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要約

In this work we provide an experimental workflow of how active enhancers can be identified and experimentally validated.

要約

胚発生は、多くの遺伝子の活性化と抑制を含む多段階プロセスです。ゲノム中のエンハンサーエレメントは、組織及び細胞分化の間の遺伝子発現の細胞型特異的調節に寄与することが知られています。したがって、それらの同定およびさらなる調査は、細胞の運命を決定する方法を理解するために重要です。遺伝子発現データ（ 例えば、マイクロアレイまたはRNA-seqの）およびクロマチン免疫沈降（ChIPの）ベースのゲノムワイドな研究（チップ配列）の結果の統合は、これらの調節領域の大規模な同定を可能にします。しかしながら、細胞型特異的エンハンサーの機能的検証は、in vitroおよびin vivo実験手順でさらに必要とします。ここでは、アクティブなエンハンサーを同定し、実験的に検証できる方法について説明します。このプロトコルは、ステップバイステップのワークフローを提供します：1）のChIP-seqのデータ解析による調節領域の同定、2）クローニングおよびEXPERimentalレポーターアッセイで同定されたゲノム配列の推定調節の可能性の検証、およびエンハンサーRNA転写物のレベルを測定することにより、in vivoでのエンハンサー活性の3）決意。提示されたプロトコルは、ラボでは、このワークフローを設定するために誰を助けるために十分に詳述されています。重要なことに、このプロトコルは容易に適応し、任意の細胞モデル系において使用することができます。

概要

Development of a multicellular organism requires precisely regulated expression of thousands of genes across developing tissues. Regulation of gene expression is accomplished in large part by enhancers. Enhancers are short non-coding DNA elements that can be bound with transcription factors (TFs) and act from a distance to activate transcription of a target gene1. Enhancers are generally cis-acting and most frequently found just upstream of the transcription start site (TSS), but recent studies also described examples where enhancers were found much further upstream, on the 3' of the gene or even within the introns and exons2.

There are hundreds of thousands of potential enhancers in the vertebrate genomes1. Recent methods based on chromatin immunoprecipitation (ChIP) provide high-throughput data of the whole genome that can be used for enhancer analysis3-9. Though data obtained by ChIP-seq experiments greatly increases the likelihood to identify cell and tissue-specific enhancers, it is important to keep in mind that detected binding sites do not necessarily identify direct DNA binding and/or functional enhancers. Thus, further functional analysis of newly identified enhancers is indispensable. In this work, we present a basic three-step process of putative active enhancer identification and validation. This includes: 1) selection of putative transcription factor binding sites by bioinformatics analysis of ChIP-seq data, 2) cloning and validation of these regulatory sequences in reporter constructs, and 3) measurement of enhancer RNA (eRNA).

Exposure of embryonic stem (ES) cells to retinoic acid (RA) is frequently used to promote neural differentiation of the pluripotent cells 10. RA exerts its effects by binding to RA receptors (RARα, β, γ) and retinoid X receptors (RXRα, β, γ). RARs and RXRs in a form of heterodimer bind to DNA motifs called RA-response elements, that is typically arranged as direct repeats of AGGTCA sequence (called as half site) and regulate transcription. Ligand-treatment experiments allowed the identification of several retinoic acid regulated genes in ES cells 11,12. However, enhancer elements for many of these genes has not been described yet. To demonstrate how the here-described workflow can be used for enhancer identification and validation we show step-by-step the selection and characterization of two retinoic acid-dependent enhancers in embryonic stem cells.

プロトコル

チップ-seqの分析に基づく1エンハンサーの選択

  1. http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/からRXRのChIP-seqの生データFASTQファイル（mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz）をダウンロード
  2. 我々の場合で（位置合わせのために必要なBWAインデックスファイルをダウンロードし、解凍します。 Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz
    注：バイオインフォマティクス解析の手順の詳細についてはhttps://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scriptsにアクセスして、以下で使用するスクリプトをダウンロードします。
  3. （：perform_alignment.shスクリプトを使用）MM10ゲノムに例のFASTQファイルを合わせます。これは.bamファイルとアライメントの統計でフォルダを作成します。整列RXRのChIP-seqのデータ（mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam）、および対応するインデックスファイル（.bai）は、ここで使用できます。
    http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
    注：BWAはRELAを整列ソフトウェアパッケージです例えば、マウスの参照ゲノム（ 例えば、MM10）13のような配列データベースにtively短い配列（ 例えば、のChIP-seqの結果）、。
  4. ピークの呼び出しおよびデノボモチーフ解析のためのスクリプト（callpeaks.sh）を実行します。入力として.bamファイルを使用してください。スクリプトは、ホーマーfindPeaks 14に基づいています。
    注：出力ファイルは、私たちにピークの合計数、モチーフの濃縮、背景の割合、およびなどのモチーフと標的配列についての情報を与えます。 （ 図1）。典型的には、いくつかのモチーフは、その重要性の順に記載されています。
  5. （：remap_motif.shスクリプトを使用）1位にランクモチーフ（NRの半分 `AGGTCA`）をリマップ
    注：この結果、スクリプトは、チップのピークが関心の転写因子の標準的な結合部位を含むゲノム領域をカバーしているが表示されます.bedファイルを生成します。
  6. （mm_ES_RXをダウンロードして、読み込み整列RXRのChIP-seqの結果を可視化推定されるRAR / RXR結合部位（ 図2と図3）を識別するための統合的ゲノミクスビューア（IGV）15によってR_24h_ATRA.bam（も.baiをダウンロード））とAGGTCAモチーフの発生（mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed）。
    注：さまざまなのChIP-seqのデータの統合は、より正確に良い候補増強剤に16,17を予測するのに役立ちます。最近の研究では、アクティブなエンハンサーは、通常、P300について濃縮し、H3K4me1とH3K27acと相関し、また、18から21をお勧めします、それによりDNアーゼI過敏症を表示し、開いたクロマチン領域に配置されていることを明らかにしました。
  7. 選択されたゲノム領域の400塩基対の配列と、それに続くプライマーの設計のためにこれらの配列を使用する- 200を得るために、IGV 15に「 関心領域の定義 」 を使用します。

2.レポーターアッセイ

注：ルシフェリン/ルシフェラーゼ系が使用されています転写調節のために非常に敏感なレポーターアッセイとして。エンハンサー活性に依存するルシフェラーゼ酵素を検出することができるbioluminescense、その結果ルシフェリンをオキシルシフェリンの酸化を触媒すること製造されます。最初のステップとして、同定された推定エンハンサー配列は、レポーターベクター（ 例えば、TK-ルシフェラーゼ22、のpGL3またはNanoLuc）にサブクローニングする必要があります。

  1. プライマーの設計
    1. （：http://bioinfo.ut.ee/primer3/ここから入手可能）23プライマー3によって推定されるエンハンサー領域の400bpの- 200の増幅のための設計PCRプライマー
    2. プライマー3（ステップ1.7を参照）に推定結合部位を含むIGVからゲノム配列をコピーし、貼り付けます。プライマー3で300 bpの - 250に設定し、製品のサイズ範囲。
    3. インシリコ PCRツール（https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr）24 で UCSCゲノムブラウザのを使用して、PCRプライマーを検証
      注：後の工程でこのプロトコルは、のHindIIIを使用していますIおよびBamHI制限は、クローニングのための酵素。 インシリコ PCRツールは（ 例えば、http://nc2.neb.com/NEBcutter2/）AAGCTTまたはGGATCC制限部位が含まれていますUCSCによって予測されるようにPCR増幅した配列かどうかを確認してください。
    4. 商用ベンダーから必要なプライマーを入手します。
  2. ゲノムDNAからのエンハンサー配列のPCR増幅
    1. 初代細胞（ 例えば、初代胚線維芽細胞）からテンプレートのゲノムDNAを精製します。 gDNAの単離のための市販のキットを使用し、製造元の指示に従ってください。
      注：のgDNAの高品質が成功したPCR増幅のために不可欠です。 PCRは、gDNAをより容易でない場合は、適切なBACクローンを使用することができます。
    2. gDNAのngの100を含む50μlのPCR反応を準備し、5μlの10×緩衝液、3μlの硫酸マグネシウム（25 mM）の、5μlのdNTPを（各2mM）、1.5μlの早送りプライマー（10μM）、1.5μlの改訂プライマー（10μM） 、1μlのDNAポリメラーゼ
      注：PCR反応のための低エラーレートと高忠実度DNAポリメラーゼを使用してください。
    3. PCRサイクル設定（2分95℃、（20秒95℃、10秒を58から65°C、18秒70°C）のx25繰り返し、2分70°C、永遠に4°C）。プライマーのを考慮した設定アニール温度は、Tm値を予測しました。
    4. 商業PCR精製キットを用いてPCR産物を精製し、製造元の指示に従ってください。
    5. 上記で使用されるプライマーを用いてPCRを繰り返し、それらの5 '末端（ 例えば、早送り：5'-ATAT AAGCTTの xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-3'のオーバーハングを追加することによって、クローニングのための制限部位を導入する（HindIIIで）、REV：5'- TATA GGATCC xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx -3 '（BamHIで））。
    6. 非特異的なPCR産物を確認するためにアガロースゲル上でPCR産物の5μLを実行します。
      注：複数のバンドが検出された場合、全体のPCR産物を実行し、商業ゲル抽出キットを用いて適切なバンドを精製します。
  3. 制限
    注：HindIII及びBamHIで消化されるべきであるTKプロモーター22精製したPCR産物およびベクター（ 例えば、TK-リュック）の上流に挿入クローニングするために。
    1. 1μgの精製PCR産物、1μlのをHindIII（20 U /μl）を、1μlのをBamHI（20 U /μl）を5μlの10×緩衝液を含む50μlの反応混合物を準備します。
    2. 5μgのベクター（TKリュック、または代替レポーターベクター）、5μlのをHindIII（20 U /μl）を、5μlのをBamHI（20 U /μl）を、5μlの感熱アルカリホスファターゼ（1 U /μl）を含む250μlの反応液を調製そして、25μlの10×バッファー。
      注：ベクトルのAP処理が大幅に単一消化ベクターのセルフライゲーションので、バックグラウンドを減少させます。
    3. 次に商用PCR精製キットを用いて消化したPCR産物およびベクターを精製し、37℃で4時間、反応混合物をインキュベートします。
  4. Ligation個
    1. 2μlの10×T4 DNAリガーゼ緩衝液、10 ngのTK-Lucベクター、50ngのインサート（消化したPCR産物）、1μlのT4 DNAリガーゼ（400 U /μl）を、およびヌクレアーゼフリー水を含むPCRチューブ内ライゲーション反応をセットアップします20μlのまで。
      注：反応は、インサートを含まないネガティブコントロールを準備します。
    2. 静かにピペッティングすることによって反応をミックスダウン、ミニ遠心機を使用して簡単にPCRチューブをスピンダウンした後、室温で10分間インキュベートします。
    3. 熱は氷の上でリラックスし、50μlのコンピテント細胞（ 例えば、DH5α）への形質転換のために、製品の5μLを使用し、その後65℃で10分間不活性化します。
    4. 市販のキットを用いて、細菌を形質転換コロニーをピックアップし、プラスミドDNAを単離するための標準的な熱ショック手順を使用します。次のステップの前に配列決定することにより全ての構築物を検証します。
  5. ES細胞のトランスフェクション
    1. 48ウェルプレートを使用してください。 200μlの0.1％のゼラチンsolutを追加します。細胞播種の前にイオン/ウェルの30分。
    2. 板胚性幹（ES）細胞をトランスフェクションの前日。 /ウェル250μlのES培地でウェルあたり3×10 4細胞の密度で、フィーダーを含まないES細胞とプレートを使用してください。
    3. 。プラスミドミックスを準備ミックス （各ミックスは、未処理の4,4は、レチノイン酸処理した8ウェルについて計算される）1：1250 ngのTK-Lucの空（ネガティブコントロール）、950 ngのβガラクトシダーゼコーディングベクトル（のβGal）、 ミックス2 ：1250 ngのTK-LucのHOXA1エンハンサー（ポジティブコントロール）、のβGalngの950、 ミックス3：1250 NGのTK-LucのPRMT8エンハンサー（関心領域）、950 ngののβGal。
      注記：ES細胞は、所望の転写因子を発現する（RAR / RXR）。ルシフェラーゼおよびβガラクトシダーゼ測定中に、後に基準値を決定するためにトランスフェクトしていない井戸を残します。
    4. 106μlに（8ウェルについて十分な）総容量をミックス各プラスミドにトランスフェクション品質低血清培地を追加します。
    5. 4.5μlのES品質トランスフェクションを追加します。イオン試薬は、次に上下に15回ピペッティングすることによって慎重に混ぜます。 RTで10分間トランスフェクション混合物をインキュベートします。
    6. 、ウェルあたりの細胞にトランスフェクション混合物の13μl加え、ピペッティングにより完全に混和します。バックリガンド処理前のインキュベーター（37°C）O / Nへの細胞を配置します。
    7. 細胞からの吸引により慎重にメディアを取り出して、250μlを添加する新鮮な培地/ウェル0.01含む - 車両として最終濃度またはDMSOなど1μMの全トランスレチノイン酸（RA）を。 48時間 - 24細胞をインキュベートします。
      注：レチノイン酸は光に敏感です。
  6. 細胞溶解物の調製
    1. 希薄5倍の溶解緩衝液（1.25ミリリットル0.5 MトリスpH値= 7.8、H 2 Oで1ミリリットルの1Mジチオスレイトール（DTT）（）、10ミリリットルの0.1M EDTAをpH = 8.0、50ミリリットルの無菌グリセロール、5ミリリットルのTriton X-100、 100ミリリットルまで水）は、滅菌水を使用して1倍20μlの1 M DTT / 10ミリリットルを追加し、使用前に室温に平衡化します。アッセイの日に48ウェルプレート用の10ミリリットルを準備します。
    2. 細胞からの吸引により慎重にメディアを取り出します。 1×PBSで細胞を1回すすいでください。細胞に200μlの1×溶解緩衝液/ウェルに直接追加します。
    3. RTで2時間（化学溶解）振とうします。 -80°C（機械的溶解）でプレート上の細胞溶解物をフリーズします。溶解物を数日間-80℃で保存することができます。
    4. 溶解物を解凍します。完全に解凍した後、電子マルチチャンネルピペットを用いて96ウェルプレートに細胞溶解物を移します。 βガラクトシダーゼアッセイおよびルシフェラーゼ測定用の白色板に細胞溶解物の40μlのための96ウェル透明プレートに移し、細胞溶解物の80μlのを。任意の気泡を形成することは避けてください。
  7. βガラクトシダーゼアッセイ
    注：ベータガラクトシダーゼまたは代替第二のレポーターは、非特異的な実験のばらつきを考慮するために、内部コントロールとして使用されるべきです。
    1. βガラクトシダーゼ基質緩衝液を準備します：80.0グラムのNa 2 HPO 4•7H 2 O、3.8グラムののNaH 2 PO 4•H 2 O、30.0グラムのKCl、1.0グラムのMgSO 4•7H 2 O、滅菌水で千ミリリットルに構成しています。 pHを7.4に調整します。滅菌（0.2ミクロン）を濾過し、4℃で保存
    2. 4ミリグラムONPGで1ミリリットルβガラクトシダーゼ基質緩衝液を混合（o-ニトロフェニルβ-D-ガラクトシダーゼ）。使用直前に緩衝液1mlあたり2メルカプトエタノール（βME）の3.5μlを添加します。 80μlの細胞溶解液に100μlのβガラクトシダーゼ基質緩衝液を追加します。
    3. かすかな黄色が開発されるまで、37℃で反応をインキュベートします。プレートリーダーおよびエクスポートデータにOD 420 nmの吸光度を読みます。
      注：時間は、通常、もう30分より、トランスフェクション効率に依存して変化しません。
  8. ルシフェラーゼアッセイ
    1. 、50ミリリットルポリプロピレンチューブに追加し、15.1ミリグラムD-ルシフェリン塩、82.7 mgのATP塩、185 mgの硫酸マグネシウム4•7H 2 O：50ミリリットルルシフェリン基質試薬を準備しますその後、1.5ミリリットルの1M HEPESバッファー、48.5ミリリットルATP遊離水、渦を追加するすべての化合物が完全に溶解していることを確認します。 -80℃で10ミリリットルのアリコート - 5を保管してください。
    2. 開始する前に室温に温まる5ミリリットルルシフェリン基質試薬。細胞溶解物の40μLを含む白色プレートの各ウェルにピペットで100μlの基質試薬および発光カウンター機を用いて、すぐの信号を測定します。
    3. 三重トランスフェクションでは、少なくとも3つの独立した実験からのアクティビティを取得します。
    4. 測定された各値から非トランスフェクトされた細胞について測定した平均値を減算することにより、最初の各ウェルのベース正規化されたルシフェラーゼ活性とベース正規化されたβガラクトシダーゼ値を計算します。その後、ルシフェラーゼ/βガラクトシダーゼ活性の比率を計算します。

エンハンサーRNAの3キャラクタリゼーション

注：エンハンサー活性のより直接的な指標は、最近のゲノムワットから浮上していますエンハンサーから転写され、およびエンハンサーのRNA（eRNAs）16,25,26（ 図4）と呼ばれるntの50から2000までの範囲の大きさの多くの短い非コードRNAを、識別されたIDE研究。エルナ誘導は非常に隣接するエクソンをコードする遺伝子の誘導と相関します。したがって、信号依存エンハンサー活性は、RT-qPCRにより種々の条件の間のエルナ産生を比較することにより、in vivoで定量化することができます。

  1. RT-qPCRによりエルナ検出用プライマーの設計のためのガイドライン
    1. 2キロバイト離れた注釈付きの転写開始部位から - 少なくとも1.5であるエルナ測定のためのゲノム領域を選択します。
      注：重要なのは、遺伝子内エンハンサー全体のmRNA転写の高レベルはセンス方向でエルナの正確な定量化を防ぐため、遺伝子内エンハンサーでのアンチセンスeRNAsは、検出可能であり、遺伝子外エンハンサーでeRNAsにレベルが類似しています。
    2. 一般的なルールとして、地域200を使用 - 1,000 bpのあちこちセンスまたはアンチセンス鎖（ 図4、 図6）のプライマー設計のための目的の転写因子結合部位の中心をmです。
      注：GRO-seqの、DNアーゼ-seqの、H3K4me1、H3K4me3とまたはH3K27acのChIP-seqのデータは、それがより正確なプライマー設計に使用することができ、所望の細胞型および条件から市販されている場合。 eRNAsはH3K4me1とME3の高いレベルを特徴と推定されるエンハンサー領域から転写されます。 eRNAsの発現は、積極的に活性化されたエンハンサーヒストンマークH3K27acの濃縮と相関します。
    3. プライマー3によってeRNAsの蛍光染料ベースのRT-qPCRの測定のための設計PCRプライマー（http://bioinfo.ut.ee/primer3/）23に従って、プライマー設計のためのアンチセンス配列（センス鎖の相補体を反転）を生成します。 http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html。プライマー設計のためのセンスまたはアンチセンス配列の300bpの - 200を挿入します。
  2. エルナ転写の測定
    1. 製造業者の推奨に従って商業酸性フェノール/クロロホルムベースの抽出試薬で処理した細胞から全RNAを分離します。
    2. 前逆転写反​​応でそれらを使用して単離されたRNAを治療するためのDNアーゼIを使用してください。逆転写の前に、製造業者の推奨に従ってDNアーゼを不活性化します。
    3. DNアーゼI処理した後、RNA濃度を測定し、RT反応1,000 ngのを使用します。高品質の逆転写酵素を使用してください。
      注：eRNAs多数のポリアデニル化されないかもしれないように、逆転写は、ランダムプライマーの使用を必要とします。
    4. 検出は、逆の標準的な手順を用いて、RT-qPCRによりエルナを転写しました。正規化のための非治療に依存してmRNAを測定する（ 例えば、36B4、PPIA、GAPDH、ACTB）。

結果

我々はゲノムワイドRA調節遺伝子は、その近接して受容体濃縮を持っている識別するために、汎特異的RXR抗体を使用します。レチノイン酸で処理されたES細胞から得られたRXRチップ、配列データのバイオインフォマティクス解析は、RXR部位を占領下で核内受容体半部位（AGGTCA）（ 図1）の濃縮が明らかになりました。バイオインフォマティクスのアルゴリ?...

ディスカッション

In recent years, advances in sequencing technology have allowed large-scale predictions of enhancers in many cell types and tissues 7-9. The workflow described above allows one to perform primary characterization of candidate enhancers chosen based on ChIP-seq data. The detailed steps and notes will help anyone to set up a routine enhancer validation in the lab.

The most critical step in the luciferase reporter assay is the transfection efficiency. It is recommended to include a GFP...

開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

The authors would like to acknowledge Dr. Bence Daniel, Matt Peloquin, Dr. Endre Barta, Dr. Balint L Balint and members of the Nagy laboratory for discussions and comments on the manuscript. L.N is supported by grants from the Hungarian Scientific Research Fund (OTKA K100196 and K111941) and co-financed by the European Social Fund and the European Regional Development Fund and Hungarian Brain Research Program - Grant No. KTIA_13_NAP-A-I/9.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
KOD DNA polymeraseMerck Millipore71085-3for PCR amplification of enhancer from gDNA
DNeasy Blood & Tissue kit Qiagen69504for genomic DNA isolation
QIAquick PCR Purification kitQiagen28106for PCR product purification
Gel extraction kit Qiagen28706for gel extraction if there are more PCR product
HindIIINEBR3104Lrestriction enzyme
BamHINEBR3136Lrestriction enzyme
FastAPThermo ScientificEF0651release of 5'- and 3'-phosphate groups from DNA
T4 DNA ligaseNEBM0202for ligation
QIAprep Spin Miniprep kitQiagen27106for plasmid isolation
DMEMGibco31966-021ES media
FBSHycloneSH30070.03ES media
MEM Non-Essential Amino AcidSigmaM7145ES media
Penicillin-StreptomycinSigmaP4333ES media
Beta MercaptoethanolSigmaM6250ES media
FuGENE HD PromegaE2311transfection reagent
Opti-MEM® I Reduced Serum MediumLife Technologies31985-062for transfection
All-trans retinoic acidSigmaR2625ligand, for activation of RAR/RXR
96-well clear plateGreiner655101for Beta galactosidase assay
96-well white plateGreiner655075for Luciferase assay
D-luciferin, potassium saltGoldbio.com115144-35-9for Luciferase assay
ATP saltSigmaA7699-1Gfor Luciferase assay
MgSO4•7H2OSigma230391-25Gfor Luciferase assay
HEPESSigmaH3375-25Gfor Luciferase assay
Na2HPO4 •7H2OSigma431478-50Gfor Beta galactosidase assay
NaH2PO4 •H2OSigmaS9638-25Gfor Beta galactosidase assay
MgSO4•7H2OSigma230391-25Gfor Beta galactosidase assay
KClSigmaP9541-500Gfor Beta galactosidase assay
ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactosidase)SigmaN1127-1Gfor Beta galactosidase assay
TRIzol®Life Technologies15596-026RNA isolation
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitLife Technologies4368814reverse transcription of eRNA
Rnase-free DnasePromegaM6101Dnase treatment
SsoFast Eva GreenBioRad750000105RT-qPCR mastermix
CFX384 Touch™ Real-Time PCR Detection SystemBioRadqPCR machine
BioTek Synergy 4 microplate readerBioTekluminescent counter

参考文献

  1. Wamstad, J. A., Wang, X., Demuren, O. O., Boyer, L. A. Distal enhancers: new insights into heart development and disease. Trends in cell biology. 24, 294-302 (2014).
  2. Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., Bejerano, G. Enhancers: five essential questions. Nat Rev Genet. 14, 288-295 (2013).
  3. Mardis, E. R. ChIP-seq: welcome to the new frontier. Nature methods. 4, 613-614 (2007).
  4. Muller, F., Tora, L. Chromatin and DNA sequences in defining promoters for transcription initiation. Biochim Biophys Acta. 1839, 118-128 (2013).
  5. Ounzain, S., Pedrazzini, T. The promise of enhancer-associated long noncoding RNAs in cardiac regeneration. Trends Cardiovasc Med. , (2015).
  6. Lam, M. T., Li, W., Rosenfeld, M. G., Glass, C. K. Enhancer RNAs and regulated transcriptional programs. Trends Biochem Sci. 39, 170-182 (2014).
  7. Dickel, D. E., et al. Function-based identification of mammalian enhancers using site-specific integration. Nature methods. 11, 566-571 (2014).
  8. Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1. Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).
  9. Vermunt, M. W., et al. Large-scale identification of coregulated enhancer networks in the adult human brain. Cell reports 9. , 767-779 (2014).
  10. Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev Biol. 168, 342-357 (1995).
  11. Mahony, S., et al. Ligand-dependent dynamics of retinoic acid receptor binding during early neurogenesis. Genome Biol. 12 (R2), (2011).
  12. Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Lett. 584, 3123-3130 (2010).
  13. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
  14. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38, 576-589 (2010).
  15. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
  16. Daniel, B., et al. The active enhancer network operated by liganded RXR supports angiogenic activity in macrophages. Genes Dev. 28, 1562-1577 (2013).
  17. Zhu, Y., et al. Predicting enhancer transcription and activity from chromatin modifications. Nucleic Acids Res. 41, 10032-10043 (2013).
  18. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457, 854-858 (2009).
  19. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nat Genet. 39, 311-318 (2007).
  20. Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470, 279-283 (2010).
  21. Bonn, S., et al. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44, 148-156 (2012).
  22. Hollenberg, S. M., Giguere, V., Segui, P., Evans, R. M. Colocalization of DNA-binding and transcriptional activation functions in the human glucocorticoid receptor. Cell. 49, 39-46 (1987).
  23. Untergasser, A., et al. Primer3--new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40, e115 (2012).
  24. Rhead, B., et al. The UCSC Genome Browser database: update 2010. Nucleic Acids Res. 38, D613-D619 (2010).
  25. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465, 182-187 (2010).
  26. Wang, D., et al. Reprogramming transcription by distinct classes of enhancers functionally defined by eRNA. Nature. 474, 390-394 (2011).
  27. Simandi, Z., et al. PRMT1 and PRMT8 regulate retinoic acid-dependent neuronal differentiation with implications to neuropathology. Stem Cells. 33, 726-741 (2014).
  28. Zhou, H. Y., et al. A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential. Genes Dev. 28, 2699-2711 (2014).

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