Technik auf Zielmikroinjektions an die Entwicklungs<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

Zusammenfassung

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Zusammenfassung

Die embryonale Niere von Xenopus laevis (Frosch), die pronephros, besteht aus einem einzigen Nephron, und kann als ein Modell für eine Nierenerkrankung verwendet werden. Xenopus - Embryonen sind groß, entwickeln außen und leicht durch Mikroinjektion oder chirurgische Verfahren manipuliert werden können. Darüber hinaus wurden für die frühen Xenopus - Embryonen Schicksal Karten hergestellt. Gezielte Mikroinjektion in den einzelnen Blastomeren, die Anlass schließlich zu einem Organ oder Gewebe von Interesse geben kann selektiv verwendet werden, um überexprimiert oder knock down Genexpression in diesem begrenzten Bereich, sinkende Nebenwirkungen in den Rest des sich entwickelnden Embryos. In diesem Protokoll beschreiben wir , wie etabliert Xenopus Schicksal Karten verwenden , um die Entwicklung von Xenopus Niere (die pronephros), durch Mikroinjektion in spezifischen Blastomere von 4- und 8-Zellembryos zu zielen. Die Injektion von Lineage Tracer ermöglicht die Verifizierung der spezifischen Ausrichtung der Injektion.Nach Embryonen entwickelt haben, 38 auf die Bühne - 40, ganz-mount Immunfärbung verwendet pronephric Entwicklung sichtbar zu machen, und der Beitrag von Zellen gezielt zu den pronephros beurteilt werden kann. Die gleiche Technik kann andere Gewebetypen angepasst werden, um den pronephros zusätzlich zu zielen.

Einleitung

Die Xenopus embryonale Niere, die pronephros, ist ein gutes Modell der Nierenentwicklung und Krankheit zu studieren. Die Embryonen entwickeln extern, sind groß, in großen Stückzahlen hergestellt werden und werden durch Mikroinjektion oder chirurgische Eingriffe leicht manipulierbar. Darüber hinaus werden die Gene regeln Nierenentwicklung in Säugetieren und Amphibien konserviert. Mammalian Nieren Fortschritte durch drei Phasen: die pronephros, Mesonephros und metanephros ^1, während der embryonalen Amphibien haben ein pronephros und erwachsene Amphibien haben ein metanephros. Die grundlegende Filtereinheit dieser Nierenformen ist das Nephron, und beide Säugetiere und Amphibien benötigen , um die gleiche Signalkaskaden und induktive Ereignisse ³ Nephrogenese ^2, zu unterziehen. Die Xenopus pronephros einen einzigen nephron enthält proximaler zusammengesetzt, Zwischen-, distalen und Anschluss Tubuli, und eine Glomus (analog dem Säuger Glomerulus) ^{1, 4-6} (1 ). Die einzelne, große Nephron in den Xenopus pronephros macht es geeignet als einfaches Modell für die Untersuchung von Genen in Nierenentwicklung und Krankheitsprozessen beteiligt.

Zellschicksal Karten wurden für frühen Xenopus - Embryonen hergestellt und sind frei im Internet unter Xenbase ^7-11 zur Verfügung. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Mikroinjektion von Lineage Tracern , die Entwicklungs Xenopus pronephros zu zielen, wobei die gleiche Technik angepasst werden kann , andere Gewebe zu zielen, wie das Herz oder die Augen. Lineage Tracern sind Etiketten (einschließlich Vitalfarbstoffen, fluoreszierend markierte Dextrane, histochemisch nachweisbare Enzyme und mRNA kodiert, fluoreszierende Proteine), die in einem frühen Blastomere injiziert werden kann, so dass die Visualisierung der Nachkommen dieser Zelle während der Entwicklung. Dieses Protokoll nutzt MEM-RFP - mRNA, die Codierung Membran rot fluoreszierendes Protein ¹² als Linie Tracer gezielt. Die gezielte Mikroinjektions techniken für einzelne Blastomeren in 4- und 8-Zellen-Embryonen hier beschriebene zur Injektion mit Morpholinos genutzt werden, um knock down Genexpression oder mit exogenen RNA ein Gen von Interesse überexprimiert. Durch die Injektion in die Bauch, pflanzliche Blastomere, in erster Linie die pronephros des Embryos wird gezielt werden, die kontralateralen pronephros als Entwicklungskontrolle verlassen. Co-Einspritzen eines Tracers verifiziert, dass der korrekte Blastomere injiziert wurde, und zeigt, welche in der Embryogeweben ergaben sich aus dem injizierten Blastomere, Verifizieren der pronephros Targeting. Immunostaining der pronephros ermöglicht die Visualisierung, wie gut die pronephric Tubuli gezielt wurden. Überexpression und Zuschlags Effekte können dann auf die Gegenseite des Embryos erzielt werden, die als Entwicklungskontrolle dient und verwendet werden kann , die pronephric Index ¹³ zu berechnen. Die Verfügbarkeit von Zellschicksal Karten ermöglicht diese gezielte Mikroinjektionstechnik verwendet werden, an Zielgewebe other als die pronephros und Co-Injektion eines fluoreszierenden Indikators erlaubt die gezielte Mikroinjektions zu jedem Gewebe vor der Analyse überprüft werden.

Während der Embryomikroinjektions sollte Entwicklungstemperatur fest geregelt werden, da die Rate der Xenopus Entwicklung auf sie stark abhängig ist ^14. (- 16 ° C 14) 4- und 8-Zellinjektionen, da die Entwicklungszeit verlangsamt Embryonen bei kühleren Temperaturen inkubiert werden. Bei 22 ° C, die Entwicklungszeit von Stufe 1 (1 Zelle) auf Stufe 3 (4 Zellen) beträgt etwa 2 Stunden, während bei 16 ° C Entwicklungszeit zu Stufe 3 ca. 4 Stunden. Es dauert etwa 15 Minuten von einem 4-Zellen-Embryo zu einem 8-Zellen (Stufe 4) Embryo bei 22 ° C zu gehen, aber dauert etwa 30 Minuten bei 16 ° C. In ähnlicher Weise bei 22 ° C, dauert es nur 30 Minuten für eine 8-Zell-Embryo zu einem 16-Zellen-Embryo (Stufe 5) fortzuschreiten. Diese Zeit wird bei 16 ° C auf 45 Minuten erhöht. Dasrefore, ist es nützlich, um die Entwicklungsrate der Embryonen zu verlangsamen, an der 8-Zellen-Stadium für Injektionszwecke ausreichend Zeit zu ermöglichen, bevor die Embryonen auf die Bühne 16-Zelle fortzuschreiten. Außerdem können Wachstumstemperaturen moduliert werden embryonale Entwicklung zu beschleunigen oder zu verlangsamen, bis die Niere vollständig entwickelt hat.

Die Epidermis der Kaulquappe stufigen Xenopus - Embryonen ist relativ transparent, erlaubt eine einfache Abbildung der Entwicklung pronephros ohne Dissektion oder Lichtung des Gewebes ^15. Aufgrund der relativen Transparenz von Xenopus - Embryonen ist die Abbildung lebender Zellen auch denkbar , ^16,17. Whole-mount die pronephros zu visualisieren immunostaining ist möglich , mit etablierten Antikörper, die die proximalen, mittleren distalen und Verbindungs ​​Tubuli der Stufe 38 beschriften - 40 Embryonen , die für die Beurteilung der pronephric Entwicklung ermöglichen nach Manipulation der Genexpression gezielt in Xenopus - Embryonen ^18-20.

Protokoll

(: HSC-AWC-13-135-Protokoll #) Das folgende Protokoll wurde von der University of Texas Health Science Center in Houston Center for Laboratory Animal Medicine Animal Welfare Committee, das dient als Institutional Care und Verwenden Committee genehmigt.

1. Identifizierung und Auswahl von Blastomeren für Injektionszwecke Nieren-bezogenen

1. Vor der Embryonen zu erzeugen, verwenden Sie die normale Tabelle der Xenopus - Entwicklung ²¹ , um die Ausrichtung der ersten Zellteilungen im Embryo zu verstehen. Alternativ Zugriffsdiagramme der frühen Entwicklungsstadien von Xenopus auf Xenbase ^11.
2. Zugriff auf die interaktive Xenopus Zellschicksal Karten auf Xenbase ¹¹ zu wählen , welche Blastomere für Mikroinjektionsausgerichtet sein.
3. Beachten Sie, dass die einzelne Zelle Embryo eine dunkel pigmentierte Tier Pol und einen vegetativen Pol, der weiß und yolky ist. Beachten Sie, dass eine Schutzmembran, wie die Dotter e bekanntnvelope, deckt den Embryo.
4. Beachten Sie, dass die erste Spaltungs typischerweise zwischen den linken und rechten Seite des Embryos erfolgt. Diese Zellen tragen gleichermaßen zur pronephric Linie.
5. Man beachte, dass die zweite Spaltungs die dorsale und ventrale Hälften des Embryos aufteilt, mit einem 4-Zellen-Embryo führt. Die dorsale Zellen sind kleiner und haben weniger Pigment als die ventralen Zellen (2A und 3A).
   1. Identifizieren der ventralen Blastomeren (V, die große, dunkle Zellen) auf der linken und rechten Seite, die mehr auf die Entwicklung von Nieren als der dorsal beitragen (D; kleine, leichte Zellen) Blastomeren (2A).
   2. Wenn in ein 4-Zellen - Embryo eingespritzt wird , injizieren die linke ventrale Blastomere der linken Niere (3A und Abschnitt 3) zu richten.
6. Die dritte Spaltungs halbiert den animalen und vegetativen Seiten, was zu einer Acht-Zellen-Embryos. An diesem Punkt gibt es vier Tier Blastomeren [linke und rechte ventrale(V1) und dorsal (D1)] und vier vegetabile Blastomeren [linke und rechte ventrale (V2) und dorsal (D2)] (2B und 3B).
   1. Suchen Sie die ventralen, pflanzliche Blastomeren (V2). Diese Blastomeren tragen mehr zur Entwicklung von Nieren alle anderen Zellen in dieser Phase (2B). Um die linke Niere eines 8-Zellen - Embryo Ziel, spritzen in die linke V2 Blastomere (3B und Abschnitt 3).
7. Beachten Sie, dass die vierte und fünfte cleavages die tierischen und pflanzlichen Blastomeren bisect. Zwei Nachkommen werden von jedem Blastomere erzeugt, was zu einer 16-Zellen-Embryo. Die Zellen werden nach ihrem Vorgänger benannt. Beispielsweise gibt der V2 Blastomere von der 8-Zellen - Stadium zur V2.1 und V2.2 Nachkommen im 16-Zell - Stadium (Abbildung 2C). Die Zelle V2.2 an der 16-Zell-Stadium stellt die Mehrheit der beitragenden Zellen zu der Entwicklungs Niere.
8. Die dargestellten sechsten und siebten cleavages resultieren in einem 32-Zellen-embryO. Auch hier sind zwei Nachkommen aus jeder Blastomere erzeugt, die im Anschluss an ihre Vorgänger benannt sind. Zum Beispiel gibt der Blastomere V2.2 aus dem 16-Zellen-Stadium zur V2.2.1 und V2.2.2 im 32-Zell-Stadium. Es gibt eine Alternative Benennungssystem im 32-Zell-Stadium, in dem Zellen in vier Reihen als A, B bezeichnet sind, C und D (von Tier zu vegetabile) und in vier Spalten 1, 2, 3, und 4 ( von dorsal nach ventral). Somit ist die V2.2.2 Blastomere, die am meisten zu den Entwicklungs pronephros trägt, wird C3 unter dieser alternativen Benennungssystem (2D) genannt.

2. Herstellung von Embryonen

1. Vorbereitung 50 ml Dejelly Lösung (2% Cystein, NaOH auf pH 8,0).
2. Isolieren Sie beide Hoden von einem einzigen männlichen Frosch nach Standardprotokollen ^14. Legen Sie die Hoden in einer 60 mm Petrischale gefüllt mit 10 ml Testes - Storage - Lösung (1x Marc-modifiziertem Ringers [MMR; 0,1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO _4, 2 mMCaCl _2, 5 mM HEPES pH 8, 0,1 mM EDTA] ^12, 1% Rinderserumalbumin, 50 ug / ml Gentamycin). Lagern Sie die Hoden bei 4 ° C.
   Hinweis: Testes kann für etwa 7 gespeichert werden - 10 Tage bei 4 ° C, aber Befruchtungseffizienz abnimmt, je länger die Hoden gespeichert wurden.
3. Drücken Sie einen weiblichen Froscheier zu erhalten , nach Standardprotokollen ^14. Sammeln Sie die Eier in einer 100 mm Petrischale. Gießen Sie überschüssiges Wasser ab.
4. Schneiden Sie ¼ eines Hodens aus, während es in Testes-Storage-Lösung ist Zange und mit einer Rasierklinge. Übertragen Sie das Stück Hoden in die Petrischale mit Eiern. Passen Sie die Größe des Abschnitts Hodens zu Konto für die Größe des Hodens verwendet, wie lange der Hoden gespeichert ist, und wie viele Eier sind befruchtet werden. Im Allgemeinen verwenden ¼ bis 1/3 eines frisch seziert Hoden ein Gelege zu befruchten.
5. Schneiden Sie den Hoden Teil in kleine Stücke mit einer Pinzette und eine Rasierklinge. Fügen Sie genug 0.3x MMR+ 30 mg / ml Gentamycin in die Petrischale um die Eier zu bedecken. Schwenken Sie die MMR in der Schale zu mischen.
6. Warten Sie ca. 30 Minuten für die Befruchtung bei Raumtemperatur zu nehmen. Beachten Sie, dass das Tier Hemisphäre (die pigmentierte Seite des Embryos) auf der Oberseite des Embryos auf wirksame Befruchtung sitzen. Entfernen Sie dann die MMR aus der Petrischale eine Transferpipette. Fügen Sie genug Dejelly Lösung in die Schale, die Embryonen zu decken.
7. In den nächsten paar Minuten, vorsichtig schwenken die intermittierend Gericht. Heftigem Schütteln der Schale zu diesem Zeitpunkt kann Achse Defekte verursachen.   Die Gallerthülle auf den Embryonen wird sich auflösen, und die Embryonen werden während wirbeln in der Mitte der Schale versammeln. Sobald die Embryonen eng einander in der Mitte der Schale zu berühren, entfernen Sie die Dejelly Lösung mit einer Transferpipette. Lassen Sie keine Embryonen in der Dejelly Lösung für länger als 5 Minuten, oder die Embryonen möglicherweise beschädigt.
8. Waschen Sie die dejellied Embryonen 3-5 mal in 0.3xMMR + 30 mg / ml Gentamycin durch vorsichtiges Gießen oder Abpipettieren des MMR und die Schale mit neuen MMR füllen. Nicht alle der MMR von der Schale zu entfernen, oder die Embryonen möglicherweise beschädigt.
9. Entfernen Sie alle unbefruchteten Eiern oder Stücke von Hoden aus der Petrischale eine Transferpipette.
10. Inkubieren Embryonen zwischen 14 und 22 ° C.
    Hinweis: Die Embryonen bei niedrigeren Temperaturen gewachsen entwickeln langsamer als Embryonen bei höheren Temperaturen gewachsen. Zeitpunkt der Entwicklungsstadien auf Xenbase ²² zu finden.
    1. Um Platz aus ihrer Entwicklung, Platz Hälfte der Embryonen aus einer einzigen Befruchtung in einer Petrischale gehalten bei 14 ° C, und die andere Hälfte der Embryonen in einer Petrischale gehalten bei 18 ° C. Dies ermöglicht zwei Sätze von Injektionen in 4-Zellen-oder 8-Zellen-Embryos aus einer einzigen Befruchtung.

3. Herstellung von Injektionslösungen und Mikroinjektion von Embry

1. Bereiten Sie die Injektionslösung, die 0,01ng / nl membrangebundenen rot fluoreszierendes Protein (MEM-RFP) mRNA ⁹ , während sich die Embryonen im 4-Zellen - oder 8-Zell - Stadium entwickeln. Lagern Sie die Injektionslösung auf Eis, bis die Injektion bereit.
2. Legen Sie eine 7 "Ersatz Glaskapillarrohrs in eine Nadel Abzieher, mit der Spitze des Ersatzröhre mit der Spitze der Nadel Abzieher Fall ausgerichtet ist. Stellen Sie die Hitze # 2-Wert bis 800 und der Pull-Wert auf 650. Drücken Sie die" ziehen ", um die Nadel zu ziehen. Dies erzeugt zwei Nadeln aus einer einzigen 7" Glaskapillarrohrs.
3. Snip die Spitze einer Nadel gezogen mit einem Paar von Dumont Zange ab.
   Hinweis: Nach der Nadel ziehen, wird die Spitze dicht verschlossen und muss aufgeschnitten werden. Je näher an der Spitze der Nadel, die es geschnitten wird, je kleiner der Durchmesser der Nadelspitze ist. Obwohl der Durchmesser der Spitze nicht das Injektionsvolumen mit dem Mikroinjektionssystem hier verwendet beeinflussen, eine Spitze mit einem größeren Durchmesser ist wahrscheinlicher, den Embryo zu beschädigen.
4. Schieben Sie die micropipette Spannzange auf die Rückseite der Nadel. Als nächstes schieben Sie die große Loch O-Ring hinter der Spannzange der Nadel auf der Rückseite.
5. Füllen Sie die Nadel mit Mineralöl mit einer 27-Gauge-Injektionsnadel verwenden, wobei darauf geachtet, keine Luftblasen in der Nadel zu bekommen.
6. Schieben Sie die Nadel auf den Kolben der Mikroinjektors, die Nadel in das große Loch der weißen Plastikabstandhalter auf dem Kolben installiert Sitz. Der Kolben sollte einen kleinen O-Ring am nächsten zu dem Körper des Mikroinjektors, gefolgt von den weißen Abstandhalter, großes Loch O-Ring und Spannzange. Befestigen Sie die Nadel durch die Spannzange festziehen. Ziehen Sie vorsichtig an der Nadel, um sicherzustellen, dass es richtig gesichert ist.
7. Drücken und halten Sie die "leere" -Taste auf der Mikroinjektors Steuerbox, bis zwei Pieptöne sind.
8. Pipette 3 ul Injektionslösung auf ein Stück Parafilm. Legen Sie die Spitze der Nadel in die Perle der Injektionslösung auf dem Parafilm. Drücken und halten Sie die "füllen" -Taste auf der microinjector Kontrollkästchen, um die Injektionslösung in die Nadel zu ziehen.
9. Füllen Sie eine 60 mm Petrischale mit 500 Mikron Polyester ausgekleidet Netz mit 5% Ficoll in 0.3x MMR + 30 mg / ml Gentamycin. Sorgfältig pipettieren 20-30 April-Zell-oder 8-Zellen-Embryonen in die Schale.
10. Verwendung einer Haarschleife ^14, manipulieren die Embryonen so dass die Blastomere einzuspritzen ist die Nadel gegenüber . Zur Ausrichtung auf die linke Niere, richten Sie die Embryonen, so dass die linke ventrale Blastomeren von 4-Zellen-Embryonen oder links V2 Blastomeren von 8-Zellen-Embryonen, die Nadel stellen.
11. Einzuspritzen 10 nl der Injektionslösung in den ausgewählten Blastomere von jedem Embryo in der Schale.
    Hinweis: Das Gitter am Boden der Petrischale stabilisiert die Embryonen und verhindert, dass sie rollen, so dass sie für die Stabilisierung ohne die Verwendung eines Haarschleife injiziert werden.
12. Transfer Embryonen in die Vertiefungen einer Kulturplatte eingespritzt, die mit 5% Ficoll in 0.3x MMR + 30 mg / ml Gentamycin gefüllt wurden. Inkubieren des injizierten Embryos bei 16 ° C für mindestens eine Stunde, um die injizierte Blastomere zu erlauben, zu heilen.
13. Übertragen Sie die geheilt Embryonen in die Vertiefungen einer neuen Kulturplatte, die mit 0.3x MMR + 30 mg / ml Gentamycin von Stufe 9 (vor der Gastrulation) gefüllt wurden.
14. Inkubieren Sie die Embryonen bei 14 bis 40 ²¹ - 22 ° C , bis die Embryonen Stufe 38 erreichen.

4. Fixierung und Immunfärbung von Embryonen

1. Vorbereitung 50 ml MOPS / EGTA / Magnesium sulfat / Formaldehyde Buffer [MEMFA: 100 mM MOPS (pH 7,4), 2 mM EGTA, 1 mM MgSO _4, 3,7% (v / v) Formaldehyd].
2. Mit Hilfe einer Transferpipette, setzen 10 - 20 Stufe 38 bis 40 Embryonen in einem Glasfläschchen. Fügen Sie 10 & mgr; l 5% Benzocain in 100% igem Ethanol in das Fläschchen und invert Phiole zu mischen. Warten Sie 10 min, die Embryonen zu betäuben.
3. Entfernen Sie die MMR aus dem Fläschchen mit einer Glaspipette. Wenn mehrere Ampullen gleichzeitig Verarbeitung können die Phiolen aufrecht in einer Platte mit 24 Vertiefungen Zellkultur gehalten werden.
4. Mit einem Glasrohrtte, füllen Sie das Fläschchen mit MEMFA. Legen Sie das Fläschchen auf einem dreidimensionalen Schüttler für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
5. Entfernen Sie die MEMFA aus dem Fläschchen mit einer Glaspipette. Füllen Sie das Fläschchen mit 100% Methanol. Legen Sie das Fläschchen auf einem dreidimensionalen Schüttler für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie diesen Waschschritt ein weiteres Mal, und speichern Sie die Embryonen in 100% Methanol über Nacht bei -20 ° C.
6. Vorbereitung 1x Phosphate Buffered Saline-Rinderserumalbumin-Triton (PBT): 1x PBS, 2 mg / ml Rinderserumalbumin, 0,1% Triton X-100.
7. Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung: 1x PBT mit 10% Ziegenserum mit einem 1: 5 - Verdünnung von Maus - monoklonalen Antikörper 4A6 (zu etikettieren die Membranen der Zwischen, distalen und Verbindungs ​​Tubuli ^20), eine 01.30 Verdünnung von Maus - monoklonalen Antikörpers 3G8 (zu Etikett Lumen der proximalen Tubuli ²⁰⁾ und einer 1: 250 Verdünnung von Kaninchen - polyklonalen Antikörper RFP (um die MEM-RFP - Tracer - Label). Lagerung bei 4 ° C.
8. Bereiten Sie die secondary-Antikörper-Lösung: 1x PBT mit 10% Ziegenserum, 1: 500 Alexa 488 Ziegen-Anti-Maus-IgG (Stammkonzentration 2 mg / ml; beschriften 4A6 und 3G8) und 1: 500 Alexa 555 Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (Lager Konzentration 2 mg / ml; die MEM-RFP-Tracer zur Markierung). Lagerung bei 4 ° C, für den Schlauch in Folie vor Licht zu schützen.
9. Alternativ sammeln die primären und sekundären Antikörper nach der Färbung, und in zukünftigen Experimenten bei 4 ° C zur Wiederverwendung speichern. Wenn der Antikörper zur Wiederverwendung gespeichert werden soll, fügen Sie 0,01% Natriumazid.
10. Immunostain die Embryonen etablierten Protokollen unter Verwendung von ^18.

5. Visualisierung von Embryonen und Analyse von Zielgerichtete Pronephric Tissue

1. Bildschirm, um die immunhistochemisch Embryonen zu überprüfen, ob die korrekte Blastomere durch Betrachten der Fluoreszenz des Tracers unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop bei 1X injiziert wurde (zu sehen ganze Embryo) und D5 (zu sehen Niere) Vergrößerung. Platz Embryonen in einer Multi-Well-Glasplatte mit dem wirlls gefüllt mit 1x PBT einer Transferpipette mit der Spitze mit abgeschnitten. Manipulieren die Embryonen mit einer Haarschleife. Nur Embryonen , die die co-injizierten Tracer , die in den pronephros auf der linken Seite des Embryos (3C, F und 4C, F) für die Gen - Überexpression oder Zuschlagsanalyse haben.
2. Alternativ deaktivieren Sie die Embryonen in Murrays Clear (2 Teile Benzylbenzoat: 1 Teil Benzylalkohol) durch die Embryonen in einem Glasfläschchen und das Fläschchen mit Murrays Klar füllen. Visualisieren Sie die Embryonen ein Glas-Well-Platte verwendet wird.
   Hinweis: Murray Clear ist ein organisches Lösungsmittel, und sollte mit Vorsicht behandelt werden. Handschuhe tragen, und verwenden Sie nur Glasfläschchen und Pipetten mit Murrays Clear.
3. Store Embryonen bei 4 ° C in 1x PBT für 2 - 3 Wochen. Für die Langzeitlagerung von Embryonen, dehydratisieren die Embryonen durch zweimal in 100% Methanol bei Raumtemperatur für 10 min gewaschen. Speichern der Embryonen bei -20 ° C in 100% Methanol.

Ergebnisse

Mikroinjektionen von 4- und 8-Zell Xenopus - Embryonen mit MEM-RFP mRNA zeigen verschiedene Ebenen zu den pronephros Targeting. 4 zeigt Stufe 40 Embryonen mit korrektem MEM-RFP mRNA Expressionsmuster. Embryos wurden in der linken ventral Blastomere (4A), und sortiert die richtige Expressionsmuster von MEM-RFP mRNA injiziert. Zusätzlich MEM-RFP im proximalen zum Ausdruck zu bringen, Zwischen- und distalen Tubuli der Niere, richtig injizierten Em...

Diskussion

Targeting die pronephros der Entwicklung von Xenopus - Embryonen stützt sich auf die Identifizierung und die richtige Blastomere zu injizieren. Die Injektion des V2 Blastomere von 8-Zellen - Embryonen zielt auf die linke pronephros ^18. Dies lässt die Gegenseite rechts pronephros als interne Kontrolle. Wenn Morpholino Knockdown oder RNA-Überexpression wird verwendet, Nierenentwicklung zu verändern, können die Gegenseite rechts pronephros verwendet werden, um die Auswirkungen von Knock-Down oder ?...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Fisher	S271-3
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Magnesium sulfate	Fisher	M63-500
Calcium chloride	Fisher	C79-500
HEPES	Fisher	BP310-500
EDTA	Fisher	S311-500
Gentamycin solution, 50 mg/ml	Amresco	E737-20ML
L-Cysteine, 99%+	Acros Organics	52-90-4
Ficoll	Fisher	BP525-100
100 mm x 15 mm Petri dish	Fisher	FB0875712
Mini Fridge II	Boekel	260009	Benchtop incubator for embryos.
Gap43-RFP plasmid			For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006.
Rhodamine dextran, 10,000 M.W.	Invitrogen	D1817	Tracer.
Molecular biology grade, USP sterile purified water	Corning	46-000-CI
7" Drummond replacement tubes	Drummond	3-000-203-G/XL	Microinjection needles.
Needle puller	Sutter Instruments	P-30
Fine forceps	Dumont	11252-30	For breaking microinjection needle tip.
Nanoject II	Drummond	3-000-204	Microinjector.
Mineral oil, heavy	Fisher	CAS 8042-47-5	Oil for needles.
27 G Monoject hypodermic needle	Covidien	8881200508	For loading mineral oil into microinjection needle.
5 ml Luer-Lok syringe	BD	309646	For loading mineral oil into microinjection needle.
60 mm x 15 mm Petri dish	Fisher	FB0875713A
800 micron Polyester mesh	Small Parts	CMY-0800-C
Transfer pipets	Fisher	13-711-7M	For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette.
6-well cell culture plate	Nest Biotechnology
MOPS	Fisher	BP308-500
EGTA	Acros Organics	67-42-5
Formaldehyde	Fisher	BP531-500
15 mm x 45 mm Screw thread vial	Fisher	03-339-25B	For fixing, staining, and storing embryos.
24-well cell Culture plate	Nest Biotechnology
Benzocaine	Spectrum	BE130
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Methanol	Fisher	A412-4
Phosphate buffered saline (PBS) 1x powder	Fisher	BP661-50
Bovine serum albumen	Fisher	BP1600-100
Triton X-100	Fisher	BP151-500
3D Mini rocker, model 135	Denville Scientific	57281
Goat serum, New Zealand origin	Invitrogen	16210064
Sodium azide	Fisher	S227I-25
Monoclonal 3G8 antibody	European Xenopus Resource Centre		Primary antibody to label proximal tubules.
Monoclonal 4A6 antibody	European Xenopus Resource Centre		Primary antibody to label intermediate, distal and connecting tubules.
anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit	MBL	PM005	Primary antibody to label Gap43-RFP tracer.
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG	Life Technologies	A11001	Secondary antibody to label kidney tubules.
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies	A21428	Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer.
9 Cavity spot plate	Corning	7220-85
Benzyl benzoate	Fisher	105862500	Optional - for clearing embryos
Benzyl alcohol	Fisher	A396-500	Optional - for clearing embryos