'embryon, conduisant à un embryon de quatre cellules. Les cellules dorsales sont plus petites et moins de pigment que les cellules ventrales (figure 2A et la figure 3A).
   1. Identifier les blastomères ventrales (V, les grandes cellules, sombres) sur les côtés gauche et droit, qui contribuent plus au rein en développement que la dorsale (D; petites cellules, lumière) blastomères (figure 2A).
   2. Si l' injection dans un embryon 4 cellules, injecter le blastomère ventral gauche pour cibler le rein gauche (figure 3A et la section 3).
6. Le troisième clivage bissecte les côtés animales et végétales, résultant en un embryon de huit cellules. À ce stade, il y a quatre blastomères animaux [gauche et à droite ventrale(V1) et dorsale (D1)] et quatre blastomères végétaux [gauche et à droite ventrale (V2) et dorsale (D2)] (figure 2B et la figure 3B).
   1. Localisez les, blastomères végétales ventrales (V2). Ces blastomères contribuent davantage au développement de rein toutes les autres cellules à ce stade (figure 2B). Pour cibler le rein gauche d'un embryon de 8 cellules, injecter dans le blastomère gauche V2 (figure 3B et la section 3).
7. Notez que les quatrième et cinquième clivage bissectrices des blastomères animales et végétales. Deux descendants sont générés à partir de chaque blastomère, résultant en un embryon de 16 cellules. Les cellules sont nommées d'après leur prédécesseur. Par exemple, le blastomère V2 à partir du stade de 8 cellules donne lieu à V2.1 , V2.2 et descendants au stade de 16 cellules (figure 2C). La cellule V2.2 au stade 16 cellules fournit la majorité des cellules qui contribuent à l'élaboration du rein.
8. Notez que les sixième et septième clivages se traduisent par une 32 cellule embryo. Encore une fois, deux descendants sont générés à partir de chaque blastomère, qui sont nommés suivant leur prédécesseur. Par exemple, le blastomère V2.2 à partir du stade 16 cellules donne lieu à V2.2.1 et V2.2.2 au stade 32 cellules. Il existe un système d'attribution de nom alternatif au stade 32 cellules dans lequel les cellules sont identifiées en quatre rangées A, B, C et D (de l'animal à végétale), et quatre colonnes 1, 2, 3 et 4 ( de dorsale ventrale). Ainsi, le blastomère V2.2.2, ce qui contribue le plus aux pronéphros en développement, est appelé C3 dans ce système de nommage alternatif (figure 2D).

2. Préparation d'embryons

1. Préparer 50 ml de solution Dejelly (2% de cystéine, NaOH à pH 8,0).
2. Isoler les deux testicules d'une seule grenouille mâle selon les protocoles standards ^14. Placez les testicules dans un plat de 60 mm de Pétri remplie avec 10 ml de solution de stockage Testicules (Modifié Ringers [MMR 1x Marc; 0,1 M de NaCl, 2 mM de KCl, 1 mM MgSO _4, 2 mMCaCl _2, 5 mM de HEPES à pH 8, EDTA 0,1 mM] ^12, 1% d' albumine de sérum bovin, 50 ug / ml de gentamycine). Conserver les testicules à 4 ° C.
   Remarque: Testicules peut être stocké pendant environ 7-10 jours à 4 ° C, mais l'efficacité de la fertilisation diminuera plus les testicules ont été stockés.
3. Déposer une grenouille femelle pour obtenir des oeufs selon des protocoles standard ^14. Ramassez les oeufs dans une boîte de Pétri de 100 mm. Verser tout excès d'eau.
4. Couper ¼ de testis alors qu'il est dans une solution de stockage à l'aide de pinces et Testicules une lame de rasoir. Transférer le morceau de testis à la boîte de Petri contenant des œufs. Ajuster la taille de la partie testiculaire utilisée pour tenir compte de la taille des testicules, combien de temps le testicule a été stocké, et combien d'oeufs doivent être fécondé. Généralement utiliser ¼ à 1/3 d'un testicule fraîchement disséqués pour fertiliser un embrayage d'œufs.
5. Couper la partie testiculaire en petits morceaux à l'aide de pinces et d'une lame de rasoir. Ajouter suffisamment 0.3x MMR+ 30 mg / ml de gentamicine à la boîte de Pétri pour couvrir les oeufs. Agiter le MMR dans le plat pour mélanger.
6. Attendez environ 30 minutes pour la fécondation ait lieu à la température ambiante. Notez que l'hémisphère animal (le côté pigmentée de l'embryon) sera assis sur le dessus de l'embryon après la fécondation efficace. Ensuite, retirez le MMR de la boîte de Pétri à l'aide d'une pipette de transfert. Ajouter la solution Dejelly assez pour le plat pour couvrir les embryons.
7. Au cours des prochaines minutes, agiter doucement le plat par intermittence. Une agitation vigoureuse du plat à ce moment peut causer des défauts d'axe.   La couche de gelée sur les embryons se dissoudra, et les embryons se rassemblent dans le centre du plat pendant tourbillonnant. Une fois que les embryons sont étroitement en contact entre eux dans le centre de l'assiette, retirer la solution Dejelly avec une pipette de transfert. Ne pas laisser les embryons dans la Solution Dejelly pendant plus de 5 minutes, ou les embryons peuvent être endommagés.
8. Laver les embryons dejellied 3 - 5 fois en 0.3xMMR + 30 mg / ml de gentamicine par le versant avec précaution ou pipetage hors du MMR et en remplissant le plat avec le nouveau vaccin ROR. Ne pas enlever tout le MMR de l'antenne, ou les embryons peuvent être endommagés.
9. Retirez tous les œufs non fécondés ou des morceaux de testis de la boîte de Pétri à l'aide d'une pipette de transfert.
10. Incuber embryons entre 14 et 22 ° C.
    Nota: Les embryons cultivés à des températures plus basses se développent plus lentement que les embryons cultivés à des températures plus élevées. Timing des stades de développement peuvent être trouvés sur Xenbase ^22.
    1. Pour l'espace sur leur développement, le lieu de la moitié des embryons provenant d'une seule fécondation dans une boîte de Pétri maintenue à 14 ° C, et l'autre moitié des embryons dans une boîte de Pétri maintenue à 18 ° C. Ceci permet d'avoir deux ensembles d'injections dans des embryons de cellules 4 ou 8 cellules à partir d'une seule fécondation.

3. Préparation des solutions d'injection et de micro-injection d'embryons

1. Préparer une solution injectable contenant 0,01ng / nl protéine liée à la membrane rouge fluorescent (MEM-RFP) ARNm ⁹ tandis que les embryons se développent au stade 4 cellules ou 8 cellules. Conserver la solution d'injection sur la glace jusqu'à ce que prêt à injecter.
2. Charger un "tube capillaire en verre de remplacement dans un extracteur d'aiguille, avec la partie supérieure du tube de remplacement aligné avec la partie supérieure du boîtier aiguille de traction. Réglez le # 2 valeur de la chaleur à 800, et la valeur de traction à 650. Appuyez sur la touche" 7 tirer "pour tirer l'aiguille. Cela va créer 2 aiguilles à partir d'un seul 7" tube capillaire en verre.
3. Couper la pointe d'une aiguille tirée avec une paire de pinces Dumont.
   Remarque: Après avoir tiré l'aiguille, la pointe est scellé fermé et doit être coupé ouvert. Le plus proche de la pointe de l'aiguille qu'il est coupé, plus le diamètre de la pointe de l'aiguille sera. Bien que le diamètre de la pointe ne sera pas affecter le volume d'injection avec le système de microinjection utilisé ici, une pointe avec un plus grand diamètre est plus susceptible d'endommager l'embryon.
4. Glissez le micropipette virole sur le dos de l'aiguille. Ensuite, glisser le grand joint torique de trou sur le dos de l'aiguille derrière le collet.
5. Remplissez l'aiguille avec de l'huile minérale à l'aide d'une aiguille hypodermique de calibre 27, en faisant attention de ne pas obtenir des bulles d'air dans l'aiguille.
6. Glissez l'aiguille sur le piston de la micro-injecteur, d'un coin de l'aiguille dans le grand trou du blanc entretoise en plastique installé sur le piston. Le plongeur doit avoir un petit joint torique le plus proche du corps du micro-injecteur, suivie par l'entretoise blanche, grand joint torique de trou, et virole. Fixer l'aiguille en serrant la pince. Tirez doucement sur l'aiguille pour vous assurer qu'il est correctement fixé.
7. Appuyez et maintenez enfoncé le bouton "vide" sur la boîte de contrôle de micro-injecteur jusqu'à ce qu'il ya deux bips.
8. Introduire à la pipette 3 pl de solution d'injection sur un morceau de parafilm. Insérer la pointe de l'aiguille dans le talon de la solution d'injection sur le Parafilm. Appuyez et maintenez enfoncé le bouton "remplir" sur le microiboîte njector de commande pour dessiner la solution d'injection dans l'aiguille.
9. Remplir une boîte de 60 mm de Pétri bordée de 500 microns maille polyester avec 5% Ficoll en 0.3x MMR + 30 mg / ml de gentamicine. Pipetter prudemment 20 - 30 4 cellules ou 8 cellules d'embryons dans le plat.
10. En utilisant une boucle de cheveux ^14, manipuler les embryons afin que le blastomère à injecter est tournée vers l'aiguille. Pour cibler le rein gauche, aligner les embryons de sorte que les blastomères ventrales gauche d'embryons 4 cellules ou blastomères V2 gauche des embryons à 8 cellules face à l'aiguille.
11. Injecter 10 nl de solution d'injection dans le blastomère choisi de chaque embryon dans le plat.
    Remarque: Le maillage au fond de la boîte de Petri stabilise les embryons et les empêche de rouler, en leur permettant d'être injectées sans l'utilisation d'une boucle de cheveux pour la stabilisation.
12. Transfert injecté embryons dans des puits d'une plaque de culture qui ont été remplis avec 5% de Ficoll en 0.3x MMR + 30 mg / ml de gentamicine. Incuber l'embryon injectés à 16 ° C pendant au moins une heure pour permettre aux blastomères injectés à guérir.
13. Transférer les embryons cicatrisées dans les puits d'une nouvelle plaque de culture qui ont été remplis de 0.3x MMR + 30 mg / ml de gentamicine par étape 9 (avant gastrulation).
14. Incuber les embryons à 14-22 ° C jusqu'à ce que les embryons atteignent stade 38 - 40 ^21.

4. Fixation et immunocoloration des Embryons

1. Préparer 50 ml de sulfate de MOPS / EGTA / magnésium / formaldéhyde tampon [MEMFA: 100 mM de MOPS (pH 7,4), 2 mM d' EGTA, 1 mM _MgSO4, 3,7% (v / v) de formaldéhyde].
2. En utilisant une pipette de transfert, mettre 10 - 20 étape 38 - 40 embryons dans un flacon en verre. Ajouter 10 pi 5% benzocaïne dans 100% d'éthanol dans le flacon et inverti flacon pour mélanger. Attendre 10 min pour anesthésier les embryons.
3. Retirer le RMM du flacon à l'aide d'une pipette en verre. Si le traitement de plusieurs flacons en même temps, les flacons peuvent être maintenus en position verticale dans une plaque de culture cellulaire de 24 puits.
4. Avec un tube de verreTTE, remplir le flacon avec MEMFA. Placer le flacon sur une plate-forme à bascule en trois dimensions pendant 1 heure à température ambiante.
5. Retirer la MEMFA du flacon à l'aide d'une pipette en verre. Remplissez le flacon avec 100% de méthanol. Placer le flacon sur une plate-forme à bascule en trois dimensions pendant 10 min à température ambiante. Répétez cette étape de lavage une fois de plus, et de stocker les embryons dans 100% de methanol pendant une nuit à -20 ° C.
6. Préparer 1x solution saline tamponnée au phosphate-sérum-albumine bovine-Triton (PBT): 1 x PBS, 2 mg / ml de sérum-albumine bovine, 0,1% de Triton X-100.
7. Préparer la solution d'anticorps primaire: 1x PBT avec 10% de sérum de chèvre à une dilution 1: 5 de l' anticorps monoclonal de souris 4A6 anticorps (pour marquer les membranes des tubules intermédiaires distale et de liaison ^20), une dilution à 01:30 d' un anticorps monoclonal de souris 3G8 (à la lumière de l' étiquette des tubules proximaux ^20), et une dilution 1: 250 d'anticorps polyclonal de lapin de RFP (pour étiqueter le traceur MEM-RFP). Conserver à 4 ° C.
8. Préparer le secondasolution d'anticorps de ry: 1x PBT avec du sérum de chèvre 10%, 1: 500 Alexa 488 chèvre anti-IgG de souris (concentration en stock 2 mg / ml, à l'étiquette 4A6 et 3G8), et 1: 500 Alexa 555 chèvre anti-IgG de lapin (stocks concentration de 2 mg / ml, pour marquer le traceur MEM-RFP). Conserver à 4 ° C, recouvrant le tube en aluminium pour protéger de la lumière.
9. Vous pouvez également recueillir les anticorps primaires et secondaires après coloration, et enregistrer à 4 ° C pour une réutilisation dans des expériences futures. Si l'anticorps doit être sauvegardé pour réutilisation, ajouter l'azide de sodium à 0,01%.
10. Immunocoloration les embryons en utilisant des protocoles établis ^18.

5. Visualisation des embryons et l'analyse des tissus ciblés pronephrique

1. Tamiser les embryons immunohistochimique pour vérifier que le bon blastomère a été injecté en affichant la fluorescence du traceur fluorescent sous un stéréomicroscope à 1X (pour voir l'embryon entier) et 5X (pour voir rein) grossissement. Placer les embryons dans une plaque de verre multi-bien avec le nouslls remplis 1x PBT à l'aide d'une pipette de transfert avec la pointe coupée. Manipuler les embryons avec une boucle de cheveux. Utiliser uniquement les embryons qui ont la co-injecté traceur présent dans le pronéphros sur le côté gauche de l'embryon (figure 3C, et la figure 4C F, F) pour une surexpression du gène ou de l' analyse knock - down.
2. Vous pouvez également effacer les embryons dans Murray Effacer (2 parties de benzoate de benzyle: 1 partie alcool benzylique) en plaçant les embryons dans un flacon en verre et remplir le flacon avec Murray Clear. Visualisez les embryons en utilisant une plaque de puits de verre.
   Remarque: Murray Clear est un solvant organique, et doit être manipulé avec précaution. Porter des gants, et utiliser uniquement des flacons en verre et pipettes avec Murray Clear.
3. embryons Conserver à 4 ° C dans 1x PBT pendant 2 - 3 semaines. Pour le stockage à long terme des embryons, les embryons déshydrater en lavant deux fois dans 100% de methanol à la température ambiante pendant 10 min. Conserver les embryons à -20 ° C dans 100% de méthanol.

Résultats

Microinjections de 4 et 8 cellules d' embryons de xénope avec MEM-RFP ARNm montrent différents niveaux de ciblage pour les pronéphros. La figure 4 montre la scène 40 embryons avec des motifs appropriés d'expression de l' ARNm MEM-DP. Les embryons ont été injectés dans le blastomère ventral gauche (figure 4A), et triés pour le motif d'expression correcte du MEM-DP ARNm. En plus d'exprimer MEM-RFP dans le proximal, in...

Discussion

Cibler les pronéphros de développer des embryons de xénope repose sur l' identification et l' injection de la bonne blastomère. L' injection de la blastomère V2 des embryons à 8 cellules cible les pronéphros gauche ^18. Cela laisse les pronéphros controlatérale droite comme un contrôle interne. Si morpholino knockdown ou d'ARN surexpression est utilisé pour modifier le développement du rein, les pronéphros controlatérale droite peuvent être utilisés pour comparer les ef...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Fisher	S271-3
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Magnesium sulfate	Fisher	M63-500
Calcium chloride	Fisher	C79-500
HEPES	Fisher	BP310-500
EDTA	Fisher	S311-500
Gentamycin solution, 50 mg/ml	Amresco	E737-20ML
L-Cysteine, 99%+	Acros Organics	52-90-4
Ficoll	Fisher	BP525-100
100 mm x 15 mm Petri dish	Fisher	FB0875712
Mini Fridge II	Boekel	260009	Benchtop incubator for embryos.
Gap43-RFP plasmid			For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006.
Rhodamine dextran, 10,000 M.W.	Invitrogen	D1817	Tracer.
Molecular biology grade, USP sterile purified water	Corning	46-000-CI
7" Drummond replacement tubes	Drummond	3-000-203-G/XL	Microinjection needles.
Needle puller	Sutter Instruments	P-30
Fine forceps	Dumont	11252-30	For breaking microinjection needle tip.
Nanoject II	Drummond	3-000-204	Microinjector.
Mineral oil, heavy	Fisher	CAS 8042-47-5	Oil for needles.
27 G Monoject hypodermic needle	Covidien	8881200508	For loading mineral oil into microinjection needle.
5 ml Luer-Lok syringe	BD	309646	For loading mineral oil into microinjection needle.
60 mm x 15 mm Petri dish	Fisher	FB0875713A
800 micron Polyester mesh	Small Parts	CMY-0800-C
Transfer pipets	Fisher	13-711-7M	For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette.
6-well cell culture plate	Nest Biotechnology
MOPS	Fisher	BP308-500
EGTA	Acros Organics	67-42-5
Formaldehyde	Fisher	BP531-500
15 mm x 45 mm Screw thread vial	Fisher	03-339-25B	For fixing, staining, and storing embryos.
24-well cell Culture plate	Nest Biotechnology
Benzocaine	Spectrum	BE130
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Methanol	Fisher	A412-4
Phosphate buffered saline (PBS) 1x powder	Fisher	BP661-50
Bovine serum albumen	Fisher	BP1600-100
Triton X-100	Fisher	BP151-500
3D Mini rocker, model 135	Denville Scientific	57281
Goat serum, New Zealand origin	Invitrogen	16210064
Sodium azide	Fisher	S227I-25
Monoclonal 3G8 antibody	European Xenopus Resource Centre		Primary antibody to label proximal tubules.
Monoclonal 4A6 antibody	European Xenopus Resource Centre		Primary antibody to label intermediate, distal and connecting tubules.
anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit	MBL	PM005	Primary antibody to label Gap43-RFP tracer.
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG	Life Technologies	A11001	Secondary antibody to label kidney tubules.
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies	A21428	Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer.
9 Cavity spot plate	Corning	7220-85
Benzyl benzoate	Fisher	105862500	Optional - for clearing embryos
Benzyl alcohol	Fisher	A396-500	Optional - for clearing embryos