Técnica ao Target microinjeção para o desenvolvimento<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

Resumo

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Resumo

O rim embrionário de Xenopus laevis (rã), os pronephros, consiste de uma única nefrónio, e pode ser usado como um modelo para a doença renal. Embriões de Xenopus são grandes, desenvolvem externamente, e pode ser facilmente manipulado por microinjecção ou procedimentos cirúrgicos. Além disso, mapas destino foram estabelecidas para embriões de Xenopus. microinjecção alvejado no blast�ero indivíduo que irá, eventualmente, dar origem a um órgão ou tecido de interesse pode ser utilizado para sobre-expressar selectivamente ou derrubar a expressão do gene restrita dentro desta região, diminuição dos efeitos secundários no resto do embrião em desenvolvimento. Neste protocolo, descrevemos como utilizar estabelecidos mapas destino Xenopus para atingir o Xenopus rim em desenvolvimento (os pronephros), por microinjecção blastomere específico de embriões de células 8 4 e. A injecção de marcadores de linhagem permite a verificação de uma orientação mais precisa da injecção.Depois de embriões se desenvolveram para encenar 38-40, todo-mount imuno é usado para visualizar o desenvolvimento pronephric, ea contribuição de células-alvo para os pronephros pode ser avaliado. A mesma técnica pode ser adaptada para outros tipos de tecidos alvo para além dos pronephros.

Introdução

O rim embrionário de Xenopus, as pronephros, é um bom modelo para o estudo do desenvolvimento e doença renal. Os embriões desenvolvem externamente, são grandes em tamanho, podem ser produzidos em grandes números, e são facilmente manipulados através de microinjecção ou procedimentos cirúrgicos. Além disso, os genes que regulam o desenvolvimento do rim em mamíferos e anfíbios são conservados. Rins de mamíferos progredir através de três etapas: a pronephros, mesonephros e metanephros ^1, enquanto anfíbios embrionárias têm um pronephros e anfíbios adultos têm um metanephros. A unidade de filtragem básica dessas formas de rim é o néfron, e ambos os mamíferos e anfíbios exigir os mesmos cascatas de sinalização e eventos indutivos se submeter nefrogênese ^{2, 3.} Os pronephros Xenopus contém um único néfron composto por proximal, intermediário, distal e conectando túbulos, e um Glomus (análogo ao do glomérulo de mamífero) ^{1, 4-6} (Figura 1 ). A única, grande nefrónio presente nas pronephros Xenopus torna-o adequado como um modelo simples para o estudo de genes envolvidos em processos de desenvolvimento renal e doença.

Mapas celular fate foram estabelecidas para embriões de Xenopus, e estão disponíveis gratuitamente on-line em Xenbase ^7-11. Aqui, nós descrevemos uma técnica para microinjecção de marcadores de linhagem para direccionar o desenvolvimento de Xenopus pronephros, embora a mesma técnica pode ser adaptado para outros tecidos alvo tais como o coração ou olhos. marcadores de linhagem são etiquetas (incluindo corantes vitais, dextranos marcados com fluorescência, enzimas detectáveis ​​histoquimicamente, e ARNm que codificam as proteínas fluorescentes) que pode ser injectado num blastómero cedo, permitindo a visualização da descendência da célula que durante o desenvolvimento. Este protocolo utiliza MEM-RFP ARNm, membrana alvo que codifica a proteína fluorescente vermelha ^12, como um marcador de linhagem. A tecnologia de microinjeção alvonicas para blastómeros individuais em embriões de células 4- 8 e descritas aqui podem ser utilizadas para injecção com morpholinos para derrubar a expressão do gene, ou com RNA exógeno para sobre-expressar um gene de interesse. Ao injectar no blast�ero ventral, vegetal, principalmente as do embrião pronephros vai ser alvo, deixando os pronephros contralaterais como um controlo do desenvolvimento. Co-injeção de um traçador verifica se o blastomere correta foi injetado, e mostra que os tecidos no embrião surgiu a partir da blastomere injetado, verificando a segmentação dos pronephros. Imunocoloração das pronephros permite a visualização de quão bem os túbulos pronephric foram alvejados. A sobre-expressão e efeitos de knockdown pode então ser marcado contra o lado contralateral do embrião, o qual serve como um controlo de desenvolvimento, e podem ser usados ​​para calcular o índice pronephric ^13. A disponibilidade de mapas destino celular permite que esta técnica de microinjecção objectivo de ser utilizada para os tecidos alvo othER do que os pronephros, e a co-injecção de um traçador fluorescente permite a micro-injecção direccionada para cada tecido a ser verificada antes da análise.

Durante a microinjeção de embriões, a temperatura de desenvolvimento deve ser regulamentado firmemente, dado que a taxa de desenvolvimento de Xenopus é altamente dependente dele ^14. Os embriões devem ser incubados a temperaturas mais baixas (14 - 16 ° C) para as injecções de células-4- 8 e porque o tempo de desenvolvimento é abrandado. A 22 ° C, o tempo de desenvolvimento de uma fase (1 célula) a fase 3 (4 células) é de aproximadamente 2 horas, enquanto que o tempo de desenvolvimento de 16 ° C para a fase 3 é de aproximadamente 4 horas. Demora cerca de 15 minutos para ir de um embrião de 4 células para uma célula-8 (etapa 4) de embriões a 22 ° C, mas demora cerca de 30 minutos a 16 ° C. Do mesmo modo, a 22 ° C, leva apenas 30 minutos para um embrião de 8 células de progredir para uma célula embrionária 16 (etapa 5). Este tempo é aumentado para 45 minutos a 16 ° C. oguinte, que é útil para diminuir a taxa de desenvolvimento dos embriões para permitir tempo suficiente para injecções na fase de 8 células antes de os embriões progredir para a fase de 16 células. Além disso, as temperaturas de crescimento pode ser modulada para acelerar ou retardar o desenvolvimento embrionário até o rim foi totalmente desenvolvido.

A epiderme de girino em estágio embriões de Xenopus é relativamente transparente, permitindo a fácil imagem dos pronephros em desenvolvimento sem dissecção ou compensação do tecido ^15. Devido à relativa transparência de embriões de Xenopus, imagens de células vivas também é viável ^16,17. Todo-mount imunocoloração para visualizar as pronephros é possível com anticorpos estabelecidos que rotulam o proximal, intermediário, distal e túbulos de ligação de fase 38 - 40 embriões que permitem a avaliação do desenvolvimento pronephric depois alvo de manipulação da expressão do gene em embriões de Xenopus ^18-20.

Protocolo

O seguinte protocolo foi aprovado pela Universidade do Texas Health Science Center em Center em Houston para o Comitê de Animais de Laboratório de Medicina Animal Welfare, que serve como o Cuidado Institucional e Use Committee (protocolo nº: HSC-AWC-13-135).

1. Identificação e Seleção de Blastômeros para injectáveis ​​alvo de rim

1. Antes de gerar embriões, o uso de mesa normal de Xenopus ²¹ Desenvolvimento de compreender a orientação das divisões celulares precoces no embrião. Alternativamente, diagramas de acesso dos primeiros estágios de desenvolvimento de Xenopus em Xenbase ^11.
2. Acessar os mapas destino celular interativos Xenopus sobre Xenbase ¹¹ para selecionar quais blastomere vai ser alvo de microinjeção.
3. Observe que o embrião unicelular tem um pólo animais mais pigmentadas e um pólo vegetal, que é branco e yolky. Note-se que uma membrana de protecção, conhecido como o vitelina envelope, abrange o embrião.
4. Note-se que a primeira clivagem ocorre normalmente entre os lados esquerdo e direito do embrião. Estas células contribuem igualmente para a linhagem pronephric.
5. Note-se que a segunda clivagem divide dorsal e ventral metades do embrião, levando a um embrião de quatro células. As células dorsais são mais pequenos e têm menos pigmento do que as células ventrais (Figura 2A e a Figura 3A).
   1. Identificar os blastômeros ventral (V; as células grandes, escuros) nas laterais esquerda e direita, que contribuem mais para o rim em desenvolvimento do que o dorsal (D; células pequenas e leves) blastômeros (Figura 2A).
   2. Se a injeção em um embrião de 4 células, injetar o blastomere ventral esquerdo para atingir o rim esquerdo (Figura 3A e Seção 3).
6. A terceira clivagem bissecta os lados do animal e vegetal, resultando em um embrião de oito células. Neste ponto, há quatro blastômeros animais [esquerda e direita ventral(V1) e dorsal (D1)] e quatro blastómeros vegetais [ventral esquerda e direita (V2) e dorsal (D2)] (Figura 2B e Figura 3B).
   1. Localize os blastômeros, vegetais ventral (V2). Estes blastómeros contribuir mais para o rim desenvolvimento de quaisquer outras células nesta fase (Figura 2B). Para atingir o rim esquerdo de um embrião de 8 células, injetar no blastomere deixou V2 (Figura 3B e Seção 3).
7. Observe que os quarto e quinto clivagens bissetriz os blastômeros animais e vegetais. Dois descendentes são geradas a partir de cada um blastómero, resultando em um embrião de 16 células. As células são nomeados após a sua antecessora. Por exemplo, o V2 blast�ero a partir da fase de 8 células dá origem a progénie V2.1 e V2.2 na etapa de 16 células (Figura 2C). A célula V2.2 no estágio de 16 células fornece a maior parte das células que contribuem para o desenvolvimento renal.
8. Observe os sexto e sétimo clivagens resultar em uma Embry 32 célulaso. Mais uma vez, dois descendentes são gerados a partir de cada blastomere, que são nomeados após a sua antecessora. Por exemplo, o blast�ero V2.2 a partir do estágio de 16 células dá origem a V2.2.1 e V2.2.2 na fase de 32 células. Existe um sistema de nomenclatura alternativa na fase de 32 células em que as células são identificados em quatro linhas como A, B, C, e D (de animal para vegetal), e em quatro colunas como 1, 2, 3, e 4 ( de dorsal para ventral). Assim, o blastomere V2.2.2, o que mais contribui para as pronephros em desenvolvimento, é chamado C3 sob este sistema de nomeação alternativo (Figura 2D).

2. Preparação de Embriões

1. Preparar 50 ml de Solução Dejelly (2% de cisteína, NaOH a pH 8,0).
2. Isolar ambos os testículos de um único rã macho de acordo com protocolos padrão ^14. Colocar os testículos em um prato de 60 milímetros de Petri cheio com 10 ml de solução de armazenamento Testículos (1x Marc modificação de Ringer [MMR; 0,1 M de NaCl, KCl 2 mM, MgSO ₄ 1 mM, 2 mMCaCl _2, 5 mM de HEPES, pH 8, EDTA 0,1 mM] ^12, 1% de albumina de soro bovino, 50 ug / ml de gentamicina). Armazenar os testículos a 4 ° C.
   Nota: Testículos pode ser armazenado por cerca de 7-10 dias a 4 ° C, mas a eficiência de fertilização irá diminuir o tempo os testículos foram armazenados.
3. Espremer um sapo fêmea para obter ovos de acordo com protocolos padrão ^14. Recolher os ovos em um 100 milímetros placa de Petri. Deitar fora qualquer excesso de água.
4. Cortado ¼ de um testículo enquanto ele está em Testes solução de armazenamento usando uma pinça e uma lâmina de barbear. Transferir o pedaço de testículo para a placa de Petri contendo os ovos. Ajustar o tamanho da porção de testículo usado para contabilizar o tamanho do testículo, quanto tempo o testículo foi armazenado, e quantos os ovos devem ser fertilizado. Geralmente usam ¼ a 1/3 de um testículo recém-dissecados para fertilizar uma ninhada de ovos.
5. Corte a parte de testículo em pedaços pequenos usando uma pinça e uma lâmina de barbear. Adicionar o suficiente MMR 0,3x+ 30 mg / ml de gentamicina para a placa de Petri para cobrir os ovos. Agitar o MMR no prato para misturar.
6. Aguarde cerca de 30 min para a fertilização ocorra à temperatura ambiente. Note-se que o hemisfério animais (pigmentado do lado do embrião) ficará por cima do embrião sobre a fertilização eficaz. Em seguida, retire a MMR a partir da placa de Petri com uma pipeta de transferência. Adicionar solução Dejelly suficiente para o prato para cobrir os embriões.
7. Ao longo dos próximos minutos, rode suavemente o prato de forma intermitente. A agitação vigorosa do prato neste momento pode causar defeitos de eixo.   O casaco de geléia sobre os embriões se dissolverá, e os embriões se reúnem no centro do prato durante a roda. Uma vez que os embriões são intimamente tocar uns aos outros no centro do prato, remover a solução Dejelly com uma pipeta de transferência. Não deixe embriões na solução Dejelly por mais de 5 minutos, ou os embriões podem ser danificados.
8. Lavar os embriões dejellied 3 - 5 vezes em 0,3XMMR + 30 mg / ml de gentamicina com cuidado derramamento ou pipetagem fora da MMR e enchendo o prato com nova MMR. Não remova todo o MMR do prato, ou os embriões podem ser danificados.
9. Remova todos os ovos não fertilizados ou pedaços de testículo da placa de Petri com uma pipeta de transferência.
10. Incubar embriões entre 14 e 22 ° C.
    Nota: Os embriões cultivados a temperaturas mais baixas desenvolver mais lentamente do que os embriões cultivados a temperaturas mais elevadas. O sincronismo de fases de desenvolvimento pode ser encontrado no Xenbase ^22.
    1. Para espaço para o seu desenvolvimento, lugar de metade dos embriões a partir de uma única fertilização em uma placa de Petri mantida a 14 ° C, e a outra metade dos embriões em uma placa de Petri mantida a 18 ° C. Isto permite que dois conjuntos de injecções em embriões de 4-celulares ou células-8 a partir de um único fertilização.

3. Preparação de soluções de injecção e microinjecção de embriões

1. Prepare a solução para injecção contendo 0,01ng / nl de proteína ligada à membrana fluorescente vermelha (RFP-MEM) ARNm de ^9, enquanto que os embriões estão em desenvolvimento para o estágio de 4 células ou de 8 células. Armazenar a solução injectável em gelo até estar pronto para injetar.
2. Carregar um "tubo capilar de vidro de substituição em um extrator de agulhas, com a parte superior do tubo de substituição alinhado com a parte superior da caixa de agulha extrator. Defina o valor de calor # 2 a 800, eo valor de puxar para 650. Pressione o botão" 7 puxe "botão para retirar a agulha. Isto irá criar 2 agulhas de um único 7" tubo capilar de vidro.
3. Cortando a ponta de uma agulha puxado com um par de fórceps Dumont.
   Nota: Depois de puxar a agulha, a dica é selada e deve ser cortado. Quanto mais próximo da ponta da agulha que é cortada, quanto menor for o diâmetro da ponta da agulha será. Embora o diâmetro da ponta não afectará o volume de injecção com o sistema de microinjecção utilizado aqui, uma ponta com um diâmetro maior é mais susceptível de danificar o embrião.
4. Deslize o mCollet icropipette na parte de trás da agulha. Em seguida, deslizar o orifício grande junta tórica para a parte de trás da agulha atrás da pinça.
5. Encha a agulha com óleo mineral utilizando uma agulha hipodérmica de calibre 27, com cuidado para não obter bolhas de ar na agulha.
6. Deslizamento da agulha para o êmbolo da microinjetor, assentando a agulha no orifício grande do espaçador de plástico branco instalado no êmbolo. O êmbolo deve ter um pequeno anel de vedação mais próxima do corpo do microinjetor, seguido pelo espaçador branco, grande furo O-ring, e Collet. Fixe a agulha pelo aperto da pinça. Puxe suavemente a agulha para se certificar de que está devidamente protegidas.
7. Pressione e segure o botão "vazio" na caixa de controle microinjetor até há dois sinais sonoros.
8. Pipeta 3 uL de solução de injecção sobre um pedaço de Parafilm. Inserir a ponta da agulha para o talão da solução de injecção sobre o Parafilm. Pressione e segure o botão "preencher" no microinjector caixa de controlo para extrair a solução de injecção para dentro da agulha.
9. Encher um prato de 60 milímetros de Petri revestidas com 500 micra de malha de poliéster com 5% de Ficoll em 0,3x MMR + 30 mg / ml de gentamicina. Cuidadosamente Pipetar 20 - 30 4-celulares ou células de embriões de 8 no prato.
10. Utilizando uma ansa de cabelo ^14, manipular os embriões de modo que a blastómero para ser injectado está de frente para a agulha. Para atingir o rim esquerdo, alinhar os embriões de modo que os blastómeros ventral esquerdo de embriões 4-celulares ou as restantes blastómeros V2 de embriões de 8 células enfrentam a agulha.
11. Injectar 10 nl de uma solução de injecção no blast�ero seleccionado de cada embrião no prato.
    Nota: A malha na parte inferior da placa de Petri estabiliza os embriões e os impede de laminagem, permitindo-lhes ser injectado, sem a utilização de um circuito de cabelo para a estabilização.
12. Transferência de embriões injectados nos poços de uma placa de cultura que foram preenchidos com 5% de Ficoll em 0,3x MMR + 30 mg / ml de gentamicina. Incubar a embriões injectadoss a 16 ° C durante pelo menos uma hora para permitir que os blastómeros injectados para curar.
13. Transferir os embriões curadas em poços de uma nova placa de cultura que tenham sido cheios com 0,3x MMR + 30 mg / ml de gentamicina por etapa 9 (antes da gastrulação).
14. Incubar os embriões a 14-22 ° C, até atingir os embriões fase 38-40 ^21.

4. Fixação e imunocoloração de Embriões

1. Preparar 50 ml de sulfato de MOPS / EGTA / magnésio / Formaldeído buffer [MEMFA: MOPS 100 mM (pH 7,4), EGTA 2 mM, 1 mM de _MgSO4, 3,7% (v / v) de formaldeído].
2. Usando uma pipeta de transferência, colocado de 10 - 20 etapa 38 - 40 embriões num frasco de vidro. Adicionar 10 ul de 5% de benzocaína em etanol a 100% para o frasco e do frasco invertido para misturar. Aguarde 10 minutos para anestesiar os embriões.
3. Remover o MMR do frasco utilizando uma pipeta de vidro. Se o processamento de vários frascos ao mesmo tempo, os frascos podem ser mantidos na posição vertical em uma placa de cultura celular de 24 poços.
4. Com um tubo de vidroTTE, encher o frasco com MEMFA. Colocar o frasco numa plataforma oscilante tridimensional durante 1 h à temperatura ambiente.
5. Remover o MEMFA do frasco utilizando uma pipeta de vidro. Encha o frasco com 100% de metanol. Colocar o frasco numa plataforma oscilante tridimensional durante 10 min à temperatura ambiente. Repetir esta etapa de lavagem mais uma vez, e armazenar os embriões em 100% de metanol durante a noite a -20 ° C.
6. Prepare 1x Solução Salina Tamponada com Fosfato-Albumina de Soro Bovino Triton-(PBT): 1x PBS, 2 mg / ml de albumina de soro bovino, 0,1% de Triton X-100.
7. Preparar a solução de anticorpo primário: 1x PBT com soro de cabra a 10%, com uma diluição 1: 5 do anticorpo monoclonal de ratinho 4A6 anticorpo (para etiquetar as membranas do intermediário, distais e túbulos de ligação ^20), uma diluição de anticorpo monoclonal de ratinho 3G8 01:30 (a etiqueta lúmen dos túbulos proximais ²⁰⁾ e uma diluição 1: 250 de anticorpo policlonal de coelho RFP (para marcar o marcador MEM-RFP). Armazenar a 4 ° C.
8. Prepare o secondaA solução de anticorpo RY: 1x PBT com soro de cabra a 10%, 1: 500 Alexa IgG 488 de cabra anti-ratinho (concentração de caldo de 2 mg / ml; a etiqueta 4A6 e 3G8), e 1: anti-IgG de coelho 500 Alexa 555 cabra (estoque concentração de 2 mg / ml; para marcar o marcador MEM-RFP). Armazenar a 4 ° C, cobrindo o tubo em folha para proteger da luz.
9. Em alternativa, recolher os anticorpos primário e secundário, após coloração, e guardar a 4 ° C para reutilização em experiências futuras. Se o anticorpo é para ser salvo para reutilização, adicionar 0,01% de azida de sódio.
10. Imunocoloração os embriões utilizando protocolos estabelecidos ^18.

5. Visualização de Embriões e Análise de Targeted Tissue Pronephric

1. Peneirar os embriões imunocoradas para verificar que o blast�ero correcto foi injectado através da visualização da fluorescência do marcador fluorescente sob um estereomicroscópio em 1X (para visualizar embrião inteiro) e 5X (para ler rim) de ampliação. embriões lugar em uma placa de vidro multi-bem com o quells cheios com 1x PBT utilizando uma pipeta de transferência com a ponta cortada. Manipular os embriões com um laço de cabelo. Utilizar apenas os embriões que possuem o marcador co-injectado presente nas pronephros no lado esquerdo do embrião (figura 3C, F e Figura 4C, F) para a sobre-expressão do gene ou análise knockdown.
2. Alternativamente, limpar os embriões no de Murray claro (2 partes de benzoato de benzilo: uma parte do álcool benzílico), colocando os embriões num frasco de vidro e enchimento do frasco com Murray claro. Visualize os embriões utilizando uma placa de vidro.
   Nota: Murray Clear é um solvente orgânico, e devem ser manuseados com cuidado. Usar luvas, e só usar frascos de vidro e pipetas com Murray Clear.
3. embriões armazenar a 4 ° C em 1x PBT durante 2 - 3 semanas. Para armazenamento a longo prazo de embriões, os embriões desidratar por lavagem duas vezes em 100% de metanol à temperatura ambiente durante 10 min. Armazenar os embriões a -20 ° C em metanol a 100%.

Resultados

Microinjeções de 4 e 8 células de embriões de Xenopus com MEM-RFP mRNA mostram diferentes níveis de segmentação para os pronephros. A Figura 4 mostra estágio 40 embriões com MEM-RFP padrões de expressão de mRNA corretas. Os embriões foram injectados na blast�ero ventral esquerdo (Figura 4A), e classificadas para o padrão de expressão adequada de ARNm de MEM-RFP. Além de expressar MEM-RFP no sentido proximal, intermédio e dis...

Discussão

Segmentação as pronephros de desenvolvimento de embriões de Xenopus se baseia na identificação e injetar o blastomere correta. A injecção do blastómero V2 embriões de 8 células alvo os pronephros esquerda ^18. Isso deixa os pronephros direito contralateral como um controlo interno. Se morfolino knockdown ou sobre-expressão de ARN é utilizada para alterar o desenvolvimento do rim, os pronephros direito contralaterais pode ser usado para comparar os efeitos de silenciamento de genes ou a sob...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Fisher	S271-3
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Magnesium sulfate	Fisher	M63-500
Calcium chloride	Fisher	C79-500
HEPES	Fisher	BP310-500
EDTA	Fisher	S311-500
Gentamycin solution, 50 mg/ml	Amresco	E737-20ML
L-Cysteine, 99%+	Acros Organics	52-90-4
Ficoll	Fisher	BP525-100
100 mm x 15 mm Petri dish	Fisher	FB0875712
Mini Fridge II	Boekel	260009	Benchtop incubator for embryos.
Gap43-RFP plasmid			For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006.
Rhodamine dextran, 10,000 M.W.	Invitrogen	D1817	Tracer.
Molecular biology grade, USP sterile purified water	Corning	46-000-CI
7" Drummond replacement tubes	Drummond	3-000-203-G/XL	Microinjection needles.
Needle puller	Sutter Instruments	P-30
Fine forceps	Dumont	11252-30	For breaking microinjection needle tip.
Nanoject II	Drummond	3-000-204	Microinjector.
Mineral oil, heavy	Fisher	CAS 8042-47-5	Oil for needles.
27 G Monoject hypodermic needle	Covidien	8881200508	For loading mineral oil into microinjection needle.
5 ml Luer-Lok syringe	BD	309646	For loading mineral oil into microinjection needle.
60 mm x 15 mm Petri dish	Fisher	FB0875713A
800 micron Polyester mesh	Small Parts	CMY-0800-C
Transfer pipets	Fisher	13-711-7M	For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette.
6-well cell culture plate	Nest Biotechnology
MOPS	Fisher	BP308-500
EGTA	Acros Organics	67-42-5
Formaldehyde	Fisher	BP531-500
15 mm x 45 mm Screw thread vial	Fisher	03-339-25B	For fixing, staining, and storing embryos.
24-well cell Culture plate	Nest Biotechnology
Benzocaine	Spectrum	BE130
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Methanol	Fisher	A412-4
Phosphate buffered saline (PBS) 1x powder	Fisher	BP661-50
Bovine serum albumen	Fisher	BP1600-100
Triton X-100	Fisher	BP151-500
3D Mini rocker, model 135	Denville Scientific	57281
Goat serum, New Zealand origin	Invitrogen	16210064
Sodium azide	Fisher	S227I-25
Monoclonal 3G8 antibody	European Xenopus Resource Centre		Primary antibody to label proximal tubules.
Monoclonal 4A6 antibody	European Xenopus Resource Centre		Primary antibody to label intermediate, distal and connecting tubules.
anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit	MBL	PM005	Primary antibody to label Gap43-RFP tracer.
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG	Life Technologies	A11001	Secondary antibody to label kidney tubules.
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies	A21428	Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer.
9 Cavity spot plate	Corning	7220-85
Benzyl benzoate	Fisher	105862500	Optional - for clearing embryos
Benzyl alcohol	Fisher	A396-500	Optional - for clearing embryos