Previsão e Validação de elementos reguladores de genes ativada durante ácido retinóico induzida estaminais embrionárias Diferenciação Celular

Resumo

In this work we provide an experimental workflow of how active enhancers can be identified and experimentally validated.

Resumo

O desenvolvimento embrionário é um processo de múltiplos passos que envolve a activação e de repressão de muitos genes. elementos intensificadores no genoma são conhecidos por contribuir para o tecido e tipo celular específico regulação da expressão do gene durante a diferenciação celular. Assim, a sua identificação e posterior investigação é importante, a fim de compreender como o destino celular é determinada. A integração de dados de expressão de genes (por exemplo, microarray ou ARN-SEQ) e os resultados de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) -based estudos de todo o genoma (ChIP-SEQ) permite a identificação de grande escala dessas regiões reguladoras. No entanto, a validação funcional de potenciadores específicos do tipo de célula requer mais in vitro e em procedimentos experimentais in vivo. Aqui descrevemos como potenciadores activos podem ser identificados e validados experimentalmente. Este protocolo prevê um fluxo de trabalho passo-a-passo, que inclui: 1) identificação de regiões reguladoras por análise de dados do chip-seq, 2) clonagem e expervalidação imental de potencial regulador putativo das sequências genómicas identificados num ensaio de repórter, e 3) A determinação da actividade potenciadora in vivo através da medição do nível transcrito de ARN potenciador. O protocolo apresentado é detalhado o suficiente para ajudar alguém a criar esse fluxo de trabalho no laboratório. Importantemente, o protocolo pode ser facilmente adaptado e utilizado em qualquer sistema de modelo celular.

Introdução

Development of a multicellular organism requires precisely regulated expression of thousands of genes across developing tissues. Regulation of gene expression is accomplished in large part by enhancers. Enhancers are short non-coding DNA elements that can be bound with transcription factors (TFs) and act from a distance to activate transcription of a target gene¹. Enhancers are generally cis-acting and most frequently found just upstream of the transcription start site (TSS), but recent studies also described examples where enhancers were found much further upstream, on the 3' of the gene or even within the introns and exons².

There are hundreds of thousands of potential enhancers in the vertebrate genomes¹. Recent methods based on chromatin immunoprecipitation (ChIP) provide high-throughput data of the whole genome that can be used for enhancer analysis^3-9. Though data obtained by ChIP-seq experiments greatly increases the likelihood to identify cell and tissue-specific enhancers, it is important to keep in mind that detected binding sites do not necessarily identify direct DNA binding and/or functional enhancers. Thus, further functional analysis of newly identified enhancers is indispensable. In this work, we present a basic three-step process of putative active enhancer identification and validation. This includes: 1) selection of putative transcription factor binding sites by bioinformatics analysis of ChIP-seq data, 2) cloning and validation of these regulatory sequences in reporter constructs, and 3) measurement of enhancer RNA (eRNA).

Exposure of embryonic stem (ES) cells to retinoic acid (RA) is frequently used to promote neural differentiation of the pluripotent cells ¹⁰. RA exerts its effects by binding to RA receptors (RARα, β, γ) and retinoid X receptors (RXRα, β, γ). RARs and RXRs in a form of heterodimer bind to DNA motifs called RA-response elements, that is typically arranged as direct repeats of AGGTCA sequence (called as half site) and regulate transcription. Ligand-treatment experiments allowed the identification of several retinoic acid regulated genes in ES cells ^11,12. However, enhancer elements for many of these genes has not been described yet. To demonstrate how the here-described workflow can be used for enhancer identification and validation we show step-by-step the selection and characterization of two retinoic acid-dependent enhancers in embryonic stem cells.

Protocolo

1. Selecção Enhancer Com base na análise das microplacas-SEQ

1. Baixe o arquivo fastq dados brutos RXR ChIP-seq (mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz) a partir http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
2. Faça o download e extraia o arquivo de índice BWA necessário para o alinhamento (no nosso caso: Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz
   NOTA: Visita à https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts para obter mais informações sobre as etapas de análise bioinformática e para baixar os scripts usados ​​abaixo.
3. Alinhar o arquivo de exemplo fastq ao genoma MM10 (use o script: perform_alignment.sh). Isto irá criar uma pasta com um arquivo .bam e estatísticas do alinhamento. Alinhadas RXR dados Chip-seq (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam) e o arquivo de índice correspondente (.bai) estão disponíveis aqui:
   http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
   NOTA: BWA é um pacote de software que alinha relativamente sequências curtas (por exemplo, os resultados Chip-SEQ) para uma base de dados de sequência, tais como o genoma do rato de referência (por exemplo, MM10) ^13.
4. Executar o script (callpeaks.sh) para o pico de chamadas e análise motivo de novo. Use o arquivo .bam como a entrada. O roteiro é baseado em Homer findPeaks ^14.
   NOTA: Os arquivos de saída nos dar informações sobre o número total de picos, o enriquecimento dos motivos, a percentagem do fundo, e as sequências alvo com motivos, etc. (Figura 1). Normalmente vários motivos são listados em ordem de importância.
5. Remapear o # 1 motivo classificado (NR metade `AGGTCA`) (use o script: remap_motif.sh)
   NOTA: Como o resultado, o script gera um arquivo .bed que irá mostrar qual chip-picos estão cobrindo regiões genômicas que contêm o local de ligação canônica do factor de transcrição de interesse.
6. Faça o download e visualizar os resultados da lê RXR ChIP-seq alinhados (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam (também baixar o .bai)) e as ocorrências AGGTCA motivo (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) por Integrative Genomics Viewer (IGV) ¹⁵ para identificar RAR putativo / sítios de ligação RXR (Figura 2 e Figura 3).
   NOTA: Integração de vários dados Chip-seq ajudará a mais prever com precisão boas potenciadores candidatos ^16,17. Estudos recentes revelaram que potenciadores activas são tipicamente enriquecido para P300 e correlacionar com H3K4me1 e H3K27ac, e estão localizados em regiões de cromatina abertas, exibindo, assim, ADNase-I hipersensibilidade também é recomendado ^18-21.
7. Use "definir uma região de interesse" em IGV ¹⁵ para obter 200-400 pb de sequência da região genómica seleccionado e utilizar estas sequências para modelos de iniciadores subsequentes.

Ensaio 2. Reporter

NOTA: O sistema luciferina / luciferase é utilizadacomo um ensaio de repórter muito sensível para a regulação da transcrição. Dependendo da enzima luciferase actividade potenciadora é produzido que irá catalisar a oxidação da luciferina para oxiluciferina, resultando em bioluminescense, que pode ser detectado. Como um primeiro passo, sequências potenciadoras putativos identificados devem ser subclonada num vector repórter (eg, luciferase ^TK-22, ou pGL3 NanoLuc).

1. projeto Primer
   1. Primers projeto de PCR para amplificação de 200-400 bp das regiões potenciador putativos por Primer3 (disponível aqui: http://bioinfo.ut.ee/primer3/) ²³
   2. Copie e cole a sequência genómica de IGV que inclui o sítio de ligação putativo em Primer3 (veja o passo 1.7). Definir intervalo de tamanho de produto para 250-300 pb em Primer3.
   3. Validar os iniciadores de PCR usando o navegador UCSC Genome está em silico ferramenta de PCR (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) ²⁴
      NOTA: Este protocolo em uma etapa posterior usa HindIII e BamHI as enzimas de restrição para clonagem. Verificar se a sequência amplificada por PCR como previsto pela ferramenta de PCR UCSC in silico irá conter locais de restrição AAGCTT ou GGATCC (por exemplo, http://nc2.neb.com/NEBcutter2/).
   4. Obter os iniciadores necessários de um fornecedor comercial.
2. PCR A amplificação de Enhancer Sequência de DNA genômico
   1. Purifica-se o ADN genómico a partir de células primárias do modelo (por exemplo, fibroblastos embrionários primários). Use kit comercial para isolamento gDNA e siga as instruções do fabricante.
      NOTA: alta qualidade de gDNA é essencial para a amplificação bem sucedida. clones BAC apropriados podem ser utilizados se a PCR não é fácil a partir de ADNg.
   2. Preparar 50 uL da reacção de PCR contendo 100 ng de gDNA, 5 ul de tampão 10X, 3 uL _MgSO4 (25 mM), dNTP 5 ul (2 mM de cada), 1,5 ul Fwd iniciador (10? M), 1,5 ul Rev iniciador (10? M) , polimerase de ADN de 1 ul
      NOTA: Use DNA polimerase de alta fidelidade com uma baixa taxa de erro para as reações de PCR.
   3. Definir o ciclo de PCR (2 minutos a 95 ° C, (20 s 95 ° C, 10 s 58-65 ° C, 18 seg 70 ° C) x25 repetição, 2 min 70 ° C, sempre 4 ° C). Ajuste a temperatura de recozimento com a consideração do primer de valores previstos Tm.
   4. Purifica-se o produto de PCR com um kit de purificação de PCR comercial e seguir as instruções do fabricante.
   5. Introduzir os locais de restrição para clonagem, repetindo o PCR com os iniciadores, como utilizado acima, mas a adição de saliências nas suas extremidades 5 '(por exemplo, Enc: 5'-AAGCTT ATAT xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-3' (HindIII), Rev: 5'-GGATCC TATA xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx -3 '(BamHI)).
   6. Executar 5 ul do produto de PCR em gel de agarose para verificar a existência de produtos de PCR não específicos.
      NOTA: Se forem detectados mais bandas, executar todo o produto de PCR e purificar a banda apropriada por um kit de extracção de gel comercial.
3. Restrição
   NOTA: Para clonar inserção a montante do promotor TK ^22, o produto de PCR purificado e o vector (por exemplo, TK-Luc) deve ser digerido com HindIII e BamHI.
   1. Prepara-se uma mistura reaccional de 50 ul contendo 1 ug de produto de PCR purificado, 1 ul HindIII (20 U / ul), 1 ul BamHI (20 U / ul) e 5 ul de tampão 10X.
   2. Preparar um vector contendo 250 ul de mistura de reacção 5 ug (TK Luc, ou vector repórter alternativa), 5 ul de HindIII (20 U / ul), 5 ul BamHI (20 U / ul), 5 ul termossensível de fosfatase alcalina (1 U / ul) e 25 ul de tampão 10X.
      NOTA: AP tratamento do vector diminui grandemente a auto-ligação do vector de digeridos e, assim, o fundo.
   3. Incubar as misturas de reacção durante 4 horas a 37 ° C, em seguida, purificar os produtos da PCR digerido e o vector com um kit de purificação de PCR comercial.
4. Ligation
   1. Configurar a reação de ligação em tubos de PCR incluindo 2 ul 10x T4 tampão DNA ligase, 10 ng TK-Luc vector, inserção 50 ng (produto de PCR digerido), 1 ul DNA ligase de T4 (400 U / L) e livre de nuclease de água até 20 ul.
      NOTA: Preparar um controlo negativo em que a reacção não contém inserção.
   2. Misture suavemente a reação pipetando cima e para baixo, girar brevemente os tubos de PCR utilizando mini-centrífuga e, em seguida, incubar a RT durante 10 min.
   3. Inactivar pelo calor a 65 ° C durante 10 min, em seguida, em gelo e relaxar utilizar 5 uL do produto de transformação em 50 ul de células competentes (por exemplo, DH5a).
   4. Use procedimento de choque térmico padrão para transformar bactérias, pegar colônias e isolamento de DNA com um kit comercial. Validar todas as construções por sequenciação antes das próximas etapas.
5. A transfecção de células ES
   1. Utilizar placas de 48 poços. Adicionar 200 ul de 0,1% de gelatina solutião / poço 30 min antes do plaqueamento de células.
   2. Placa estaminais embrionárias (ES), as células de um dia antes da transfecção. Utilização de células ES livre de alimentação e da placa a uma densidade de 3 x 10 ⁴ culas por po em 250 uL meios ES / poço.
   3. Preparar as misturas de plasmídeos (cada mistura é calculado para 8 poços, 4 não tratado e 4 tratadas com ácido retinóico) Misturar 1:. 1250 ng TK-Luc vazio (controlo negativo), 950 ng β-Galactosidase codificar o vector de (βGal), mistura de dois : 1.250 ng TK-Luc Hoxa1 potenciador (controle positivo), 950 ng βGal, Mix 3: 1.250 ng TK-Luc PRMT8 potenciador (região de interesse), 950 ng βGal.
      NOTA: células ES expressar os fatores de transcrição desejados (RAR / RXR). Deixar poços não transf ectadas para determinar os valores de base mais tarde durante a luciferase e a β-galactosidase medições.
   4. Adicionar meio de soro reduzido de qualidade transfecção para cada plasmídeo misturar até 106 ul volume total (suficiente para 8 poços).
   5. Adicionar 4,5 mL transfecção qualidade ESreagente ion em seguida, misture com cuidado pipetando 15 vezes para cima e para baixo. Incubar a mistura de transfecção durante 10 min à TA.
   6. Adicionar 13 ul da mistura de transfecção às células por poço, homogeneiza-se por pipetagem. Colocar as células de volta na incubadora (37 ° C) O / N antes do tratamento ligando.
   7. Remova a mídia cuidadosamente por aspiração a partir de células e adicionar 250 ul fresco media / poço contendo 0,01 - 1 PM all-trans ácido retinóico (RA) como a concentração final ou DMSO como veículo. Incubar as células a 24 - 48 h.
      NOTA: O ácido retinóico é sensível à luz.
6. Preparação de Lisados ​​celulares
   1. Diluir 5x Tampão de Lise (1,25 ml de Tris 0,5 M pH = 7,8, 1 ml de 1 M de ditiotreitol (DTT) (em H ₂ O), 10 ml de EDTA 0,1 M pH = 8,0, 50 ml de glicerol, 5 mL de Triton X-100, estéril água até 100 mL) até 1x usando água estéril, adicionar 20 ul de DTT 1 M / 10 ml e equilibrar à temperatura ambiente antes de utilização. Preparar 10 ml de uma placa de 48 poços no dia do ensaio.
   2. Remova a mídia cuidadosamente por aspiração a partir de células. Lavar as células uma vez com PBS 1x. Adicionar 200 ul de 1x tampão de lise / poço directamente para as células.
   3. Agitar durante 2 h à RT (a lise química). Congelar os lisados ​​celulares na placa à temperatura de -80 ° C (lise mecânica). Os lisados ​​podem ser armazenados a -80 ° C durante vários dias.
   4. Descongelar os lisados. Após descongelação completa, transferir os lisados ​​de células para uma placa de 96 poços utilizando uma pipeta multicanal electrónica. Transferir 80 uL de ligado de células a placas de 96 poços para ensaio claro β-galactosidase e 40 ul de lisado celular a uma placa de branco para a medição da luciferase. Evitar a formação de bolhas.
7. β-galactosidase Ensaio
   NOTA: galactosidase Beta ou segundo repórteres alternativos devem ser utilizados como um controlo interno para a conta de variações experimentais não-específicas.
   1. Preparar tampão substrato β-galactosidase: 80,0 g de Na ₂ HPO ₄ • 7H ₂ O,3,8 g NaH ₂ PO ₄ • H ₂ O, 30,0 g de KCl, 1,0 g MgSO ₄ • 7H ₂ O, fazer até 1.000 ml com água estéril. Ajustar o pH para 7,4. Filtrar Esterilizar (0,2 micron) e armazenar a 4 ° C
   2. Misture tampão de substrato de 1 ml β-galactosidase com 4 mg de ONPG (o-nitrofenil-β-D-galactosidase). Adicionar 3,5 ul de 2-mercaptoetanol (βME) por 1 ml de tampão imediatamente antes da utilização. Adicionar 100 ul de tampão de substrato β-galactosidase de 80 ul lisado celular.
   3. Incubam-se as reacções a 37 ° C até que uma cor amarelo pálido foi desenvolvido. Ler a absorvância a OD 420 nm num leitor de placas e exportação de dados.
      NOTA: O tempo varia dependendo da eficiência de transfecção, geralmente não mais do que 30 min.
8. Ensaio de luciferase
   1. Prepare 50 ml de luciferina reagente substrato: 15,1 mg de sal D-luciferina, 82,7 mg de sal ATP, 185 mg _MgSO4 • 7H ₂ O, adicionar ao tubo de 50 ml de polipropileno,em seguida, adicionar 1,5 ml de tampão M HEPES 1, 48,5 ml ATP água livre, vortex, certifique-se todos os compostos dissolver completamente. Manter 5 - 10 mL de alíquotas a -80 ° C.
   2. Quente 5 ml de reagente de substrato de luciferina para a TA antes de iniciar. Pipeta reagente de substrato de 100 ul a cada poço da placa de branco contendo 40 ul de lisado celular e medir o sinal imediatamente utilizando uma máquina contador luminescente.
   3. Obter as actividades de pelo menos três experiências independentes em transfecções em triplicado.
   4. Calcular primeiro a actividade de luciferase normalizada base e valores normalizados β-galactosidase para cada poço de base, subtraindo os valores médios obtidos para as células não transf ectadas de cada valor medido. Em seguida, calcular a proporção da actividade de luciferase / β-galactosidase.

3. Caracterização de ARN Enhancer

NOTA: Um indicador mais direta da atividade potenciador emergiu recente genoma-wide estudos que identificaram muitas RNAs não-codificantes curtas, que variam em tamanho de 50 a 2000 nt, que são transcritas a partir de intensif icadores, e são denominados RNAs estimuladoras (Ernas) ^16,25,26 (Figura 4). indução Erna altamente correlacionada com a indução de genes codificadores de exões adjacentes. Assim, a actividade intensif icador dependente de sinal pode ser quantificado in vivo por meio da comparação da produção Erna entre várias condições por RT-qPCR.

1. Diretrizes para Primer design para detecção Erna por RT-qPCR
   1. Selecione regiões genômicas para medições Erna que são pelo menos 1,5-2 kb longe dos locais de início da transcrição anotados.
      NOTA: É importante, elevados níveis de transcrição de ARNm através potenciadores intragênicos evitar a quantificação precisa de Erna na orientação com sentido, anti-sentido em Ernas intragênicos potenciadores são detectáveis ​​e são semelhantes em nível de Ernas em extragênicos potenciadores.
   2. Como regra geral, use regiões 200 - 1.000 bp from o centro do factor de transcrição sítio de interesse para o desenho de primers em qualquer sentido ou cadeia anti-sentido (Figura 4 e Figura 6) de ligação.
      NOTA: Se GRO-SEQ, DNase-SEQ, H3K4me1, H3K4me3 ou dados H3K27ac ChIP-seq estão disponíveis a partir dos tipos de células desejadas e condições que podem ser utilizadas para a concepção de iniciadores mais preciso. Ernas são transcritos a partir de regiões potenciador putativos caracterizadas por altos níveis de H3K4me1 e me3. Expressão de Ernas correlaciona-se positivamente com o enriquecimento de activado marca potenciador histona H3K27ac.
   3. Primers projeto PCR para medição de RT-qPCR de Ernas baseada em corante fluorescente por Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/) ²³ Gerar sequência anti-sense (complemento da cadeia sentido inverso) para desenho de primers como por: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. Insira 200-300 bp de sentido ou anti-sentido sequência para o projeto primer.
2. Medição de Erna Transcrição
   1. Isolar o ARN total a partir de células tratadas com fenol acídico comercial reagente de extracção / à base de clorofórmio de acordo com as recomendações do fabricante.
   2. Use ADNasel para tratar ARN isolado antes de os usar na reacção de transcrição reversa. Inativar DNase de acordo com a recomendação do fabricante antes da transcrição reversa.
   3. Medir a concentração de ARN após tratamento com DNase I e usar 1000 ng por reacção de RT. Use alta qualidade transcriptase reversa.
      NOTA: Como grande número de Ernas não pode ser poliadenilado, a transcrição inversa requer a utilização de iniciadores aleatórios.
   4. Detectar a transcrição reversa Erna por RT-qPCR utilizando um processo padronizado. Medir um ARNm não dependente de tratamento para a normalização (por exemplo, 36B4, Ppia, GAPDH, ACTB).

Resultados

Foi utilizado um anticorpo RXR pan-específico, a fim de identificar quais genes regulados por RA genome-wide tem enriquecimento receptor em sua proximidade. Análise bioinformática de dados do chip-SEQ RXR obtidos a partir de células ES tratadas com ácido retinóico revelaram o enriquecimento da metade sítio do receptor nuclear (AGGTCA) sob a RXR ocupada locais (Figura 1). Utilizando um algoritmo de bioinformática que mapeada para trás o resultado da pesquisa para...

Discussão

In recent years, advances in sequencing technology have allowed large-scale predictions of enhancers in many cell types and tissues ^7-9. The workflow described above allows one to perform primary characterization of candidate enhancers chosen based on ChIP-seq data. The detailed steps and notes will help anyone to set up a routine enhancer validation in the lab.

The most critical step in the luciferase reporter assay is the transfection efficiency. It is recommended to include a GFP...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOD DNA polymerase	Merck Millipore	71085-3	for PCR amplification of enhancer from gDNA
DNeasy Blood & Tissue kit	Qiagen	69504	for genomic DNA isolation
QIAquick PCR Purification kit	Qiagen	28106	for PCR product purification
Gel extraction kit	Qiagen	28706	for gel extraction if there are more PCR product
HindIII	NEB	R3104L	restriction enzyme
BamHI	NEB	R3136L	restriction enzyme
FastAP	Thermo Scientific	EF0651	release of 5'- and 3'-phosphate groups from DNA
T4 DNA ligase	NEB	M0202	for ligation
QIAprep Spin Miniprep kit	Qiagen	27106	for plasmid isolation
DMEM	Gibco	31966-021	ES media
FBS	Hyclone	SH30070.03	ES media
MEM Non-Essential Amino Acid	Sigma	M7145	ES media
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333	ES media
Beta Mercaptoethanol	Sigma	M6250	ES media
FuGENE HD	Promega	E2311	transfection reagent
Opti-MEM® I Reduced Serum Medium	Life Technologies	31985-062	for transfection
All-trans retinoic acid	Sigma	R2625	ligand, for activation of RAR/RXR
96-well clear plate	Greiner	655101	for Beta galactosidase assay
96-well white plate	Greiner	655075	for Luciferase assay
D-luciferin, potassium salt	Goldbio.com	115144-35-9	for Luciferase assay
ATP salt	Sigma	A7699-1G	for Luciferase assay
MgSO4•7H2O	Sigma	230391-25G	for Luciferase assay
HEPES	Sigma	H3375-25G	for Luciferase assay
Na2HPO4 •7H2O	Sigma	431478-50G	for Beta galactosidase assay
NaH2PO4 •H2O	Sigma	S9638-25G	for Beta galactosidase assay
MgSO4•7H2O	Sigma	230391-25G	for Beta galactosidase assay
KCl	Sigma	P9541-500G	for Beta galactosidase assay
ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactosidase)	Sigma	N1127-1G	for Beta galactosidase assay
TRIzol®	Life Technologies	15596-026	RNA isolation
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Life Technologies	4368814	reverse transcription of eRNA
Rnase-free Dnase	Promega	M6101	Dnase treatment
SsoFast Eva Green	BioRad	750000105	RT-qPCR mastermix
CFX384 Touch™ Real-Time PCR Detection System	BioRad		qPCR machine
BioTek Synergy 4 microplate reader	BioTek		luminescent counter