Tahmin ve Gen Düzenleme Elementlerin Doğrulama Retinoik Asit Kaynaklı Embriyonik sırasında Aktif Hücre Farklılaşma Kök

Özet

In this work we provide an experimental workflow of how active enhancers can be identified and experimentally validated.

Özet

Embriyonik gelişim, birçok genlerin aktivasyonunu ve baskıyı içeren çok aşamalı bir süreçtir. genomu içinde güçlendirici elemanlar hücre farklılaşması esnasında gen sentezlenmesinin doku ve hücre tipi özel düzenlemeye katkıda bulunduğu bilinmektedir. Böylece, kendi kimlik ve daha fazla araştırma hücre kaderi nasıl belirlendiğini anlamak için önemlidir. Gen ifadesi verileri (örneğin, mikrodizi veya RNA-seq) ve kromatin immunoprecipitation (ChIP) tabanlı genom çalışmaları (ChIP-seq) sonuçlarının entegrasyonu bu düzenleyici bölgelerin büyük ölçekli belirlenmesini sağlar. Ancak, hücre türüne özgü arttırıcılar işlevsel doğrulama in vitro ve in vivo deney prosedürü de gerektirir. Burada aktif artırıcılar tespit ve deneysel olarak doğrulanmış nasıl açıklar. ChIP-seq veri analizi, 2) klonlama ve exper tarafından düzenleyici bölgelerin 1) tanımlanması: Bu protokol içeren bir adım-adım iş akışı sağlarimental bir raportör analizinde tanımlanmış olan genom dizilerinin varsayımsal düzenleme potansiyeli doğrulama ve güçlendirici RNA transkript seviyesinin ölçülmesiyle in vivo güçlendirici aktivitesinin 3) belirlenmesi. sunulan protokol laboratuarında bu iş akışını kurmak için kimseye yardımcı olmak için yeterli ayrıntılı. Önemli olarak, iletişim kuralı, kolayca adapte ve herhangi bir hücresel model sistemde kullanılabilir.

Giriş

Development of a multicellular organism requires precisely regulated expression of thousands of genes across developing tissues. Regulation of gene expression is accomplished in large part by enhancers. Enhancers are short non-coding DNA elements that can be bound with transcription factors (TFs) and act from a distance to activate transcription of a target gene¹. Enhancers are generally cis-acting and most frequently found just upstream of the transcription start site (TSS), but recent studies also described examples where enhancers were found much further upstream, on the 3' of the gene or even within the introns and exons².

There are hundreds of thousands of potential enhancers in the vertebrate genomes¹. Recent methods based on chromatin immunoprecipitation (ChIP) provide high-throughput data of the whole genome that can be used for enhancer analysis^3-9. Though data obtained by ChIP-seq experiments greatly increases the likelihood to identify cell and tissue-specific enhancers, it is important to keep in mind that detected binding sites do not necessarily identify direct DNA binding and/or functional enhancers. Thus, further functional analysis of newly identified enhancers is indispensable. In this work, we present a basic three-step process of putative active enhancer identification and validation. This includes: 1) selection of putative transcription factor binding sites by bioinformatics analysis of ChIP-seq data, 2) cloning and validation of these regulatory sequences in reporter constructs, and 3) measurement of enhancer RNA (eRNA).

Exposure of embryonic stem (ES) cells to retinoic acid (RA) is frequently used to promote neural differentiation of the pluripotent cells ¹⁰. RA exerts its effects by binding to RA receptors (RARα, β, γ) and retinoid X receptors (RXRα, β, γ). RARs and RXRs in a form of heterodimer bind to DNA motifs called RA-response elements, that is typically arranged as direct repeats of AGGTCA sequence (called as half site) and regulate transcription. Ligand-treatment experiments allowed the identification of several retinoic acid regulated genes in ES cells ^11,12. However, enhancer elements for many of these genes has not been described yet. To demonstrate how the here-described workflow can be used for enhancer identification and validation we show step-by-step the selection and characterization of two retinoic acid-dependent enhancers in embryonic stem cells.

Protokol

Chip-seq Analiz dayanarak 1. Artırıcı Seçimi

1. http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/ gelen RXR ChIP seq ham veri fastq dosyası (mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz) now
2. Indirin ve bizim durumumuzda (uyum için gerekli BWA dizin dosyası ayıklamak: Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz
   NOT: biyoinformatik analiz aşamaları hakkında daha fazla bilgi için https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts ziyaret ve aşağıda kullanılan komut indirmek için.
3. (: Perform_alignment.sh komut dosyası kullanabilirsiniz) MM10 genomuna örnek fastq dosyasını aynı hizaya getirin. Bu .bam dosyası ve uyum istatistikleri ile bir klasör oluşturur. Bağlantısızlar RXR ChIP-seq veri (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam) ve karşılık gelen dizin dosyası (.bai) burada mevcuttur:
   http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
   NOT: İKD ilgili Ethicon hizalar bir yazılım paketiFare referans genom olarak bir dizi veritabanına nispeten kısa diziler (örneğin, ChIP-seq sonuçları), (örneğin, MM10) ^13.
4. Zirve arama ve de novo motifi analizi için komut (callpeaks.sh) çalıştırın. girdi olarak .bam dosyasını kullanın. Komut Homer findPeaks ¹⁴ dayanır.
   NOT: Çıktı dosyaları bize vb toplam piklerin sayısı, zenginleştirilmesi motifleri, arka yüzdesi ve motiflerle hedef dizilerin, hakkında bilgi verir. (Şekil 1). Genellikle birkaç motifler önemleri sırasına göre listelenir.
5. 1. sırada motifi (NR yarısı `AGGTCA`) eşleştirmek (: remap_motif.sh komut dosyası kullanabilirsiniz)
   NOT: Sonuç olarak, komut ChIP-zirveleri ilgi transkripsiyon faktörü kanonik bağlanma bölgesini ihtiva genomik bölgeleri kapsayan hangi gösteren bir .Yatakta dosyası oluşturur.
6. (Mm_ES_RX indirin ve okur hizalanmış RXR ChIP-seq sonuçları görselleştirmekR_24h_ATRA.bam (ayrıca .bai indirin)) ve Bütünleştirici Genomik Görüntüleyici (IGV) ¹⁵ tarafından AGGTCA motifi oluşumları (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) / varsayılan RAR tespit RXR bağlanma bölgeleri (Şekil 2 ve Şekil 3).
   NOT: Çeşitli ChIP-seq veri entegrasyonu tam iyi bir aday arttırıcılar ^16,17 tahmin daha yardımcı olacaktır. Son çalışmalar, aktif artırıcılar, genellikle P300 için zenginleştirilmiş ve H3K4me1 ve H3K27ac ile ilişkili ve aynı zamanda ^18-21 tavsiye edilir böylece DNaz-I aşırı duyarlılık göstererek, açık kromatin bölgelerde bulunan olduğunu ortaya koydu.
7. Seçilen genomik bölgenin 400 bp dizisi ve sonraki astar tasarımları için bu dizileri kullanmak - 200 elde etmek IGV ¹⁵ "ilgi bir bölge tanımlama" kullanın.

2. Raportör Deneyi

NOT: luciferin / lusiferaz sistemi kullanılmaktadırtranskripsiyonel düzenleme için çok hassas bir muhabir tahlil olarak. güçlendirici aktivitesi, lusiferaz enzim bağlı olarak tespit edilebilir, bioluminescense sonuçlanan oksilusiferin lusiferinin oksidasyonunu katalize olacaktır üretilmektedir. İlk adım olarak, tespit farazi güçlendirici sekansları, bir raportör vektörüne (örneğin, TK-Lusiferaz ²² pGL3 ya NanoLuc) alt-klonlanmıştır olmalıdır.

1. primer Tasarım
   1. ^23: (http://bioinfo.ut.ee/primer3/ mevcuttur Burada) Primer3 ile farazi güçlendirici bölgelerinin 400 bp - 200 amplifikasyonu için PCR primerleri, tasarım
   2. Primer3 içine varsayılan bağlanma bölgesini içeren IGV genomik sekansı Kopya yapıştırın (adım 1.7 bakınız). Set ürün boyutu aralığı 250 - Primer3 300 bp.
   3. UCSC Genom Browser kullanarak PCR primerleri doğrulamak silico PCR aracında (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) ²⁴ var
      NOT: bir sonraki adımda Bu protokol Hind II kullanırI ve BamHI kısıtlama enzimleri klonlama için. Olup olmadığını kontrol edin AAGCTT ya GGATCC sınır mevkisini ihtiva edecektir ucsc In-silico PCR aracı tarafından tahmin edildiği gibi PCR ile amplifiye dizisi (ör http://nc2.neb.com/NEBcutter2/).
   4. ticari bir satıcıdan gerekli primerler edinin.
2. Genomik DNA'dan çoğaltıcı dizi PCR amplifikasyonu
   1. Birincil hücreler (örneğin, primer embriyonik fibroblastlar) şablon genomik DNA arındırın. gDNA izolasyonu için ticari kiti kullanın ve üreticinin talimatlarına uyun.
      Not: gDNA Yüksek kaliteli başarılı bir PCR amplifikasyonu için gereklidir. PCR gDNA kolay değilse Uygun BAC klonları da kullanılabilir.
   2. GDNA 100 ng, 5 ul 10x tampon maddesi, 3 ul MgSO ₄ (25 mM), 5 ul dNTP (2 mM her biri), 1.5 ul İleri primer (10 uM), 1.5 ul Rev astar ihtiva eden 50 | il PCR reaksiyonu hazırlama (10 uM) , 1 ul DNA polimerazı
      NOT: PCR reaksiyonları için düşük hata oranı ile yüksek sadakat DNA polimeraz kullanın.
   3. PCR döngüsü ayarlama (2 dak 95 ° C, (20 saniye 95 ° C, 10 sn 58-65 ° C, 18 sn 70 ° C) X25 tekrar, 2 dakika 70 ° C, sonsuza kadar 4 ° C). Astar en dikkate alınarak ayarlama tavlama sıcaklığı Tm değerleri öngördü.
   4. ticari PCR saflaştırma kiti ile PCR ürünü arındırmak ve üreticinin talimatlarına uyun.
   5. Yukarıda kullanıldığı haliyle primerleri ile PCR tekrar, ancak, 5 çıkıntılar ekleyerek klonlama için kısıtlama yerleri sokacak 'uçlarına (ör İletme: 5'-ATAT AAGCTT xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-3' (Hind III), Rev: 5'-TATA GGATCC xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx 3 '(BamHI)).
   6. Spesifik olmayan PCR ürünlerinin kontrol etmek için agaroz jeli üzerinde PCR ürünün 5 ul çalıştırın.
      NOT: Daha fazla bant tespit edilirse, tüm PCR ürünü çalıştırmak ve ticari jel ekstraksiyon kiti ile uygun bant arındırmak.
3. kısıtlama
   Not: HindIII ve BamHI ile dijeste gereken TK promoteri ²² saflaştınlmış PCR ürünü, vektör (örneğin, TK-LUC) akış yukarı uç klonlamak için.
   1. 1 ug saflaştırılmış PCR ürünü, 1 ul HindIII (20 U / ul), 1 ul BamHI (20 U / ml) ve 5 ul 10x tampon ihtiva eden bir 50 ul reaksiyon karışımı hazırlandı.
   2. 250 ul reaksiyon karışımı ihtiva eden 5 ug vektörü (TK Luc veya alternatif raportör vektör), 5 ul Hindlll (20 U / ul), 5 ul BamHI (20 U / ul), 5 ul ısıya Alkalin Fosfataz (1 U / ul) hazırlayın 25 ul 10x tampon eklendi.
      NOT: Vektörün AP tedavisi büyük ölçüde tek sindirilmiş vektör kendini ligasyonu ve böylece arka plan azalır.
   3. Daha sonra sindirilmiş PCR ürünleri ve ticari bir PCR saflaştırma kiti ile vektör saflaştırılması, 37 ° C de 4 saat reaksiyon karışımlarını inkübe edin.
4. Ligation
   1. 2 ul 10 x T4 DNA ligaz tampon maddesi, 10 ng TK-LUC vektörü 50 ng uç (sindirilmiş PCR ürünü), 1 | il T4 DNA ligaz (400 U / ml) ve nükleaz içermeyen su içeren PCR tüplerine ligasyon reaksiyonu ayarlama 20 ul kadar.
      Not: Reaksiyon ekleme içermeyen bir negatif kontrol hazırlayın.
   2. Hafifçe yukarı pipetleme reaksiyonu karıştırın ve aşağı, mini santrifüj kullanılarak kısaca PCR tüpleri aşağı spin ve daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
   3. Isı daha sonra buz üzerine soğuk ve 50 ul yetkin hücreleri (ör DH5α) dönüşüm için ürünün 5 ul kullanımı, 10 dakika boyunca 65 ° C sıcaklıkta etkisiz hale getirirler.
   4. ticari bir kit ile, bakteri dönüşümü koloniler pick up ve plazmid DNA izole etmek için standart ısı şoku yordamı kullanın. sonraki adımlar öncesinde sıralanmasıyla bütün yapıları doğrulayın.
5. ES hücrelerin transfeksiyonu
   1. 48 oyuklu plakalar kullanılmıştır. 200 ul% 0.1 jelatin solut eklemeHücre kaplama öncesinde iyon / kuyu 30 dakika.
   2. Plaka embriyonik kök (ES) hücreleri transfeksiyondan bir gün önce. / Oyuk 250 ul ES ortamda oyuk başına 3 x 10 ⁴ hücre yoğunluğunda besleyici içermeyen ES hücreleri ve plaka kullanınız.
   3. . Plazmid karışımları hazırlayın karıştırın (her karışımı işlenmemiş 4 ve 4 retinoik asit ile tedavi edilen 8 kuyuları için hesaplanır) 1: 1250 ng TK-Luc Boş (negatif kontrol), 950 ng β-galaktosidaz kodlama vektörü (βGal), Mix 2 : 1,250 ng TK-Luc Hoxa1 arttırıcı (pozitif kontrol), βGal, Mix 3 ng 950: 1250 ng TK-Luc PRMT8 arttırıcı (region of interest), βGal ng 950.
      NOT: ES hücreleri istenilen transkripsiyon faktörlerini ifade (RAR / RXR). lusiferaz ve β-galaktosidaz ölçümleri sırasında daha sonra baz değerlerini belirlemek için untransfected kuyu bırakın.
   4. 106 ul (8 kuyular için yeterli) toplam hacmi karıştırmak her plazmid transfeksiyon kalitesi düşer serum ortam ekleyin.
   5. 4.5 ul ES kaliteli Transfect ekleiyon reaktif sonra yukarı ve aşağı 15 kez pipetleme iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 10 dakika süre ile transfeksiyon karışımı inkübe edin.
   6. , Kuyu başına hücrelere transfeksiyon karışımı 13 ul ekleyin Pipetleme ile iyice karıştırın. geri inkübatör ligandı tedavi öncesi (37 ° C) O / N içine hücreleri yerleştirin.
   7. hücrelerden aspirasyonu ile dikkatlice ortamı çıkarın ve 250 ul taze medya / kuyu 0.01 içeren - araç olarak nihai konsantrasyona veya DMSO gibi 1 mcM all-trans retinoik asit (RA). 48 saat - 24 inkübe hücreleri.
      NOT: Retinoik asit duyarlı ışıktır.
6. Hücre lizatlarının Hazırlanması
   1. 5x Lizis Tamponu (1.25 mi, 0.5 M Tris pH = 7.8, seyreltilir 1 mi, 1 M ditiyotreitol (DTT) _(H2O), 10 ml 0.1 M EDTA pH = 8.0, 50 ml gliserol, 5 ml Triton X-100, steril 100 ml kadar su), steril su ile 1 x 20 ul 1 M DTT / 10 ml ilave edilir ve kullanımdan önce oda sıcaklığına dengelenmeye. Deney gününde, 48-delikli plaka için 10 ml hazırlayın.
   2. hücrelerden aspirasyonu ile dikkatlice ortamı çıkarın. 1x PBS ile bir kez hücreler durulayın. Hücrelere 200 ul 1x Lizis Tampon / kuyu doğrudan ekleyin.
   3. RT (kimyasal liziz) 2 saat boyunca çalkalanır. -80 ° C (mekanik parçalama) plakanın hücre lizatları dondurun. Lizatlar birkaç gün -80 ° C de muhafaza edilebilir.
   4. lizatları çözülme. Tam Çözündükten sonra bir elektronik çok kanallı pipet kullanılarak 96 çukurlu bir levhaya hücre lizatları aktarın. Aktarım β-galaktosidaz deneyi için 96 oyuklu plaka berrak hücre lizatının 80 ul lusiferaz ölçümü için, beyaz bir plakaya hücre lizatının 40 ul. herhangi bir kabarcıkları oluşturan kaçının.
7. β-galaktosidaz deneyi
   NOT: Beta galaktosidaz veya alternatif ikinci muhabirleri non-spesifik deneysel varyasyonları hesaba bir iç kontrol olarak kullanılmalıdır.
   1. Β-galaktosidaz alt-tabaka tamponu hazırlayın: 80.0 gr Na ₂ HPO ₄ • 7H _2, O,_H2O • 3.8 g NaH ₂ PO _4, 30.0 gr KCl, • 7H ₂ O _4, steril su ile 1000 ml'ye 1.0 gr MgSO. PH 7.4 ayarlayın. 4 ° C'de sterilize (0.2 mikron) ve mağaza Filtre
   2. 4 mg ONPG 1 mi β-galaktosidaz alt-tabaka tamponu ilave (o-nitrofenil-β-D-galaktosidaz). Kullanımdan hemen önce, 1 ml tampon başına 2-merkaptoetanol (βME) 3.5 ul ekle. 80 ul hücre lisatı, 100 ul β-galaktosidaz alt-tabaka tamponu ekleyin.
   3. açık sarı bir renk geliştirdi kadar 37 ° C 'de reaksiyonlar inkübe edin. Bir plaka okuyucu ve ihracat verileri OD 420 nm'de absorbansı okunur.
      NOT: Saat genellikle artık 30 dakika daha, transfeksiyon verimliliğine bağlı olarak değişir.
8. Lusiferaz Deneyi
   1. 50 ml polipropilen tüp eklemek 15.1 mg D-luciferin tuz, 82.7 mg ATP tuz, 185 mg MgSO ₄ • 7H ₂ O: 50 ml luciferase substrat reaktif hazırlayınDaha sonra, 1.5 ml 1 M HEPES tamponu, 48.5 ml ATP ücretsiz su, girdap ekleyin bütün bileşikler tamamen çözülür emin olun. -80 ° C'de 10 ml lik kısımlar halinde 5 - tutun.
   2. başlamadan önce oda sıcaklığına ısınmaya 5 mi lusiferin substratının reajanı. Pipet 100 ul substrat hücre lizatı 40 ul ihtiva eden beyaz bir plakanın her bir oyuğuna reaktifi hemen bir lüminesan sayacı makinesi kullanılarak sinyali ölçer.
   3. , üçlü Transfeksiyonlar, en az üç bağımsız deneyden elde etkinlikleri.
   4. Ölçülen her değer olmayan transfekte edilen hücreler için ölçülen ortalama değerler çıkarılarak ilk her bir taban normalize lusiferaz aktivitesi ve baz normalize β-galaktosidaz değerleri hesaplanır. Sonra lusiferaz / β-galaktosidaz aktivitesinin oranı hesaplanır.

Arttırıcı RNA 3. karakterizasyonu

NOT: arttırıcı aktivitenin bir daha doğrudan gösterge son genom-w ortaya çıkmıştırarttırıcılar transkripsiyonu edilir nt 50 2,000, arasında değişen büyüklüklerde birçok kısa kodlayıcı olmayan RNA'lar tespit ve (Ernas) artırıcı RNA'ların denir ide çalışmaları ^16,25,26 (Şekil 4). ERNA indüksiyonu yüksek bitişik ekson-kodlayan genlerin indüklenmesi ile ilişkilidir. Bu durumda, sinyal bağımlı arttırıcı aktivitesi RT-qPCR çeşitli koşullar altındaki ERNA üretimi karşılaştırılarak in vivo olarak ölçülebilir.

1. RT-qPCR Erna tespiti için Primer Tasarım Kuralları
   1. 2 kb uzakta açıklamalı transkripsiyon başlangıç ​​sitelerinden - en az 1.5 olduğu Erna ölçümleri için genomik bölge seçin.
      Not: Önemli bir şekilde, intrajenik arttırıcılar arasında mRNA transkripsiyonu yüksek seviyelere sens yönlenmede ERNA doğru kantifikasyon önlemek intrajenik arttırıcılar da antisens Ernas saptanabilir ve ekstragenik arttırıcılar da Ernas seviyesine benzerdir.
   2. Genel bir kural olarak, bölgeler 200 kullanmak - 1000 bp froanlamda ya da anti-duyu şeridi (Şekil 4 ve Şekil 6) üzerine ya da Primer tasarım için ilgi bağlanma sitesini transkripsiyon faktörünün merkezi m.
      Not: GRO seq, DNaz seq, H3K4me1, H3K4me3 ya H3K27ac ChIP seq veriler daha doğru bir primer tasarımı için kullanılabilecek istenen hücre tipleri ve koşullarından varsa. Ernas H3K4me1 ve Me3 yüksek seviyeleri ile karakterize farazi arttırıcı bölgeleri transkribe edilmektedir. Ernas İfadesi olumlu aktive arttırıcı histon işareti H3K27ac zenginleşmesine ile ilişkilidir.
   3. Primer3 tarafından Ernas floresan boya temelli RT-qPCR ölçümü için Tasarım PCR primerleri (http://bioinfo.ut.ee/primer3/) ²³ uyarınca astar tasarımı için anti-sens dizisi (sense sarmalının tamamlayıcı ters) oluşturun: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. Primer tasarım için sens veya anti-sens dizisi 300 bp - 200 yerleştirin.
2. ERNA Transkripsiyon ölçümü
   1. üreticinin tavsiyelerine göre, ticari asidik fenol / kloroform bazlı ekstre edici reaktif ile muamele edilen hücrelerden alınan toplam RNA izole edin.
   2. önce ters transkripsiyon reaksiyonunda bunları kullanarak izole RNA tedavisi için DNaseI kullanın. ters transkripsiyon öncesinde, üreticinin tavsiyesine göre DNaz inaktive.
   3. DNaz I tedavisinden sonra RNA konsantrasyonu ölçmek ve RT reaksiyon başına 1,000 ng kullanın. Yüksek kaliteli ters transkriptaz kullanın.
      Not: Ernas sayıda poliadenile olamaz gibi, ters transkripsiyon rastgele primerler gerektirir.
   4. Algılama ters standart prosedür kullanılarak RT-qPCR Erna transkripsiyonu. Normalleşmesi için olmayan bir tedavi bağımlı mRNA ölçün (örneğin, 36B4, PPIA, GAPDH, Actb).

Sonuçlar

Biz genom hangi RA-düzenlenen genler kendi yakın reseptör zenginleştirme var tanımlamak amacıyla bir pan-spesifik RXR antikor kullanıldı. Retinoik asit ile tedavi ES hücrelerinden elde RXR ChIP seq veri Biyoinformatik analiz RXR sitesi işgal altında nükleer reseptör yarım ekibi (AGGTCA) (Şekil 1) zenginleştirme saptandı. Bir biyoinformatik algoritması kullanarak biz RXR ChIP-seq verilere yarım sitesinden (Şekil 2) için motif arama so...

Tartışmalar

In recent years, advances in sequencing technology have allowed large-scale predictions of enhancers in many cell types and tissues ^7-9. The workflow described above allows one to perform primary characterization of candidate enhancers chosen based on ChIP-seq data. The detailed steps and notes will help anyone to set up a routine enhancer validation in the lab.

The most critical step in the luciferase reporter assay is the transfection efficiency. It is recommended to include a GFP...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOD DNA polymerase	Merck Millipore	71085-3	for PCR amplification of enhancer from gDNA
DNeasy Blood & Tissue kit	Qiagen	69504	for genomic DNA isolation
QIAquick PCR Purification kit	Qiagen	28106	for PCR product purification
Gel extraction kit	Qiagen	28706	for gel extraction if there are more PCR product
HindIII	NEB	R3104L	restriction enzyme
BamHI	NEB	R3136L	restriction enzyme
FastAP	Thermo Scientific	EF0651	release of 5'- and 3'-phosphate groups from DNA
T4 DNA ligase	NEB	M0202	for ligation
QIAprep Spin Miniprep kit	Qiagen	27106	for plasmid isolation
DMEM	Gibco	31966-021	ES media
FBS	Hyclone	SH30070.03	ES media
MEM Non-Essential Amino Acid	Sigma	M7145	ES media
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333	ES media
Beta Mercaptoethanol	Sigma	M6250	ES media
FuGENE HD	Promega	E2311	transfection reagent
Opti-MEM® I Reduced Serum Medium	Life Technologies	31985-062	for transfection
All-trans retinoic acid	Sigma	R2625	ligand, for activation of RAR/RXR
96-well clear plate	Greiner	655101	for Beta galactosidase assay
96-well white plate	Greiner	655075	for Luciferase assay
D-luciferin, potassium salt	Goldbio.com	115144-35-9	for Luciferase assay
ATP salt	Sigma	A7699-1G	for Luciferase assay
MgSO4•7H2O	Sigma	230391-25G	for Luciferase assay
HEPES	Sigma	H3375-25G	for Luciferase assay
Na2HPO4 •7H2O	Sigma	431478-50G	for Beta galactosidase assay
NaH2PO4 •H2O	Sigma	S9638-25G	for Beta galactosidase assay
MgSO4•7H2O	Sigma	230391-25G	for Beta galactosidase assay
KCl	Sigma	P9541-500G	for Beta galactosidase assay
ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactosidase)	Sigma	N1127-1G	for Beta galactosidase assay
TRIzol®	Life Technologies	15596-026	RNA isolation
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Life Technologies	4368814	reverse transcription of eRNA
Rnase-free Dnase	Promega	M6101	Dnase treatment
SsoFast Eva Green	BioRad	750000105	RT-qPCR mastermix
CFX384 Touch™ Real-Time PCR Detection System	BioRad		qPCR machine
BioTek Synergy 4 microplate reader	BioTek		luminescent counter