Previsione e Validazione del gene regolatore elementi attivato durante retinoico Acid Induced embrionali cellule staminali Differenziazione

Riepilogo

In this work we provide an experimental workflow of how active enhancers can be identified and experimentally validated.

Abstract

Lo sviluppo embrionale è un processo a più fasi che coinvolge l'attivazione e la repressione di molti geni. Elementi Enhancer nel genoma sono noti per contribuire al tessuto e cellula-tipo regolazione specifica dell'espressione genica durante la differenziazione cellulare. Pertanto, la loro identificazione e un'ulteriore indagine è importante per comprendere come il destino della cellula è determinata. Integrazione dei dati di espressione genica (ad esempio, microarray o RNA-Seq) e risultati di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) basata su studi genome-wide (ChIP-Seq) permette l'identificazione su larga scala di queste regioni regolatorie. Tuttavia, validazione funzionale di esaltatori specifici di tipo a cella richiede ulteriori in vitro e in vivo procedure sperimentali. Qui si descrive come esaltatori attivi possono essere identificati e validati sperimentalmente. Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro passo-passo che comprende: 1) l'identificazione di regioni regolatorie attraverso l'analisi, 2) la clonazione e exper dati ChIP-Seqconvalida imental del potenziale normativo putativo delle sequenze genomiche identificate in un saggio giornalista, e 3) determinazione dell'attività enhancer in vivo misurando il livello trascrizione di RNA enhancer. Il protocollo presentato è abbastanza dettagliata per aiutare chiunque a creare questo flusso di lavoro nel laboratorio. Soprattutto, il protocollo può essere facilmente adattato e utilizzato in qualsiasi sistema modello cellulare.

Introduzione

Development of a multicellular organism requires precisely regulated expression of thousands of genes across developing tissues. Regulation of gene expression is accomplished in large part by enhancers. Enhancers are short non-coding DNA elements that can be bound with transcription factors (TFs) and act from a distance to activate transcription of a target gene¹. Enhancers are generally cis-acting and most frequently found just upstream of the transcription start site (TSS), but recent studies also described examples where enhancers were found much further upstream, on the 3' of the gene or even within the introns and exons².

There are hundreds of thousands of potential enhancers in the vertebrate genomes¹. Recent methods based on chromatin immunoprecipitation (ChIP) provide high-throughput data of the whole genome that can be used for enhancer analysis^3-9. Though data obtained by ChIP-seq experiments greatly increases the likelihood to identify cell and tissue-specific enhancers, it is important to keep in mind that detected binding sites do not necessarily identify direct DNA binding and/or functional enhancers. Thus, further functional analysis of newly identified enhancers is indispensable. In this work, we present a basic three-step process of putative active enhancer identification and validation. This includes: 1) selection of putative transcription factor binding sites by bioinformatics analysis of ChIP-seq data, 2) cloning and validation of these regulatory sequences in reporter constructs, and 3) measurement of enhancer RNA (eRNA).

Exposure of embryonic stem (ES) cells to retinoic acid (RA) is frequently used to promote neural differentiation of the pluripotent cells ¹⁰. RA exerts its effects by binding to RA receptors (RARα, β, γ) and retinoid X receptors (RXRα, β, γ). RARs and RXRs in a form of heterodimer bind to DNA motifs called RA-response elements, that is typically arranged as direct repeats of AGGTCA sequence (called as half site) and regulate transcription. Ligand-treatment experiments allowed the identification of several retinoic acid regulated genes in ES cells ^11,12. However, enhancer elements for many of these genes has not been described yet. To demonstrate how the here-described workflow can be used for enhancer identification and validation we show step-by-step the selection and characterization of two retinoic acid-dependent enhancers in embryonic stem cells.

Protocollo

1. Enhancer selezione basata su analisi Chip-Seq

1. Scaricare il file di dati grezzi FASTQ RXR ChIP-Seq (mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz) da http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
2. Scaricare ed estrarre il file di indice BWA necessario per l'allineamento (nel nostro caso: Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz
   NOTA: Visita a https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts per ulteriori informazioni per quanto riguarda le fasi di analisi bioinformatica e per scaricare gli script usati di seguito.
3. Allineare il file di esempio FASTQ al genoma MM10 (utilizzare lo script: perform_alignment.sh). Questo creerà una cartella con un file .bam e le statistiche del tracciato. RXR ChIP-Seq dati allineati (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam), e il file di indice corrispondente (.bai) sono disponibili qui:
   http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
   NOTA: BWA è un pacchetto software che si allinea relasequenze relativamente brevi (ad esempio, risultati ChIP-seq) ad un database di sequenze, come il genoma di riferimento del mouse (ad esempio, mm10) ^13.
4. Eseguire lo script (callpeaks.sh) per il picco di chiamata e de novo analisi motivo. Utilizzare il file .bam come ingresso. Lo script si basa su Homer findPeaks ^14.
   NOTA: I file di output ci danno informazioni sul numero totale dei picchi, l'arricchimento dei motivi, la percentuale dello sfondo, e le sequenze bersaglio con motivi, ecc. (Figura 1). Tipicamente diversi motivi sono elencati in ordine del loro significato.
5. Rimappare il # 1 motivo classificato (NR metà `AGGTCA`) (utilizzare lo script: remap_motif.sh)
   NOTA: Come risultato, lo script genera un file .bed che mostrerà quale chip-picchi coprono regioni genomiche che contengono il sito di legame canonica del fattore di trascrizione di interesse.
6. Scaricare e visualizzare i risultati della allineato RXR ChIP-Seq legge (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam (anche scaricare il .bai)) e le occorrenze motivo AGGTCA (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) da Integrativa Genomica Viewer (IGV) ¹⁵ per identificare RAR putativo / RXR siti di legame (Figura 2 e Figura 3).
   NOTA: L'integrazione di vari dati del chip-ss aiuterà a più prevedere con precisione le buone esaltatori di candidati ^16,17. Recenti studi hanno rivelato che esaltatori attivi sono in genere arricchito da P300 e correlazione con H3K4me1 e H3K27ac, e si trovano in regioni della cromatina aperta, mostrando in tal modo DNase-I ipersensibilità è anche raccomandato ^18-21.
7. Utilizzare la "Definizione di una regione di interesse" in IGV ¹⁵ per ottenere 200-400 sequenza bp della regione genomica selezionata e utilizzare queste sequenze per le successive disegni di primer.

2. Reporter Assay

NOTA: Il sistema luciferina / luciferasi viene utilizzatocome un saggio giornalista molto sensibile per la regolazione trascrizionale. A seconda della luciferasi enzimatica enhancer è prodotta che catalizzare l'ossidazione di luciferina per oxyluciferin conseguente bioluminescense, che può essere rilevato. Come primo passo, identificate sequenze enhancer putativi dovrebbero essere subclonati in un vettore giornalista (ad esempio, TK-luciferasi ^22, pGL3 o NanoLuc).

1. disegno Primer
   1. Primer design PCR per l'amplificazione di 200-400 bp di regioni enhancer putativi da Primer3 (disponibile qui: http://bioinfo.ut.ee/primer3/) ²³
   2. Copia-incolla la sequenza genomica da IGV che include il sito di legame putativo in Primer3 (vedi punto 1.7). Set gamma di dimensioni prodotto da 250-300 bp Primer3.
   3. Convalida i primer PCR utilizzando il browser UCSC genoma di In silico strumento PCR (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) ²⁴
      NOTA: Questo protocollo in un passaggio successivo utilizza HindIII e BamHI enzimi di restrizione per la clonazione. Controllare se la PCR sequenza amplificata come previsto dallo strumento PCR UCSC in silico conterrà AAGCTT o GGATCC siti di restrizione (ad esempio, http://nc2.neb.com/NEBcutter2/).
   4. Ottenere i primer richiesti da un fornitore commerciale.
2. PCR amplificazione di Enhancer sequenza da DNA genomico
   1. Purificare modello DNA genomico da cellule primarie (ad esempio, fibroblasti embrionali primari). Utilizzare kit commerciale per l'isolamento gDNA e seguire le istruzioni del produttore.
      NOTA: L'alta qualità di gDNA è essenziale per l'amplificazione PCR di successo. Appropriate cloni BAC possono essere utilizzati se la PCR non è facile da gDNA.
   2. Preparare 50 microlitri reazione PCR contenente 100 ng gDNA, 5 ml 10x tampone, 3 ml MgSO ₄ (25 mm), 5 ml dNTP (2 mm ciascuno), 1,5 ml Fwd Primer (10 micron), 1,5 ml Rev Primer (10 micron) , 1 microlitri DNA polimerasi
      NOTA: utilizzare ad alta fedeltà DNA polimerasi con un basso tasso di errore per le reazioni PCR.
   3. Impostare il ciclo di PCR (2 min 95 ° C, (20 sec a 95 ° C, 10 sec 58 - 65 ° C, 18 sec a 70 ° C) ripetizione x25, 2 min a 70 ° C, sempre 4 ° C). Impostare la temperatura di ricottura con la considerazione del primer del predetto valori Tm.
   4. Purificare il prodotto di PCR con un kit commerciale di purificazione PCR e seguire le istruzioni del produttore.
   5. Introdurre i siti di restrizione per la clonazione ripetendo la PCR con primer usati in precedenza, ma l'aggiunta di sporgenze sulle loro estremità 5 '(ad esempio, Fwd: 5'-ATAT AAGCTT xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-3' (HindIII), Rev: 5'-TATA GGATCC xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx -3 '(BamHI)).
   6. Eseguire 5 ml di prodotto di PCR su gel di agarosio per verificare la presenza di prodotti di PCR aspecifici.
      NOTA: Se vengono rilevati più bande, eseguire l'intero prodotto PCR e purificare la banda appropriata da un kit di estrazione del gel commerciale.
3. Limitazione
   NOTA: Per clonare inserto a monte della TK promotore ²² il prodotto purificato PCR e il vettore (ad esempio, TK-Luc) deve essere digerito con HindIII e BamHI.
   1. Preparare una miscela di reazione di 50 ml contenente 1 mg di prodotto purificato PCR, 1 HindIII microlitri (20 U / mL), 1 ml BamHI (20 U / ml) e 5 ml 10x tampone.
   2. Preparare una 250 miscela di reazione microlitri contenente vettore 5 mcg (TK Luc, o un vettore giornalista alternativo), 5 ml HindIII (20 U / ml), 5 ml BamHI (20 U / ml), 5 ml termosensibile fosfatasi alcalina (1 U / ml) e 25 microlitri 10x tampone.
      NOTA: Trattamento AP del vettore diminuisce notevolmente l'auto-ligazione del singolo vettore digerito e quindi lo sfondo.
   3. Incubare le miscele di reazione per 4 ore a 37 ° C, quindi purificare i prodotti di PCR digerito e il vettore con un kit commerciale di purificazione PCR.
4. ligation
   1. Impostare la reazione per la legatura in provette da PCR di cui 2 ml 10x T4 tampone DNA ligasi, 10 ng TK-Luc vettore, inserto 50 ng (prodotto di PCR digerito), 1 ml T4 DNA ligasi (400 U / ml) e priva di nucleasi acqua fino a 20 microlitri.
      NOTA: Preparare un controllo negativo in cui la reazione non contiene inserto.
   2. Mescolare delicatamente la reazione pipettando su e giù, centrifugare brevemente le provette per PCR utilizzando mini-centrifuga e poi incubare a temperatura ambiente per 10 min.
   3. Calore inattivare a 65 ° C per 10 minuti poi raffreddare in ghiaccio e usare 5 ml di prodotto per la trasformazione in 50 microlitri cellule competenti (ad esempio, DH5α).
   4. Utilizzare procedura di shock termico standard per trasformare i batteri, raccogliere le colonie e isolare il DNA plasmide con un kit commerciale. Convalida tutti i costrutti da sequenziamento prima delle fasi successive.
5. Trasfezione delle cellule ES
   1. Usare piatti 48 pozzetti. Aggiungere 200 ml 0,1% di gelatina solution / pozzetto 30 min prima placcatura cellule.
   2. staminali embrionali (ES), le cellule piastra al giorno prima di trasfezione. Utilizzare ES cellule libera-feeder e la piastra ad una densità di 3 x 10 ⁴ cellule per pozzetto in 250 microlitri ES media / bene.
   3. Preparare le miscele plasmide (ciascuna miscela viene calcolato per 8 pozzi, 4 non trattata e 4 trattati con acido retinoico) Mix 1:. 1.250 ng TK-Luc vuoto (controllo negativo), 950 ng β-galattosidasi codifica vettore (βGal), Mix 2 : 1.250 ng TK-Luc HOXA1 enhancer (controllo positivo), 950 ng βGal, Mix 3: 1.250 ng TK-Luc PRMT8 enhancer (regione di interesse), 950 ng βGal.
      NOTA: cellule staminali embrionali esprimono i fattori di trascrizione desiderati (RAR / RXR). Lasciare pozzi untransfected per determinare i valori di base in seguito durante le misurazioni luciferasi e β-galattosidasi.
   4. Aggiungere qualità trasfezione mezzi siero ridotto a ciascun plasmide mescolare fino a 106 microlitri volume totale (sufficiente per 8 pozzetti).
   5. Aggiungere 4,5 microlitri transfect qualità ESione reagente quindi mescolare accuratamente pipettando 15 volte su e giù. Incubare la miscela di trasfezione per 10 minuti a RT.
   6. Aggiungere 13 ml di mix trasfezione le cellule per bene, mescolare accuratamente pipettando. Posizionare le cellule di nuovo nel incubatore (37 ° C) O / N prima del trattamento ligando.
   7. Rimuovere i supporti con cura mediante aspirazione dalle cellule e aggiungere 250 microlitri fresca media / pozzetto contenente 0,01 - 1 micron tutto-trans retinoico (RA) come concentrazione finale o DMSO come veicolo. Incubare le cellule per 24 - 48 ore.
      NOTA: L'acido retinoico è sensibile alla luce.
6. Preparazione di lisati cellulari
   1. Diluire 5x Lysis Buffer (1,25 ml 0,5 M Tris pH = 7.8, 1 ml 1 M ditiotreitolo (DTT) (in H ₂ O), 10 ml di 0,1 M EDTA pH = 8,0, 50 ml di glicerolo, 5 ml di Triton X-100, sterili acqua fino a 100 ml) a 1x con acqua sterile, aggiungere 20 ml 1 M DTT / 10 ml e portare a RT prima dell'uso. Preparare 10 ml per una piastra a 48 pozzetti il ​​giorno del test.
   2. Rimuovere i supporti con cura per aspirazione da cellule. Lavare le cellule una volta con PBS 1x. Aggiungere 200 microlitri 1x tampone di lisi / pozzetto direttamente alle cellule.
   3. Agitare per 2 ore a temperatura ambiente (lisi chimica). Congelare i lisati cellulari sulla piastra a -80 ° C (lisi meccanica). Lisati possono essere conservati a -80 ° C per diversi giorni.
   4. Scongelare i lisati. Dopo aver completato lo scongelamento, trasferire lisati cellulari ad una piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale elettronica. Trasferimento 80 ml di lisato cellulare a piastra a 96 pozzetti chiaro per il dosaggio β-galattosidasi e 40 ml di lisato cellulare a un piatto bianco per la misurazione della luciferasi. Evitare la formazione di eventuali bolle.
7. β-galattosidasi Assay
   NOTA: beta-galattosidasi o seconde giornalisti alternativi debbano essere usati come controllo interno per tenere conto di non specifici variazioni sperimentali.
   1. Preparare tampone substrato β-galattosidasi: 80,0 g Na ₂ HPO ₄ • 7H ₂ O,3,8 g NaH ₂ PO ₄ • H ₂ O, 30,0 g KCl, 1,0 g MgSO ₄ • 7H ₂ O, portare a 1000 ml con acqua sterile. Regolare il pH a 7,4. Filtro sterilizzare (0,2 micron) e conservare a 4 ° C
   2. Mescolare tampone substrato 1 ml β-galattosidasi con 4 mg ONPG (o-nitrofenil-β-D-galattosidasi). Aggiungere 3,5 ml di 2-mercaptoetanolo (βME) per 1 ml di tampone appena prima dell'uso. Aggiungere 100 microlitri tampone del substrato β-galattosidasi al 80 microlitri lisato cellulare.
   3. Incubare le reazioni a 37 ° C fino ad un colore giallo tenue è sviluppato. Leggere l'assorbanza a OD 420 nm su un lettore di piastre ed esportare i dati.
      NOTA: Il tempo varia a seconda della efficienza di trasfezione, di solito non più di 30 min.
8. Assay luciferasi
   1. Preparare 50 ml substrato luciferina reagente: 15.1 mg di sale D-luciferina, 82,7 mg di sale ATP, 185 mg MgSO ₄ • 7H ₂ O, aggiungere 50 ml di tubo di polipropilene,quindi aggiungere 1,5 ml 1 M tampone HEPES, 48,5 ml ATP acqua libera, vortice, assicurarsi che tutti i composti si dissolvono completamente. Tenere 5 - 10 ml aliquote a -80 ° C.
   2. Warm 5 ml substrato luciferina reagente per RT prima di iniziare. Pipettare 100 microlitri reagente substrato a ciascun pozzetto della piastra bianca contenente 40 ml di lisato cellulare e misurare il segnale immediatamente utilizzando una macchina contatore luminescenti.
   3. Ottenere le attività da almeno tre esperimenti indipendenti in trasfezioni triplice copia.
   4. Calcolare prima il normalizzata l'attività della luciferasi base e valori β-galattosidasi normalizzate di base per ogni bene sottraendo i valori medi misurati per le cellule non transfettate di ogni valore misurato. Quindi calcolare il rapporto di attività luciferasi / β-galattosidasi.

3. Caratterizzazione di Enhancer RNA

NOTA: Un indicatore più diretto di attività enhancer è emerso dalla recente genoma-wstudi ide che ha individuato molti RNA non codificanti brevi, di dimensioni variabili da 50 a 2.000 nt, che sono trascritti da esaltatori, e sono denominate RNA Enhancer (eRNA) ^16,25,26 (Figura 4). eRNA induzione altamente correlata con l'induzione di geni esone codificante adiacenti. Così, l'attività enhancer segnale-dipendente può essere quantificato in vivo confrontando la produzione eRNA tra varie condizioni di RT-qPCR.

1. Linee guida per la progettazione Primer per il rilevamento Erna di RT-qPCR
   1. Selezionare regioni genomiche per misure erna che sono almeno 1,5 - 2 kb lontano da siti di inizio della trascrizione annotati.
      NOTA: È importante sottolineare che, alti livelli di mRNA trascrizione attraverso esaltatori intragenica prevenire quantificazione accurata Erna nell'orientamento senso, eRNA antisenso a esaltatori intragenica sono rilevabili e sono simili a livello di eRNA a esaltatori extrageniche.
   2. Come regola generale, utilizzare le regioni 200 - 1.000 bp from il centro del fattore di trascrizione sito di interesse per la progettazione di primer sia sul senso o antisenso filamento (Figura 4 e Figura 6) vincolante.
      NOTA: Se GRO-ss, DNasi-ss, H3K4me1, H3K4me3 o dati H3K27ac ChIP-Seq sono disponibili presso i tipi di cellule desiderate e condizioni può essere utilizzato per la progettazione di primer più accurata. eRNA sono trascritti dalle regioni enhancer putativo caratterizzate da alti livelli di H3K4me1 e ME3. L'espressione di eRNA correla positivamente con l'arricchimento di attivazione marchio enhancer istone H3K27ac.
   3. Progettazione PCR primer per la misurazione RT-qPCR di eRNA a base di colorante fluorescente di Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/) ²³ Generare la sequenza anti-senso (complemento del filamento senso inverso) per la progettazione di fondo come per: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. Inserire 200-300 bp di senso o anti-senso sequenza per la progettazione di primer.
2. Misura Erna Trascrizione
   1. Isolare RNA totale da cellule trattate con acido commerciale di fenolo / cloroformio a base di reagente di estrazione in base alle raccomandazioni del fabbricante.
   2. Utilizzare DNasiI per il trattamento di RNA isolato prima di utilizzarli nella reazione di trascrizione inversa. Inattivare DNasi secondo le raccomandazioni del fabbricante, prima di invertire la trascrizione.
   3. Misurare la concentrazione di RNA dopo il trattamento DNasi I e usare 1,000 ng per reazione RT. Utilizzare trascrittasi inversa di alta qualità.
      NOTA: Come gran numero di eRNA non può essere poliadenilato, trascrizione inversa richiede l'uso di primer casuali.
   4. Rileva trascrizione inversa Erna di RT-qPCR utilizzando la procedura standard. Misurare un mRNA non-trattamento-dipendente per la normalizzazione (ad esempio, 36B4, PPIA, GAPDH, ACTB).

Risultati

Abbiamo utilizzato un anticorpo specifico-pan RXR al fine di identificare quali geni RA-regolati a livello di genoma hanno recettore arricchimento nella loro immediate vicinanze. L'analisi bioinformatica delle RXR dati del chip-ss ottenuti da cellule ES trattate con acido retinoico ha rivelato l'arricchimento del mezzo sito recettore nucleare (AGGTCA) sotto il RXR siti occupati (figura 1). Utilizzando un algoritmo di bioinformatica abbiamo mappato di nuovo il ris...

Discussione

In recent years, advances in sequencing technology have allowed large-scale predictions of enhancers in many cell types and tissues ^7-9. The workflow described above allows one to perform primary characterization of candidate enhancers chosen based on ChIP-seq data. The detailed steps and notes will help anyone to set up a routine enhancer validation in the lab.

The most critical step in the luciferase reporter assay is the transfection efficiency. It is recommended to include a GFP...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOD DNA polymerase	Merck Millipore	71085-3	for PCR amplification of enhancer from gDNA
DNeasy Blood & Tissue kit	Qiagen	69504	for genomic DNA isolation
QIAquick PCR Purification kit	Qiagen	28106	for PCR product purification
Gel extraction kit	Qiagen	28706	for gel extraction if there are more PCR product
HindIII	NEB	R3104L	restriction enzyme
BamHI	NEB	R3136L	restriction enzyme
FastAP	Thermo Scientific	EF0651	release of 5'- and 3'-phosphate groups from DNA
T4 DNA ligase	NEB	M0202	for ligation
QIAprep Spin Miniprep kit	Qiagen	27106	for plasmid isolation
DMEM	Gibco	31966-021	ES media
FBS	Hyclone	SH30070.03	ES media
MEM Non-Essential Amino Acid	Sigma	M7145	ES media
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333	ES media
Beta Mercaptoethanol	Sigma	M6250	ES media
FuGENE HD	Promega	E2311	transfection reagent
Opti-MEM® I Reduced Serum Medium	Life Technologies	31985-062	for transfection
All-trans retinoic acid	Sigma	R2625	ligand, for activation of RAR/RXR
96-well clear plate	Greiner	655101	for Beta galactosidase assay
96-well white plate	Greiner	655075	for Luciferase assay
D-luciferin, potassium salt	Goldbio.com	115144-35-9	for Luciferase assay
ATP salt	Sigma	A7699-1G	for Luciferase assay
MgSO4•7H2O	Sigma	230391-25G	for Luciferase assay
HEPES	Sigma	H3375-25G	for Luciferase assay
Na2HPO4 •7H2O	Sigma	431478-50G	for Beta galactosidase assay
NaH2PO4 •H2O	Sigma	S9638-25G	for Beta galactosidase assay
MgSO4•7H2O	Sigma	230391-25G	for Beta galactosidase assay
KCl	Sigma	P9541-500G	for Beta galactosidase assay
ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactosidase)	Sigma	N1127-1G	for Beta galactosidase assay
TRIzol®	Life Technologies	15596-026	RNA isolation
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Life Technologies	4368814	reverse transcription of eRNA
Rnase-free Dnase	Promega	M6101	Dnase treatment
SsoFast Eva Green	BioRad	750000105	RT-qPCR mastermix
CFX384 Touch™ Real-Time PCR Detection System	BioRad		qPCR machine
BioTek Synergy 4 microplate reader	BioTek		luminescent counter