טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח<em&gt; Xenopus</em&gt; כליה

Summary

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Abstract

הכליה העוברית של Xenopus laevis (צפרדע), את כִּליַת רֵאשִׁית, מורכב נפרון יחיד, והוא יכול לשמש כמודל למחלת כליות. עוברי Xenopus הם גדולים, לפתח חיצונית, ניתן להשפיע בקלות על ידי microinjection או הליכים כירורגיים. בנוסף, מפות גורל הוקמו עבור עוברי Xenopus מוקדם. microinjection ממוקד לתוך blastomere הפרט כי בסופו של דבר יהיה להצמיח איבר או רקמה של עניין ניתן להשתמש כדי overexpress או להפיל ביטוי גנים באופן סלקטיבי בתוך האזור המוגבל הזאת, הפחתת השפעות משניות בשאר העובר המתפתח. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לנצל מפות גורל Xenopus הוקמה כדי למקד את הכליה Xenopus פיתוח (להלן כִּליַת רֵאשִׁית), באמצעות microinjection לתוך blastomere ספציפיים של עוברים תאים 8 4 ו. הזרקה של קליעי נותבים שושלת מאפשרת אימות של המיקוד הספציפי של הזריקה.לאחר עוברים פתחו לשלב 38 - 40, כל הר immunostaining משמש כדי לחזות התפתחות pronephric, והתרומה ידי תאים ממוקדים אל כִּליַת רֵאשִׁית ניתן להעריך. באותה טכניקה ניתן להתאים למקד סוגי רקמות אחרות בנוסף כִּליַת רֵאשִׁית.

Introduction

הכליה העוברית Xenopus, את כִּליַת רֵאשִׁית, הוא מודל טוב ללימוד פיתוח כליות ומחלות. עובר לפתח חיצוני, הם גדולים, יכולים להיות מיוצרים בכמויות גדולות, והם מניפולציות בקלות באמצעות microinjection או הליכים כירורגיים. בנוסף, הגנים לפיקוח על בניית כליות אצל יונקים ודו-חיים הם משומר. כליות יונקות להתקדם דרך שלושה שלבים: כִּליַת רֵאשִׁית, הכליה, ו metanephros ^1, בעוד דו חיים עובריים כִּליַת רֵאשִׁית ודו-חי בוגרים יש metanephros. יחידת הסינון הבסיסית של צורות כליות אלה היא נפרון, ושניהם יונקים ודו-חיים דורשים את אותה מפלי איתות ואירועים אינדוקטיביים לעבור nephrogenesis ^{2, 3.} כִּליַת רֵאשִׁית Xenopus מכילה נפרון בודד מורכב הפרוקסימלי, ביניים, דיסטלי וחיבור tubules, וכן glomus (מקביל ל glomerulus היונק) ^{1, 4-6} (איור 1 ). הווה נפרון הבודד, הגדול Xenopus כִּליַת רֵאשִׁית הופך אותו מתאים כמודל פשוט לחקר הגנים המעורבים בתהליכי פיתוח כליות ומחלות.

מפות גורל התא הוקמו עבור עוברי Xenopus מוקדם, והם זמינים באופן חופשי באינטרנט ב Xenbase ^7-11. כאן אנו מתארים טכניקה microinjection של קליעים נותבים השושלת למקד את כִּליַת רֵאשִׁית Xenopus פיתוח, אם כי באותה טכניקה ניתן להתאים למקד ברקמות אחרות כגון הלב או העיניים. קליעים נותבים השושלת הם תוויות (כולל צבעים חיוניים, dextrans שכותרתו fluorescently, אנזימים לגילוי histochemically, ו mRNA קידוד חלבוני ניאון) כי ניתן להזריק לתוך blastomere מוקדם, המאפשר הדמיה של הצאצאים של התא במהלך ההתפתחות. פרוטוקול זה מנצל mRNA MEM-RFP, קרום קידוד ממוקד חלבון פלואורסצנטי אדום ^12, כמו נותב השושלת. טק microinjection הממוקדniques עבור בלסטומרים בודדים עוברים 4 ו 8 תאים המתואר כאן יכול להיות מנוצל להזרקה עם morpholinos להפיל ביטוי גנים, או עם RNA אקסוגני overexpress הגן של עניין. באמצעות הזרקה לתוך blastomere הגחון, הצמחי, בעיקר כִּליַת רֵאשִׁית של העובר תהיה ממוקדת, עוזבת את כִּליַת רֵאשִׁית הנגדית כביקורת התפתחותית. שיתוף ההזרקה נותב מוודאת כי blastomere הנכון הוזרק, ומופעים אשר רקמות בעובר נבעו blastomere המוזרק, אימות מיקוד של כִּליַת רֵאשִׁית. Immunostaining של כִּליַת רֵאשִׁית מאפשר הדמיה של מידת הצלחה של tubules pronephric היה ממוקד. תופעות התבטאות יתר ו מציאה אז יכול להיות הבקיע נגד הצד הנגדי של העובר, אשר משמש כביקורת התפתחותי, והוא יכול לשמש כדי לחשב את מדד pronephric ^13. הזמינות של מפות גורל התא מאפשרת טכניקת microinjection ממוקדת זה כדי לשמש יעד רקמות othאה מאשר כִּליַת רֵאשִׁית, ואת שיתוף ההזרקה נותב ניאון מאפשר microinjection המתמקדת בכל רקמות להיות מאומתת לפני הניתוח.

במהלך microinjection העובר, טמפרטורה התפתחותי צריכה להיות מוסדרת בחוזקה, בהתחשב בכך את קצב התפתחות Xenopus תלוי מאוד עליו ^14. עובר צריך להיות מודגרות בטמפרטורות קרירות (14 - 16 מעלות צלזיוס) במשך 4 ו זריקות 8 תאים כי זמן הפיתוח הוא האטה. בגיל 22 ° C, זמן הפיתוח מ -1 הבמה (תא 1) לביים 3 (4 תאים) הוא כ 2 שעות, תוך 16 ° C זמן הפיתוח לשלב 3 הוא כ 4 שעות. זה לוקח בערך 15 דקות לסיום מעובר 4 תאים לעובר 8 תאים (שלב 4) על 22 מעלות צלזיוס, אבל לוקח בערך 30 דקות על 16 מעלות צלזיוס. באופן דומה, על 22 מעלות צלזיוס, זה לוקח רק 30 דקות עבור עובר 8 תאים כדי להתקדם עובר 16 תאים (שלב 5). הפעם הוא עלה ל 45 דקות ב 16 מעלות צלזיוס. הrefore, כדאי להאט את קצב הפיתוח של עוברים כדי לאפשר מספיק זמן עבור זריקות בשלב 8 תאים לפני העוברים להתקדם לשלב 16 תאים. בנוסף, בטמפרטורות צמיחה יכולות להיות מווסתות כדי להאיץ או להאט התפתחות עוברית עד הכליות פתחו באופן מלא.

האפידרמיס של עובר ראשן שלבית Xenopus הוא יחסית שקוף, המאפשר הדמיה קלה של כִּליַת רֵאשִׁית בפיתוח בלי דיסקציה או סליקה של הרקמה ^15. בשל השקיפות היחסית של עוברי Xenopus, הדמיה תא חי הוא גם אפשרי ^16,17. כל הר immunostaining לדמיין את כִּליַת רֵאשִׁית אפשרי עם נוגדנים נקבע כי התווית הפרוקסימלי, ביניים, דיסטלי ו tubules חיבור של שלב 38 - 40 עוברים המאפשרים הערכת התפתחות pronephric ממוקד לאחר מניפולציה של ביטוי גנים העוברים Xenopus ^18-20.

Protocol

הפרוטוקול הבא אושר על ידי האוניברסיטה למדעי בריאות מרכז טקסס המרכז של יוסטון ועדת צער בעלי חיים לרפואה בחיות מעבדה, אשר ממשמשת לטיפול המוסדי ועדת שימוש (# פרוטוקול: HSC-AWC-13-135).

זיהוי 1. בחירה של בלסטומרים עבור זריקות כליות במיקוד

1. לפני יצירה עוברת, השתמש הטבלה הרגילה של Xenopus פיתוח ²¹ כדי להבין את הכיוון של חלוקות התא מוקדם בעובר. לחלופין, דיאגרמות גישה של השלבים ההתפתחותיים המוקדמים של Xenopus על Xenbase ^11.
2. גש מפות גורל תא Xenopus האינטראקטיביות על Xenbase ¹¹ כדי לבחור את blastomere יהיה ממוקד עבור microinjection.
3. שימו לב כי העובר תא בודד יש מוט החיה פיגמנט כהה וקוטב צמחי, שהוא לבן yolky. שימו לב קרום מגן, המכונה e vitellinenvelope, מכסה את העובר.
4. שים לב כי המחשוף הראשון מתרחש בדרך כלל בין הצדדים על ימין ועל שמאל של העובר. תאים אלה לתרום באופן שווה שושלת pronephric.
5. ראוי לציין, כי המחשוף השני מחלק את הגב ואת החצאים גחון של העובר, מה שמוביל העובר 4 תאים. התאים מגבים הם קטנים ויש להם פחות פיגמנט מאשר תאי הגחון (איור 2 א ו איור 3 א).
   1. זהה את בלסטומרים הגחון (V; התאים גדול, כהה) בצדדים שמאל וימין, אשר תורמים יותר לכליה פיתוח מאשר הגבי (D; קטן, תאים אור) בלסטומרים (איור 2 א).
   2. אם הזרקת לעובר 4 תאים, להזריק את blastomere הגחון השמאלי כדי למקד את הכליה שמאלה (איור 3 א וסעיף 3).
6. המחשוף השלישי חוצה את הצדדים בעלי חיים צמחיים, וכתוצאה מכך עוברת שמונה תאים. בשלב זה, ישנם ארבעה בלסטומרים חיה [שמאלה וימינה גחון(V1) ו הגבי (D1)] וארבעה בלסטומרים צמחיים [שמאל וימין גחון (V2) ו הגבי (D2)] (האיור 2B ו איור 3B).
   1. אתר את בלסטומרים הגחון, צמחיים (V2). בלסטומרים אלה תורמים יותר לכליה לפתח כל תאים אחרים בשלב זה (התרשים 2B). כדי למקד את הכליה השמאלית של עובר 8 תאים, להזריק לתוך blastomere V2 שמאלה (איור 3 ב וסעיף 3).
7. שים לב כי השסעים הרביעיים וחמישיים החוצים את בלסטומרים בעלי החיים צמחי. שני צאצאים נוצרים מכל blastomere, וכתוצאה מכך העובר 16 תאים. התאים קרויים קודם שלהם. לדוגמה, blastomere V2 משלב 8 תאים מוליד V2.1 והצאצאים V2.2 בשלב 16 תאים (איור 2 ג). תא V2.2 בשלב 16 התאים מספק את רוב תאי תורם הכליה המתפתחת.
8. הערת הניגודים שישית ושביעיים לגרום אמברי 32 תאיםo. שוב, שני צאצאים נוצרים מכל blastomere, אשר נקראים הבאים קודם שלהם. לדוגמה, blastomere V2.2 משלב 16 תאים מוליד V2.2.1 ו V2.2.2 בשלב 32 תאים. קיימת מערכת שמות חלופית בשלב 32-התא שבו תאים מזוהים בארבע שורות A, B, C, ו- D (בבעלים צמחי), ואת בארבעה טורים כמו 1, 2, 3, ו -4 ( מן הגב אל גחון). לפיכך, blastomere V2.2.2, אשר תורמת את המירב על כִּליַת רֵאשִׁית בפיתוח, נקרא C3 תחת מערכת שמות חלופה זו (איור 2 ד).

2. הכנה עוברת

1. הכן 50 מ"ל של תמיסת Dejelly (2% ציסטאין, NaOH ל- pH 8.0).
2. לבודד שני האשכים של צפרדע זכר יחידה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים ^14. מניחים את האשכים בצלחת פטרי 60 מ"מ מלא 10 מ"ל פתרון האשכים אחסון (אצבעות שונה של 1x מארק [MMR; 0.1 M NaCl, KCl 2 מ"מ, 1 מ"מ MgSO _4, 2 מ"מ₂ CaCl, 5 מ"מ HEPES pH 8, 0.1 mM EDTA] ^12, 1% אלבומין בסרום שור, 50 מיקרוגרם / מ"ל gentamycin). אחסן את האשכים ב 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: אשכים יכולים להיות מאוחסנים במשך כ 7 - 10 ימים על 4 מעלות צלזיוס, אך יעילות הפריה תקטנה ככל האשכים שאוחסנו.
3. סוחטים צפרדע נקבה להשיג ביצים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים ^14. אסוף את הביצים בתוך צלחת פטרי 100 מ"מ. יוצקים את המים העודפים.
4. חותכים ¼ של אשך בזמן שהוא נמצא האשכים פתרון אחסון באמצעות מלקחיים סכין גילוח. מעביר את פיסת האשך בצלחת פטרי המכילה ביצים. התאם את הגודל של חלק testis בשימוש לחשבון בהתאם לגודל של האשכים, כמה זמן לאשכים אוחסנו, וכמה ביצים יש מופרה. באופן כללי להשתמש ¼ 1/3 של testis גזור טרי לדשן מצמד אחד ביצים.
5. חותכים את החלק testis לחתיכות קטנות באמצעות מלקחיים סכין גילוח. להוסיף MMR 0.3x מספיק+ 30 מ"ג / מ"ל ​​gentamycin כדי בצלחת פטרי כדי לכסות את הביצים. מערבולת MMR בצלחת לערבב.
6. יש להמתין כ 30 דקות להפריה להתקיים בטמפרטורת החדר. ראוי לציין, כי בחצי הכדור החי (בצד פיגמנט של העובר) מיישבים על גבי העובר על הפריה יעילה. לאחר מכן, הוציאו את MMR מצלחת פטרי בעזרת פיפטה ההעברה. הוסף מספיק פתרון Dejelly כדי בצלחת כדי לכסות את העוברים.
7. במהלך הדקות הקרובות, בעדינות מערבולת הצלחת לסירוגין. טלטול נמרץ של המנה בשלב זה עלול לגרום למומים ציר.   מעייל הג'לי על העוברי יתמוסס, ואת העוברי יהיה להתאסף במרכז הצלחת במהלך מתערבל. לאחר העוברים עוקבים בדאגה נוגעים זה בזה במרכז של המנה, להסיר את פתרון Dejelly עם טפטפת העברה. אל תשאירו עוברי פתרון Dejelly למשך זמן ארוך יותר מ -5 דקות, או העוברים עלולים להינזק.
8. לשטוף את העוברים dejellied 3 - 5 פעמים ב 0.3xMMR + 30 מ"ג / מ"ל ​​gentamycin ידי שפיכת או pipetting בזהירות את MMR ומילוי את המנה עם חדש MMR. אל תסיר את כל MMR מצלחת, או עוברים עלולים להינזק.
9. הסר את כל ביצים מופרות או פיסות אשך מצלחת פטרי בעזרת פיפטה העברה.
10. דגירה עוברת בין C 14 ו -22 מעלות.
    הערה: עוברים גדל בטמפרטורות נמוכות לפתח לאט יותר עוברים גדל בטמפרטורות גבוהות. עיתוי שלבי ההתפתחות ניתן למצוא באתר Xenbase ^22.
    1. לחלל את התפתחותם, חצי מקומה של העוברים מן הפריה אחת בצלחת פטרי שומרים על 14 מעלות צלזיוס, ואת החצי השני של העוברים בצלחת פטרי שומר על 18 מעלות צלזיוס. זה מאפשר לשני סטים של זריקות לתוך 4 תאים או 8 תאים העוברים מן הפריה אחת.

3. הכנת פתרונות הזרקת Microinjection של עוברים

1. הכן את פתרון ההזרקה המכיל 0.01ng / NL קרום הנכנס חלבון פלואורסצנטי אדום (MEM-RFP) mRNA ⁹ בעוד העוברים מתפתחים לשלב 4 תאים או 8 תאים. אחסן את הפתרון הזרקת על הקרח עד מוכנים להזריק.
2. טען "צינור נימי זכוכית החלפה לתוך חולץ מחט, כאשר החלק העליון של צינור ההחלפה מיושר עם החלק העליון של המקרה מחולץ מחט. הגדר את הערך # 2 חום ל -800, ואת תמורת המשיכה 650. לחץ על" 7 למשוך "על מנת למשוך את המחט. זו תיצור 2 מחטים מתוך 7 יחיד" שפופרת זכוכית נימים.
3. לקטום את קצה מחט משך עם זוג מלקחיים דומון.
   הערה: לאחר משיכת המחט, קצה אטום עצומות וצריך לחתוך פתוח. קרוב יותר חוד המחט שזה הוא חתך, קטן יותר, בקוטר קצה המחט יהיה. למרות הקוטר של הקצה לא ישפיע על עוצמת הזריקה עם מערכת microinjection משמשת כאן, טיפ עם קוטר גדול יותר יש יותר סיכוי לפגוע בעובר.
4. להחליק את מ 'קולט icropipette על חלקו האחורי של המחט. לאחר מכן, להחליק את O-Ring חור גדול על גבו של המחט מאחורי קולט.
5. מלא את המחט עם שמן מינרלים באמצעות מחט מד 27 מזרק, נזהר שלא לקבל בועות אוויר בתוך המחט.
6. להחליק את המחט על הבוכנה של microinjector, ישיבת המחט לתוך החור הגדול של spacer הפלסטיק הלבן מותקן על הבוכנה. הבוכנה צריכה להיות O-Ring קטן קרובה לגוף של microinjector, ואחריו spacer הלבן, O-Ring הבור הגדול, קולט. Secure את המחט על ידי הידוק הקולט. משוך בעדינות על המחט לוודא כי הוא מאובטח כראוי.
7. לחץ לחיצה ממושכת על כפתור "ריק" על תיבת הבקרה microinjector עד ישנם שני צפצופים.
8. פיפטה 3 μl של פתרון הזרקה גבי פיסת Parafilm. הכנס את קצה המחט לתוך החרוז של פתרון הזרקה על Parafilm. לחץ לחיצה ממושכת על "למלא" כפתור על microiתיבת בקרת njector לצייר פתרון הזריקה לתוך המחט.
9. למלא צלחת פטרי 60 מ"מ מצופה 500 מיקרון פוליאסטר רשת עם 5% Ficoll ב MMR 0.3x + 30 מ"ג / מ"ל ​​gentamycin. בזהירות פיפטה 20 - 30 4 תאים או 8 תאים העוברים לתוך הצלחת.
10. באמצעות לולאת שיער ^14, לתפעל את העוברים כך blastomere להיות מוזרק מתמודד עם המחט. כדי למקד את הכליה עזבה, בשורה עוברת כך בלסטומרים הגחון השמאליים של עובר 4 תאים או בלסטומרים V2 שנשארו עובר 8 תאים להתמודד עם המחט.
11. להזריק 10 nl של פתרון הזרקה לתוך blastomere נבחרים כל העובר בצלחת.
    הערה: הרשת בתחתית צלחת פטרי מייצבת את העוברים ומונעת מהם מתגלגלים, ומאפשר להם להיות מוזרק ללא שימוש בלולאת שיער לייצוב.
12. העברת מוזרק עוברים לתוך הבארות של צלחת תרבות מולאו עם 5% Ficoll ב MMR 0.3x + 30 מ"ג / מ"ל ​​gentamycin. דגירה העוברת המוזרקs ב 16 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת לפחות כדי לאפשר בלסטומרים מוזרקים לרפא.
13. מעבירים את העוברים נרפא לתוך בארות צלחת תרבות חדשה מולאו עם gentamycin 0.3x MMR + 30 מ"ג / מ"ל ​​על ידי שלב 9 (לפני gastrulation).
14. דגירה עוברת בגיל 14 - C ° 22 עד העוברים מגיעים לשלב 38 - 40 ^21.

קיבוע 4. Immunostaining של עוברים

1. הכן 50 מ"ל של מגבים / EGTA / סולפט מגנזיום / מאגר פורמלדהיד [MEMFA: 100 מ"מ מגבים (pH 7.4), 2 מ"מ EGTA, 1 מ"מ MgSO _4, 3.7% (v / v) פורמלדהיד].
2. בעזרת פיפטה העברה, לשים 10 - 20 בשלב 38 - 40 העוברים בתוך בקבוקון זכוכית. הוסף 10 μl 5% benzocaine באתנול 100% כדי בקבוקון הבקבוקון להפוך לערבב. חכה 10 דקות כדי להרדים את העוברים.
3. הסר את MMR מבקבוקון באמצעות פיפטה מזכוכית. אם עיבוד בקבוקונים מרובות בעת ובעונה אחת, צלוחיות ניתן זקוף בצלחת תרבית תאים 24 גם.
4. עם מקטרת זכוכיתטטי, למלא את הבקבוקון עם MEMFA. מניחים את הצנצנת על פלטפורמת נדנדה תלת ממדי עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר.
5. הסר את MEMFA מבקבוקון באמצעות פיפטה מזכוכית. מלאו את הבקבוקון עם 100% מתנול. מניחים את הצנצנת על פלטפורמת נדנדה תלת ממדי עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלב זה לשטוף פעם נוספת, ולאחסן את העוברים לילה מתנול 100% ב -20 ° C.
6. הכן 1x בופר פוספט-שור סרום אלבומין-טריטון (PBT): PBS 1x, 2 מ"ג / חלבון בסרום שור מ"ל, 0.1% Triton X-100.
7. הכן את הפתרון נוגדן ראשוני: 1x PBT עם 10% נסיוב עז עם דילול 1: 5 של חד שבטיים העכבר 4A6 נוגדן (לתייג את הקרומים של tubules ביניים, דיסטלי וחיבור ^20), 01:30 דילול של נוגדן חד שבטי העכבר 3G8 (כדי לומן תווית של tubules הפרוקסימלי ^20), ו דילול 1: 250 של נוגדן RFP ארנב polyclonal (לתייג נותב MEM-RFP). חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
8. הכן את secondaפתרון נוגדנים ר"י: 1x PBT עם 10% נסיוב עז, 1: 500 Alexa 488 עז אנטי עכבר IgG (ריכוז המניות 2 מ"ג / מ"ל; לתווית 4A6 ו 3G8), ו -1: 500 Alexa 555 עיזים IgG נגד ארנב (מלאי ריכוז 2 מ"ג / מ"ל; לתייג נותב MEM-RFP). חנות ב 4 ° C, כיסוי הצינור בנייר כדי להגן מפני אור.
9. לחלופין, לאסוף את נוגדנים ראשוניים ומשניים לאחר צביעה, ולשמור על 4 מעלות צלזיוס לשימוש חוזר בניסויים עתידיים. אם הנוגדן הוא להינצל לשימוש חוזר, להוסיף אזיד הנתרן 0.01%.
10. Immunostain את העוברים באמצעות פרוטוקולים הוקמו ^18.

ויזואליזציה 5. עוברים והניתוח של רקמות Pronephric ממוקדות

1. מסך את העוברים immunostained לאמת כי blastomere הנכון הוזרק על ידי הצגת הקרינה של נותב תחת סטראו פלורסנט ב 1X (כדי להציג העובר כולו) 5X (כדי להציג כליות) הגדלה. עובר מקום בצלחת זכוכית רב גם עם אנחנוLLS מלא 1x PBT בעזרת פיפטה העברת עם קצה לחתוך. לתפעל את העוברים עם לולאת שיער. השתמש רק עוברים אשר יש בהווה נותב מוזרק שיתוף ב כִּליַת רֵאשִׁית בצד השמאלי של העובר (איור 3 ג, ו 'ו איור 4C, F) עבור ביטוי יתר גנים או ניתוח מציאה.
2. לחלופין, לנקות את העוברים נקה של מאריי (2 חלקים בנזיל בנזואט: 1 חלק בנזיל אלכוהול) על ידי הצבת את העוברים בתוך צנצנת זכוכית וממלאים את הבקבוקון עם נקה של מאריי. דמיינו את העוברים באמצעות צלחת גם זכוכית.
   הערה: נקה של מאריי הוא ממיס אורגני, וצריך לטפל בהם בזהירות. יש להשתמש בכפפות, ורק להשתמש צלוחיות זכוכית ו טפטפות עם נקה של מאריי.
3. עוברים חנות ב 4 מעלות צלזיוס 1x PBT במשך 2 - 3 שבועות. עבור אחסון לטווח ארוך של עוברים, ליבש את העוברים על ידי שטיפה פעמיים מתנול 100% בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. אחסן את העוברים ב -20 ° C. מתנול 100%.

תוצאות

Microinjections של 4 ו-תאים 8 עוברי Xenopus עם mRNA MEM-RFP להראות רמות שונות של מיקוד אל כִּליַת רֵאשִׁית. איור 4 מראה הבמה 40 עוברים עם דפוסי ביטוי mRNA MEM-RFP הנכון. עובר הוזרקו ב blastomere הגחון השמאלי (איור 4 א), מיון עבור דפוס הביטוי ההולם של mRNA MEM-RFP. בנ...

Discussion

מיקוד כִּליַת רֵאשִׁית לפתח עוברי Xenopus מסתמכת על זיהוי הזרקת blastomere הנכון. הזרקה של blastomere V2 של עוברים 8 תאים מטרות כִּליַת רֵאשִׁית שמאל ^18. זה משאיר את כִּליַת רֵאשִׁית התקינה הנגדית כמו שליטה פנימית. אם morpholino מציאה או ביטוי יתר RNA משמש המשנה את ההתפתחות בכלי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Fisher	S271-3
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Magnesium sulfate	Fisher	M63-500
Calcium chloride	Fisher	C79-500
HEPES	Fisher	BP310-500
EDTA	Fisher	S311-500
Gentamycin solution, 50 mg/mL	Amresco	E737-20ML
L-Cysteine, 99%+	Acros Organics	52-90-4
Ficoll	Fisher	BP525-100
100 mm x 15 mm Petri dish	Fisher	FB0875712
Mini Fridge II	Boekel	260009	Benchtop incubator for embryos.
Gap43-RFP plasmid			For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006.
Rhodamine dextran, 10,000 M.W.	Invitrogen	D1817	Tracer.
Molecular biology grade, USP sterile purified water	Corning	46-000-CI
7" Drummond replacement tubes	Drummond	3-000-203-G/XL	Microinjection needles.
Needle puller	Sutter Instruments	P-30
Fine forceps	Dumont	11252-30	For breaking microinjection needle tip.
Nanoject II	Drummond	3-000-204	Microinjector.
Mineral oil, heavy	Fisher	CAS 8042-47-5	Oil for needles.
27G monoject hypodermic needle	Covidien	8881200508	For loading mineral oil into microinjection needle.
5 mL Luer-Lok syringe	BD	309646	For loading mineral oil into microinjection needle.
60 mm x 15 mm Petri dish	Fisher	FB0875713A
800 micron polyester mesh	Small Parts	CMY-0800-C
Transfer pipets	Fisher	13-711-7M	For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette.
6-well cell culture plate	Nest Biotechnology
MOPS	Fisher	BP308-500
EGTA	Acros Organics	67-42-5
Formaldehyde	Fisher	BP531-500
15 mm x 45 mm screw thread vial	Fisher	03-339-25B	For fixing, staining, and storing embryos.
24-well cell culture plate	Nest Biotechnology
Benzocaine	Spectrum	BE130
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Methanol	Fisher	A412-4
Phosphate buffered saline (PBS) 1X powder	Fisher	BP661-50
Bovine serum albumen	Fisher	BP1600-100
Triton X-100	Fisher	BP151-500
3D mini rocker, model 135	Denville Scientific	57281
Goat serum, New Zealand origin	Invitrogen	16210064
Sodium azide	Fisher	S227I-25
Monoclonal 3G8 antibody	European Xenopus Resource Centre		Primary antibody to label proximal tubules.
Monoclonal 4A6 antibody	European Xenopus Resource Centre		Primary antibody to label distal tubule and duct.
anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit	MBL	PM005	Primary antibody to label Gap43-RFP tracer.
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG	Life Technologies	A11001	Secondary antibody to label distal tubule and duct.
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies	A21428	Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer.
9 cavity spot plate	Corning	7220-85
Benzyl benzoate	Fisher	105862500	Optional - for clearing embryos
Benzyl alcohol	Fisher	A396-500	Optional - for clearing embryos