JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

In this work we provide an experimental workflow of how active enhancers can be identified and experimentally validated.

Abstract

التطور الجنيني هي عملية متعددة الخطوات التي تنطوي على التنشيط وقمع العديد من الجينات. ومن المعروف أن عناصر محسن في الجينوم للمساهمة في الأنسجة والخلايا من نوع قواعد محددة في التعبير الجيني أثناء تمايز الخلايا. وهكذا، وتحديد وإجراء مزيد من التحقيق مهم من أجل فهم كيفية تحديد مصير الخلية. تكامل البيانات التعبير الجيني (على سبيل المثال، ميكروأري أو RNA وما يليها)، ونتائج لونين مناعي (رقاقة) المستندة إلى دراسات الجينوم على نطاق (رقاقة وما يليها) يسمح بتحديد نطاق واسع في هذه المناطق التنظيمية. ومع ذلك، التحقق من صحة وظيفية من الخلايا من نوع القدرة محددة يتطلب المزيد في المختبر والإجراءات التجريبية الجسم الحي. نحن هنا تصف كيف يمكن تحديد القدرة الفعالة والتحقق من صحتها تجريبيا. وينص هذا البروتوكول على سير العمل خطوة بخطوة تشمل ما يلي: 1) تحديد المناطق التنظيمية من خلال تحليل البيانات الشذرة وما يليها، 2) الاستنساخ وEXPERالتحقق من صحة imental من الإمكانات التنظيمية المفترضة للتسلسل الجينوم المحددة في مقايسة مراسل، و 3) تحديد النشاط محسن في الجسم الحي عن طريق قياس مستوى نسخة محسن الحمض النووي الريبي. وترد تفاصيل بروتوكول قدمت ما يكفي لمساعدة أي شخص لإعداد هذا العمل في المختبر. وجدير بالذكر أن بروتوكول يمكن أن تتكيف بسهولة واستخدامها في أي نظام نموذجي الخلوية.

Introduction

Development of a multicellular organism requires precisely regulated expression of thousands of genes across developing tissues. Regulation of gene expression is accomplished in large part by enhancers. Enhancers are short non-coding DNA elements that can be bound with transcription factors (TFs) and act from a distance to activate transcription of a target gene1. Enhancers are generally cis-acting and most frequently found just upstream of the transcription start site (TSS), but recent studies also described examples where enhancers were found much further upstream, on the 3' of the gene or even within the introns and exons2.

There are hundreds of thousands of potential enhancers in the vertebrate genomes1. Recent methods based on chromatin immunoprecipitation (ChIP) provide high-throughput data of the whole genome that can be used for enhancer analysis3-9. Though data obtained by ChIP-seq experiments greatly increases the likelihood to identify cell and tissue-specific enhancers, it is important to keep in mind that detected binding sites do not necessarily identify direct DNA binding and/or functional enhancers. Thus, further functional analysis of newly identified enhancers is indispensable. In this work, we present a basic three-step process of putative active enhancer identification and validation. This includes: 1) selection of putative transcription factor binding sites by bioinformatics analysis of ChIP-seq data, 2) cloning and validation of these regulatory sequences in reporter constructs, and 3) measurement of enhancer RNA (eRNA).

Exposure of embryonic stem (ES) cells to retinoic acid (RA) is frequently used to promote neural differentiation of the pluripotent cells 10. RA exerts its effects by binding to RA receptors (RARα, β, γ) and retinoid X receptors (RXRα, β, γ). RARs and RXRs in a form of heterodimer bind to DNA motifs called RA-response elements, that is typically arranged as direct repeats of AGGTCA sequence (called as half site) and regulate transcription. Ligand-treatment experiments allowed the identification of several retinoic acid regulated genes in ES cells 11,12. However, enhancer elements for many of these genes has not been described yet. To demonstrate how the here-described workflow can be used for enhancer identification and validation we show step-by-step the selection and characterization of two retinoic acid-dependent enhancers in embryonic stem cells.

Protocol

1. محسن الاختيار على أساس تحليل رقاقة وما يليها

  1. تحميل RXR رقاقة وما يليها ملف الخام fastq البيانات (mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz) من http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
  2. تحميل واستخراج ملف الفهرس التحالف اللازمة لمحاذاة (في حالتنا: Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz
    ملاحظة: زيارة لhttps://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts لمزيد من المعلومات حول خطوات تحليل المعلومات البيولوجية ولتحميل البرامج النصية المستخدمة أدناه.
  3. محاذاة ملف سبيل المثال fastq إلى الجينوم MM10 (استخدام البرنامج النصي: perform_alignment.sh). هذا سيخلق مجلد مع ملف .bam وإحصائيات والمحاذاة. محاذاة RXR البيانات الشذرة وما يليها (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam)، وملف الفهرس المطابق (.bai) متوفرة هنا:
    http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
    ملاحظة: التحالف هو مجموعة من البرامج التي تؤيد RELAتسلسل قصيرة نسبيا (على سبيل المثال، رقاقة وما يليها النتائج) إلى قاعدة بيانات تسلسل، مثل الجينوم إشارة الماوس (على سبيل المثال، MM10) 13.
  4. تشغيل البرنامج النصي (callpeaks.sh) لذروة الدعوة ودي نوفو تحليل عزر. استخدام ملف .bam كإدخال. ويستند البرنامج النصي على هوميروس findPeaks 14.
    ملاحظة: ملفات الإخراج تعطينا معلومات حول العدد الإجمالي للقمم، والإثراء من الزخارف، نسبة للخلفية، وتسلسل الهدف بزخارف، وما إلى ذلك. (الشكل 1). وعادة ما يتم سرد عدة زخارف في ترتيب أهميتها.
  5. إعادة رسم خريطة رقم 1 في المرتبة عزر (NR نصف `AGGTCA`) (استخدام البرنامج النصي: remap_motif.sh)
    ملاحظة: ونتيجة لذلك، والسيناريو بإنشاء ملف .bed التي سوف تظهر التي الشذرة قمم تغطي مناطق الجينوم التي تحتوي على الموقع الكنسي ملزم للعامل النسخ من الفائدة.
  6. تحميل وتصور نتائج RXR يقرأ رقاقة وما يليها الانحياز (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam (أيضا تحميل .bai)) وتواجد AGGTCA عزر (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) من خلال التكاملية الجينوم عارض (IGV) 15 لتحديد RAR المفترضة / مواقع الربط RXR (الشكل 2 والشكل 3).
    ملاحظة: سوف دمج مختلف البيانات الشذرة وما يليها يساعد على التنبؤ بدقة أكثر والقدرة على مرشح جيدة 16،17. وكشفت الدراسات الحديثة أن القدرة النشطة عادة المخصب لP300 وترتبط مع H3K4me1 وH3K27ac، وتقع في المناطق ونين مفتوحة، وبالتالي عرض الدناز-I فرط الحساسية ويوصى أيضا 18-21.
  7. استخدام "تحديد المنطقة ذات الاهتمام" في IGV 15 للحصول على 200-400 تسلسل الغليان في المنطقة الجينومية المحدد واستخدام هذه المتتاليات للتصاميم التمهيدي لاحقة.

2. مراسل الفحص

ملاحظة: يتم استخدام نظام وسيفيرين / وسيفيرازكما مقايسة مراسل حساس جدا لتنظيم النسخي. اعتمادا على انزيم وسيفيراز النشاط محسن هو أنتج من شأنها أن تحفز أكسدة وسيفيرين إلى oxyluciferin مما أدى إلى bioluminescense، والتي يمكن الكشف عنها. وكخطوة أولى، ينبغي subcloned تحديد تسلسل محسن المفترضة في ناقلات مراسل (على سبيل المثال، TK-luciferase المراسل 22، pGL3 أو NanoLuc).

  1. التصميم التمهيدي
    1. الاشعال تصميم PCR لتضخيم من 200-400 نقطة أساس من المناطق محسن المفترضة التي كتبها Primer3 (متوفر هنا: http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23
    2. نسخ لصق التسلسل الجيني من IGV يتضمن الموقع المفترض ملزم في Primer3 (راجع الخطوة 1.7). مجموعة نطاق حجم المنتج إلى 250-300 نقطة أساس في Primer3.
    3. التحقق من صحة الاشعال PCR باستخدام متصفح UCSC الجينوم هو في سيليكون أداة PCR (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) 24
      ملاحظة: هذا البروتوكول في خطوة لاحقة يستخدم HindIIأنا وBamHI تقييد الانزيمات للاستنساخ. تحقق ما إذا كان PCR تضخيم التسلسل كما كان متوقعا من قبل أداة PCR UCSC في وسيليكون وسوف تحتوي على مواقع تقييد AAGCTT أو GGATCC (على سبيل المثال، http://nc2.neb.com/NEBcutter2/).
    4. الحصول على الاشعال المطلوبة من بائع التجاري.
  2. PCR التضخيم من محسن تسلسل من الحمض النووي الجيني
    1. تنقية الحمض النووي الجيني قالب من الخلايا الأولية (على سبيل المثال، الخلايا الليفية الجنينية الأولية). استخدام عدة التجارية لgDNA العزلة واتبع تعليمات الشركة الصانعة.
      ملاحظة: جودة عالية من gDNA أمر ضروري لنجاح التضخيم PCR. استنساخ BAC مناسبة يمكن استخدامها اذا PCR ليست سهلة من gDNA.
    2. إعداد 50 ميكرولتر PCR رد فعل تحتوي على 100 ​​نانوغرام gDNA، 5 ميكرولتر العازلة 10X، و 3 ميكرولتر MgSO 4 (25 مم)، و 5 ميكرولتر dNTP (2 مم لكل منهما)، و 1.5 ميكرولتر إعادة توجيه التمهيدي (10 ميكرون)، 1.5 ميكرولتر القس التمهيدي (10 ميكرومتر) ، 1 ميكرولتر بوليميريز الحمض النووي
      ملاحظة: استخدام عالية الدقة الحمض النووي بوليميريز مع معدل خطأ منخفض لردود الفعل PCR.
    3. تعيين دورة PCR (2 دقيقة 95 درجة مئوية، (20 ثانية 95 درجة مئوية، 10 ثانية 58-65 درجة مئوية، 18 ثانية 70 درجة مئوية) X25 تكرار، 2 دقيقة 70 درجة مئوية، وإلى الأبد 4 درجة مئوية). ضبط درجة الحرارة الصلب مع النظر في التمهيدي وتوقعت القيم تيم.
    4. تنقية المنتج PCR مع عدة تنقية PCR التجارية واتباع تعليمات الشركة الصانعة.
    5. يعرض مواقع تقييد لاستنساخ بتكرار PCR مع الاشعال المستخدمة أعلاه، ولكن بإضافة يتدلى على هم 5 'الغايات (على سبيل المثال، إعادة توجيه: 5'-الأتات AAGCTT xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-3 "(HindIII)، القس: 5'-تاتا GGATCC xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx -3 "(BamHI)).
    6. تشغيل 5 ميكرولتر من الناتج PCR على هلام الاغاروز للتحقق من المنتجات PCR غير محددة.
      ملاحظة: إذا تم الكشف عن المزيد من العصابات، وتشغيل المنتج PCR كامل وتنقية الفرقة المناسبة من قبل مجموعة استخراج الهلام التجارية.
    7. تقييد
      ملاحظة: لاستنساخ إدراج المنبع المعارف التقليدية المروج 22 في PCR المنتج المنقى وناقلات (على سبيل المثال، TK-لوك) يجب أن يتفاعل مع HindIII وBamHI.
      1. إعداد خليط التفاعل 50 ميكرولتر تحتوي على 1 ميكروغرام تنقية المنتج PCR، 1 HindIII ميكرولتر (20 U / ميكرولتر)، 1 ميكرولتر BamHI (20 U / ميكرولتر) و 5 ميكرولتر 10X العازلة.
      2. إعداد 250 ميكرولتر خليط التفاعل التي تحتوي على ناقل 5μg (TK لوك، أو ناقلات مراسل البديل)، 5 ميكرولتر HindIII (20 U / ميكرولتر)، 5 ميكرولتر BamHI (20 U / ميكرولتر)، 5 ميكرولتر للحرارة الفوسفاتاز القلوية (1 يو / ميكرولتر) و25 ميكرولتر 10X العازلة.
        ملاحظة: العلاج AP متجه يقلل إلى حد كبير من الربط الذاتي للناقل واحد هضمها، وبالتالي الخلفية.
      3. احتضان مخاليط رد فعل لمدة 4 ساعة على 37 درجة مئوية، ثم تنقية المنتجات PCR هضمها وناقلات مع عدة تنقية PCR التجارية.
    8. Ligatioن
      1. إعداد رد فعل للربط في أنابيب PCR بما في ذلك 2 ميكرولتر 10X T4 عازلة الحمض النووي يغاز، 10 نانوغرام TK-لوك ناقلات، إدراج 50 نانوغرام (هضم المنتج PCR)، 1 ميكرولتر T4 DNA يغاز (400 U / ميكرولتر) وnuclease خالية من المياه ما يصل الى 20 ميكرولتر.
        ملاحظة: إعداد سيطرة سلبية حيث لا يحتوي على رد فعل إدراج.
      2. المزيج بلطف على رد فعل من قبل pipetting صعودا وهبوطا، وتدور باستمرار لفترة وجيزة أنابيب PCR باستخدام مصغرة الطرد المركزي ثم في احتضان RT لمدة 10 دقيقة.
      3. الحرارة تعطيل عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ثم البرد على الجليد واستخدم 5 ميكرولتر من المنتج للتحول إلى 50 ميكرولتر الخلايا المختصة (على سبيل المثال، DH5α).
      4. استخدام معيار إجراء الصدمة الحرارية لتحويل البكتيريا، والتقاط المستعمرات وعزل DNA البلازميد مع مجموعة تجارية. التحقق من صحة كافة بنيات بواسطة تسلسل قبل الخطوات المقبلة.
    9. ترنسفكأيشن من خلايا ES
      1. استخدام لوحات 48-جيدا. إضافة 200 ميكرولتر الجيلاتين 0.1٪ solutأيون / جيد 30 دقيقة قبل الطلاء الخلية.
      2. لوحة الجذعية الجنينية (ES) خلايا قبل يوم واحد ترنسفكأيشن. استخدام خالية من تغذية وفاق الخلايا ولوحة في كثافة 3 × 10 4 خلايا لكل بئر في 250 ميكرولتر ES سائل الإعلام / جيد.
      3. إعداد يمزج البلازميد (يتم احتساب كل مزيج ل8 آبار، 4 غير المعالجة و 4 الريتينويك تعامل حامض) مزيج 1: 1250 نانوغرام TK-لوك فارغة (المراقبة السلبية)، 950 نانوغرام β غالاكتوزيداز الترميز ناقلات (βGal)، ميكس 2 : 1250 نانوغرام TK-لوك Hoxa1 محسن (مراقبة إيجابية)، 950 نانوغرام βGal، ميكس 3: 1250 نانوغرام TK-لوك PRMT8 محسن (منطقة الفائدة)، 950 نانوغرام βGal.
        ملاحظة: خلايا ES تعبر عن عوامل النسخ المطلوبة (RAR / RXR). ترك الآبار untransfected لتحديد القيم الأساسية في وقت لاحق خلال القياسات وسيفيراز وβ غالاكتوزيداز.
      4. إضافة نوعية ترنسفكأيشن تخفيض وسائل الاعلام المصل لكل البلازميد خلط إلى 106 ميكرولتر الحجم الكلي (ما يكفي لمدة 8 آبار).
      5. إضافة 4.5 ميكرولتر ES جودة transfectأيون كاشف ثم المزيج بعناية من قبل pipetting 15 مرة صعودا وهبوطا. احتضان هذا المزيج ترنسفكأيشن لمدة 10 دقيقة في RT.
      6. إضافة 13 ميكرولتر من مزيج ترنسفكأيشن إلى الخلايا لكل بئر، مزيج دقيق من قبل pipetting. وضع الخلايا مرة أخرى في حاضنة (37 ° C) O / N قبل العلاج يجند.
      7. إزالة وسائل الاعلام بعناية من قبل تطلع من الخلايا وإضافة 250 ميكرولتر الطازجة وسائل الإعلام / جيد يحتوي على ،01-1 ميكرومتر جميع العابر حمض الريتينويك (RA)، والتركيز النهائي أو DMSO كما مركبة. احتضان الخلايا لمدة 24 - 48 ساعة.
        ملاحظة: حمض الريتينويك خفيف حساسة.
    10. إعداد الخلية لست]
      1. تمييع 5X الاحتياطي تحلل (1.25 مل 0.5 M تريس درجة الحموضة = 7.8، 1 مل 1 M dithiothreitol (DTT) (في H 2 O)، 10 مل 0.1 M EDTA الرقم الهيدروجيني = 8.0، 50 مل الجلسرين، 5 مل تريتون X-100، عقيم الماء تصل إلى 100 مل) ل1X باستخدام الماء المعقم، إضافة 20 ميكرولتر 1 M DTT / 10 مل وتتوازن إلى RT قبل الاستخدام. إعداد 10 مل لوحة 48-جيدا في يوم الفحص.
      2. إزالة وسائل الاعلام بعناية من قبل تطلع من الخلايا. شطف خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X. إضافة 200 ميكرولتر 1X الاحتياطي تحلل / جيد مباشرة إلى الخلايا.
      3. يهز لمدة 2 ساعة على RT (تحلل المواد الكيميائية). تجميد الخلية لست] على لوحة عند -80 درجة مئوية (تحلل الميكانيكية). ويمكن تخزين لست] في -80 درجة مئوية لعدة أيام.
      4. ذوبان الجليد لست]. بعد ذوبان كامل، نقل الخلية لست] لوحة 96-جيدا باستخدام ماصة الأقنية الإلكترونية. نقل 80 ميكرولتر من المحللة خلية لوحة 96 جيدا واضحة لفحص β غالاكتوزيداز و 40 ميكرولتر من المحللة الخلية إلى لوحة بيضاء لقياس وسيفيراز. تجنب تشكيل أي فقاعات.
    11. β غالاكتوزيداز الفحص
      ملاحظة: غالاكتوزيداز بيتا أو صحفيين الثاني البديل يجب أن تستخدم الرقابة الداخلية لمراعاة الاختلافات تجريبية غير محددة.
      1. إعداد عازلة الركيزة بيتا غالاكتوزيداز: 80.0 ز نا 2 هبو 4 • 7H 2 O،3.8 غ ناه 2 ص 4 • H 2 O، 30.0 ز بوكل، 1.0 غرام MgSO 4 • 7H 2 O، وجعل ما يصل الى 1000 مل مع الماء المعقم. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4. تصفية تعقيم (0.2 ميكرون) وتخزينها في 4 درجات مئوية
      2. مزيج عازلة الركيزة 1 مل β غالاكتوزيداز مع 4 ملغ ONPG (س-nitrophenyl-β-D-غالاكتوزيداز). إضافة 3.5 ميكرولتر من 2 المركابتويثانول (βME) لكل 1 مل من العازلة قبل الاستخدام. إضافة 100 ميكرولتر β غالاكتوزيداز عازلة الركيزة إلى 80 المحللة خلية ميكرولتر.
      3. احتضان ردود الفعل عند 37 درجة مئوية حتى وضعت اللون الأصفر الخافت. قراءة الامتصاصية في OD 420 نانومتر على قارئ لوحة وتصدير البيانات.
        ملاحظة: المرة تختلف تبعا للكفاءة ترنسفكأيشن، وعادة لا تزيد عن 30 دقيقة.
    12. الفحص وسيفيراز
      1. تجهيز 50 مل وسيفيرين الركيزة كاشف: 15.1 ملغ-D وسيفيرين الملح، 82.7 ملغ الملح اعبي التنس المحترفين، 185 ملغ MgSO 4 • 7H 2 O، إضافة إلى 50 مل أنبوب البولي بروبلين،ثم يضاف 1.5 مل العازلة 1 M HEPES، 48.5 مل ATP المياه مجانا، دوامة، تأكد من أن جميع المركبات تذوب تماما. إبقاء 5-10 مل aliquots في -80 درجة مئوية.
      2. حارة 5 مل وسيفيرين الركيزة كاشف لRT قبل البدء. ماصة 100 ميكرولتر الركيزة الكاشف إلى كل بئر من لوحة بيضاء تحتوي على 40 ميكرولتر من المحللة الخلية وقياس إشارة فورا باستخدام جهاز الانارة المضاد.
      3. الحصول الأنشطة من ثلاثة على الأقل تجارب مستقلة في تعداء ثلاث نسخ.
      4. حساب لأول مرة قاعدة luciferase النشاط تطبيع وقاعدة تطبيع القيم β غالاكتوزيداز لكل بئر بطرح متوسط ​​القيم المقاسة للخلايا غير transfected من كل قيمة قياس. ثم حساب نسبة luciferase النشاط / β غالاكتوزيداز.

    3. توصيف محسن RNA

    ملاحظة: مؤشر أكثر مباشرة النشاط محسن برز من الجينوم ث الأخيرةدراسات بيئة تطوير متكاملة حددت العديد من قصيرة الرنا غير الترميز، وتتراوح في حجمها من 50 إلى 2000 الإقليم الشمالي، والتي يتم نسخها من القدرة، ويسمى الرنا محسن (eRNAs) 16،25،26 (الشكل 4). إرنا تحريض يرتبط إلى حد كبير مع تحريض الجينات الترميز اكسون المجاورة. وهكذا، والنشاط محسن تعتمد على إشارة يمكن كميا في الجسم الحي بمقارنة إنتاج إرنا بين مختلف الظروف التي كتبها RT-QPCR.

    1. المبادئ التوجيهية لتصميم التمهيدي للكشف إرنا بواسطة RT-QPCR
      1. تحديد مناطق الجينوم لقياس إرنا أن ما لا يقل عن 1،5-2 كيلو بايت بعيدا عن مواقع بداية النسخ المشروح.
        ملاحظة: الأهم من ذلك، مستويات عالية من النسخ مرنا في القدرة داخل الجين منع التقدير الدقيق إرنا في توجيه المعنى، eRNAs العقاقير في القدرة داخل الجين يمكن كشفها وتتشابه في مستوى لeRNAs في القدرة خارج الجين.
      2. كقاعدة عامة، استخدام المناطق 200 - 1000 بي بي جيئة وذهابام وسط عامل النسخ موقع مصلحة لتصميم التمهيدي إما على حاسة أو حبلا لمكافحة الشعور (الشكل 4) والشكل (6) ملزمة.
        ملاحظة: إذا اللائحة العامة للمنظمة وما يليها، الدناز وما يليها، H3K4me1، H3K4me3 أو بيانات H3K27ac رقاقة وما يليها متاحة من أنواع الخلايا المطلوبة والشروط التي يمكن استخدامها لتصميم التمهيدي أكثر دقة. وكتب eRNAs من المناطق محسن المفترضة تتميز بمستويات عالية من H3K4me1 وME3. التعبير عن eRNAs يرتبط بشكل إيجابي مع إثراء تنشيط علامة محسن هيستون H3K27ac.
      3. الاشعال تصميم PCR لقياس RT-QPCR من eRNAs صبغية الفلورسنت التي كتبها Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23 إنشاء تسلسل مكافحة الشعور (عكس تكملة حبلا معنى) لتصميم التمهيدي حسب: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. إدراج 200-300 نقطة أساس من إحساس أو شعور مكافحة تسلسل التصميم التمهيدي.
    2. قياس إرنا النسخ
      1. عزل الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا المعالجة مع الفينول الحمضية التجاري / القائم على الكلوروفورم استخراج الكاشف وفقا لتوصيات الشركة الصانعة.
      2. استخدام DNaseI لعلاج RNA معزولة قبل استخدامها في رد فعل عكس النسخ. تعطيل الدناز وفقا لتوصية الشركة الصانعة قبل النسخ العكسي.
      3. قياس تركيز الحمض النووي الريبي بعد العلاج الدناز الأول واستخدام 1000 نانوغرام في رد فعل RT. استخدام ذات جودة عالية عكس الناسخ.
        ملاحظة: كما لا يجوز مذيل بعديد الأدينيلات عدد كبير من eRNAs، النسخ العكسي يتطلب استخدام البادئات العشوائية.
      4. كشف كتب العكس إرنا بواسطة RT-QPCR باستخدام الإجراء القياسي. قياس مرنا غير المعتمد على المعاملة للتطبيع (على سبيل المثال، 36B4، Ppia، GAPDH، Actb).

النتائج

استخدمنا RXR الأجسام المضادة لعموم محددة من أجل تحديد الجينات التي التنظيم RA-الجينوم لها تخصيب مستقبلات في قربها. وكشف تحليل المعلومات البيولوجية من البيانات رقاقة وما يليها RXR تم الحصول عليها من خلايا ES تعامل مع حمض الريتينويك في إثراء نصف موقع مستق...

Discussion

In recent years, advances in sequencing technology have allowed large-scale predictions of enhancers in many cell types and tissues 7-9. The workflow described above allows one to perform primary characterization of candidate enhancers chosen based on ChIP-seq data. The detailed steps and notes will help anyone to set up a routine enhancer validation in the lab.

The most critical step in the luciferase reporter assay is the transfection efficiency. It is recommended to include a GFP...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge Dr. Bence Daniel, Matt Peloquin, Dr. Endre Barta, Dr. Balint L Balint and members of the Nagy laboratory for discussions and comments on the manuscript. L.N is supported by grants from the Hungarian Scientific Research Fund (OTKA K100196 and K111941) and co-financed by the European Social Fund and the European Regional Development Fund and Hungarian Brain Research Program - Grant No. KTIA_13_NAP-A-I/9.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
KOD DNA polymeraseMerck Millipore71085-3for PCR amplification of enhancer from gDNA
DNeasy Blood & Tissue kit Qiagen69504for genomic DNA isolation
QIAquick PCR Purification kitQiagen28106for PCR product purification
Gel extraction kit Qiagen28706for gel extraction if there are more PCR product
HindIIINEBR3104Lrestriction enzyme
BamHINEBR3136Lrestriction enzyme
FastAPThermo ScientificEF0651release of 5'- and 3'-phosphate groups from DNA
T4 DNA ligaseNEBM0202for ligation
QIAprep Spin Miniprep kitQiagen27106for plasmid isolation
DMEMGibco31966-021ES media
FBSHycloneSH30070.03ES media
MEM Non-Essential Amino AcidSigmaM7145ES media
Penicillin-StreptomycinSigmaP4333ES media
Beta MercaptoethanolSigmaM6250ES media
FuGENE HD PromegaE2311transfection reagent
Opti-MEM® I Reduced Serum MediumLife Technologies31985-062for transfection
All-trans retinoic acidSigmaR2625ligand, for activation of RAR/RXR
96-well clear plateGreiner655101for Beta galactosidase assay
96-well white plateGreiner655075for Luciferase assay
D-luciferin, potassium saltGoldbio.com115144-35-9for Luciferase assay
ATP saltSigmaA7699-1Gfor Luciferase assay
MgSO4•7H2OSigma230391-25Gfor Luciferase assay
HEPESSigmaH3375-25Gfor Luciferase assay
Na2HPO4 •7H2OSigma431478-50Gfor Beta galactosidase assay
NaH2PO4 •H2OSigmaS9638-25Gfor Beta galactosidase assay
MgSO4•7H2OSigma230391-25Gfor Beta galactosidase assay
KClSigmaP9541-500Gfor Beta galactosidase assay
ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactosidase)SigmaN1127-1Gfor Beta galactosidase assay
TRIzol®Life Technologies15596-026RNA isolation
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitLife Technologies4368814reverse transcription of eRNA
Rnase-free DnasePromegaM6101Dnase treatment
SsoFast Eva GreenBioRad750000105RT-qPCR mastermix
CFX384 Touch™ Real-Time PCR Detection SystemBioRadqPCR machine
BioTek Synergy 4 microplate readerBioTekluminescent counter

References

  1. Wamstad, J. A., Wang, X., Demuren, O. O., Boyer, L. A. Distal enhancers: new insights into heart development and disease. Trends in cell biology. 24, 294-302 (2014).
  2. Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., Bejerano, G. Enhancers: five essential questions. Nat Rev Genet. 14, 288-295 (2013).
  3. Mardis, E. R. ChIP-seq: welcome to the new frontier. Nature methods. 4, 613-614 (2007).
  4. Muller, F., Tora, L. Chromatin and DNA sequences in defining promoters for transcription initiation. Biochim Biophys Acta. 1839, 118-128 (2013).
  5. Ounzain, S., Pedrazzini, T. The promise of enhancer-associated long noncoding RNAs in cardiac regeneration. Trends Cardiovasc Med. , (2015).
  6. Lam, M. T., Li, W., Rosenfeld, M. G., Glass, C. K. Enhancer RNAs and regulated transcriptional programs. Trends Biochem Sci. 39, 170-182 (2014).
  7. Dickel, D. E., et al. Function-based identification of mammalian enhancers using site-specific integration. Nature methods. 11, 566-571 (2014).
  8. Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1. Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).
  9. Vermunt, M. W., et al. Large-scale identification of coregulated enhancer networks in the adult human brain. Cell reports 9. , 767-779 (2014).
  10. Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev Biol. 168, 342-357 (1995).
  11. Mahony, S., et al. Ligand-dependent dynamics of retinoic acid receptor binding during early neurogenesis. Genome Biol. 12 (R2), (2011).
  12. Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Lett. 584, 3123-3130 (2010).
  13. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
  14. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38, 576-589 (2010).
  15. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
  16. Daniel, B., et al. The active enhancer network operated by liganded RXR supports angiogenic activity in macrophages. Genes Dev. 28, 1562-1577 (2013).
  17. Zhu, Y., et al. Predicting enhancer transcription and activity from chromatin modifications. Nucleic Acids Res. 41, 10032-10043 (2013).
  18. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457, 854-858 (2009).
  19. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nat Genet. 39, 311-318 (2007).
  20. Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470, 279-283 (2010).
  21. Bonn, S., et al. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44, 148-156 (2012).
  22. Hollenberg, S. M., Giguere, V., Segui, P., Evans, R. M. Colocalization of DNA-binding and transcriptional activation functions in the human glucocorticoid receptor. Cell. 49, 39-46 (1987).
  23. Untergasser, A., et al. Primer3--new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40, e115 (2012).
  24. Rhead, B., et al. The UCSC Genome Browser database: update 2010. Nucleic Acids Res. 38, D613-D619 (2010).
  25. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465, 182-187 (2010).
  26. Wang, D., et al. Reprogramming transcription by distinct classes of enhancers functionally defined by eRNA. Nature. 474, 390-394 (2011).
  27. Simandi, Z., et al. PRMT1 and PRMT8 regulate retinoic acid-dependent neuronal differentiation with implications to neuropathology. Stem Cells. 33, 726-741 (2014).
  28. Zhou, H. Y., et al. A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential. Genes Dev. 28, 2699-2711 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

112

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved