تستخدم علفا بروتوكول مسار طول ل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات

Summary

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

Abstract

والدروسوفيلاميلانوجاستر اليرقات مسار بطول النمط الظاهري هو مقياس واستخدامها لدراسة المساهمات الوراثية والبيئية للتغيير السلوكي. وقد وضعت اليرقات فحص مسار طول لقياس الفروق الفردية في السلوك تستخدم علفا التي ارتبطت في وقت لاحق هذا الجين تستخدم علفا. اليرقات مسار طول هو سمة سجل بسهولة أن يسهل جمع عينات كبيرة الحجم، بأقل تكلفة ممكنة، لشاشات الوراثية. هنا نقدم وصفا مفصلا للبروتوكول الحالي لاليرقات فحص مسار بطول استخدم لأول مرة من قبل Sokolowski. تفاصيل البروتوكول كيفية التعامل مع بتكاثر حيوانات الاختبار، إجراء فحص السلوكية وتحليل البيانات. مثال عن كيفية الفحص يمكن استخدامها لقياس المرونة السلوكية في الاستجابة للتغيرات البيئية، من خلال بيئة تغذية التلاعب قبل إجراء الفحص، وتقدم أيضا. وأخيرا، تصميم الاختبار المناسب فضلا عن العوامل البيئية التي يمكن تعديلوتناقش اليرقات مسار بطول مثل نوعية الغذاء والعمر التنموي والآثار اليوم.

Introduction

منذ اكتشاف الجين بيضاء في مختبر توماس مورغان في عام 1910، وقد استخدمت ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة (د البطن)، كنموذج لدراسة الأسس الجزيئية والفيزيولوجية للعمليات البيولوجية المختلفة. شعبية د. البطن ينبع إلى حد كبير من كمية كبيرة ومتنوعة من الأدوات الجينية. حجم ذبابة الفاكهة الصغير، وسهولة النسبية للمعالجة وتوليد وقت قصير يجعله نموذجا مثاليا للدراسات علم الوراثة. على قدم المساواة المهم هو قدرة ذبابة الفاكهة لاظهار العديد من الظواهر التي عبر عنها أكثر الكائنات الحية المعقدة بما فيها الثدييات. وهذا يشمل الظواهر المعقدة مثل السلوك التي تقف في واجهة بين الكائن الحي وبيئته. كما ساهمت هذه والدراسات السلوكية على ذبابة الفاكهة بشكل كبير في فهمنا لكيفية الجينات والبيئة تتوسط السلوك1.

واحدة من الدراسات الأولى من د. التحقيق في سلوك اليرقات البطن الفروق الفردية في استراتيجيات تستخدم علفا اليرقات عن طريق قياس أطوال مسار اليرقات ² في حين تغذية. تم تعريف مسار طول والمسافة الإجمالية التي يقطعها يرقة واحدة على الخميرة، خلال مدة خمس دقائق. كل من السلالات المخبرية والذباب من الطبيعي للسكان في تورونتو تفاوتت في السلوكيات البحث عن الطعام، وكان هناك عنصر وراثي إلى الفروق الفردية في مسار طول. وقد وصفت اثنين نقرأ تستخدم علفا اليرقات من التوزيعات مسار بطول الكمية وكانت تسمى روفر وحاضنة. روفرز تبدي أطول مسار أطوال حين تعبر مساحة أكبر في حين على ركيزة الغذاء من المعتصمون. باستخدام هذا المسار طول فحص، دي حسناء وآخرون. ³ تعيين تستخدم علفا (ل) الجينات الكامنة وراء هذه الاختلافات السلوكية الفردية إلى موقع منفصل على chromosome- 2 (24A3-24C5). ود. مelanogaster لالجيني تم استنساخ في وقت لاحق ⁴ وكشفت أن يكون المركب تعتمد بروتين كيناز ^5، المغير من علم وظائف الأعضاء والسلوك في ذبابة الفاكهة وغيرها من الكائنات ^6.

نحن هنا الخطوط العريضة للبروتوكول الحالي لاليرقات فحص مسار طول وضعت أصلا في Sokolowski ^2. على الرغم من أن بعض جوانب الفحص تغيرت على مر السنين، والمفهوم الكامن وراء تصميم لديه لا. كما نقوم بتوفير البيانات لتوضيح إمكانية فحص لتقييم المساهمات الوراثية والبيئية إلى الفروق الفردية في السلوك تستخدم علفا لليرقات ذبابة الفاكهة. اليرقات مسار بطول فحص بسيط وفعال، ولكن قوية. ويمكن لشخص واحد اختبار ما يصل الى 500 اليرقات بكل سهولة في أربع ساعات والنتائج التي يمكن الحصول عليها مع مستوى عال من التكاثر. وضعت أصلا لتوطين ل، يمكن استخدامه في شاشات الوراثية، الكمي رسم الخرائط موضع الصفة، والدراساتمن الجينات التي كتبها للبيئة (GXE) التفاعلات. وعلاوة على ذلك، بساطته واستنساخ جعلها موردا كبيرا للتدريس في المرحلة الجامعية.

Protocol

1. إعداد لوحات العنب وزجاجات القابضة للجمع يرقات

1. لصنع زجاجات عقد، وقطع ثقوب في جانب واحد من زجاجات 6 أوقية ثقافة الطاير، كبيرة بما يكفي لتناسب المكونات قنينة الطيران لتوفير الهواء (الشكل 1D).
2. لجعل لوحات العنب، وإعداد 250 مل من المتوسط ​​عصير العنب (1.8٪ أجار، 45٪ عصير العنب، حامض الخليك 2.5٪، 2.5٪ من الإيثانول) من خلال غلي أجار، عصير العنب وأكثر من الماء، ويبرد إلى 70 درجة مئوية ( إثارة في حين التبريد)، ثم إضافة حمض الخليك والإيثانول وحتى تصل الى حجم بالماء.
3. استخدام حقنة (بدون إبرة) لملء 35 × 10 ملم بيتري الأغطية طبق حتى سطح المتوسط ​​عصير العنب يجعل قبة فوق الشفة من الغطاء (الشكل 1A).
4. لوحات تخزين العنب في وعاء محكم الرطبة وعند 4 درجات مئوية حتى استخدام (تصل إلى حد أقصى قدره 2 أسابيع).

2. إعداد لوحات للأغذية

1. إعداد القياسية وصفة الطعام ذبابة.
   ملاحظة: لرطبقا لتقديرات نوعية الآثار تربية الطعام على مسار بطول استخدمنا منخفض المغذيات ذبابة المواد الغذائية: 10٪ سكروز، 1.3٪ أجار، 0.8٪ طرطرات الصوديوم والبوتاسيوم، 0.1٪ monopotassium الفوسفات، 0.05٪ كلوريد الصوديوم، 0.05٪ كلوريد الكالسيوم، 0.05٪ كلوريد المغنيسيوم، 0.05٪ كبريتات الحديد، 5٪ الخميرة وحمض البروبيونيك 0.5٪ في الماء؛ وارتفاع المواد الغذائية المواد الغذائية الطيران: 1.5٪ سكروز، 1.4٪ أجار، 3٪ جلوكوز، و 1.5٪ من دقيق الذرة، 1٪ جنين القمح، 1٪ دقيق الصويا، و 3٪ مولاس، 3.5٪ الخميرة، وحمض البروبيونيك 0.5٪، 0.2٪ Tegosept و1 ٪ من الإيثانول في الماء. لكل من الأطعمة الأوتوكلاف الحل وبارد إلى 50 ^درجة مئوية قبل إضافة حمض البروبيونيك، Tegosept والايثانول.
2. صب 40 مل من المواد الغذائية يطير إلى 100 س 15mm أطباق بتري.
3. لوحات تخزين المواد الغذائية في وعاء محكم الرطبة وعند 4 درجات مئوية حتى استخدام (تصل إلى حد أقصى قدره 2 أسابيع).

3. إعداد لوحات الاختبار

1. إعداد 58 × 25 سم، 6 مم لوحات زجاجي أسود مع 10، 1 ملم آبار دائرية عميقة، 10 سم وقطرها مرتبة في 2 × 5 دESIGN (الشكل 1C) لاختبار اليرقات على.
   ملاحظة: ما يصل إلى 30 يرقات يمكن اختبارها في الوقت إذا تتوفر 3 أو أكثر من لوحات زجاجي أعلاه. بدلا من ذلك، اليرقات يمكن اختبارها في أطباق بتري، 10 سم في القطر. هذا الخيار هو أكثر شاقة بكثير، ويسمح لانخفاض أعداد اليرقات لفحصها.
2. الحصول على الأسود 39 × 8 سم، 6 مم زجاجي سميك رش لنشر عجينة الخميرة على لوحات اختبار زجاجي.
3. إعداد 100 × 15 مم الأغطية طبق بتري لتسجيل اليرقات مسار أطوال عن طريق فصل الأغطية من قيعان مقدما.

4. إعداد السكان الوالدين

1. حافظ على ظروف الاستزراع ثابتة طوال فحص كامل (على سبيل المثال، 25 درجة مئوية، الرطوبة 60٪، و12:12 الخفيفة: دورة الظلام على الغذاء ذبابة قياسي).
2. رفع سكان الوالدين في ظروف تربية نفسها.
3. جمع 100-150 الإناث و50-75 ذكور والسن منهم لمدة 5 ± 1 أيام للخصوبة المثلى.
4. سماح وemales والذكور للتزاوج بين عشية وضحاها في زجاجة الثقافة ذبابة 6 أوقية مع الطعام ذبابة القياسية.
5. نقل الذباب في زجاجة عقد وتأمين لوحة العنب (كمية صغيرة من معجون الخميرة الطازجة على لوحة العنب وتعزيز وضع البيض؛ الشكل 1B) فوق الجزء العلوي مع اخفاء الشريط (الشكل 1E).
6. ترك زجاجات الوقوف رأسا على عقب (الشكل 1F)، مع لوحة العنب في الجزء السفلي للسماح الكبار لتضع بيضها على لوحة العنب.
7. تجاهل أول لوحة العنب بعد 24 ساعة ووضع لوحة العنب جديدة في زجاجة القابضة. وستكون هذه هي لوحة العنب الذي يتم جمع اليرقات في اليوم التالي.
   ملاحظة: لوحات العنب يتعين تطهيرها من يرقات 22 ساعة بعد انشائها، وإنشاء لوحات بحيث يمكن إزالتها في وقت مبكر اليوم التالي (. على سبيل المثال، وإنشاء لوحة في 12:00 واضحة في 10 من صباح اليوم التالي). فإنه من المستحسن أن يتخلص من أول لوحة العنب لتجنب أي البيض أن الإناث قد تكون حجب وثار قد تكون متقدمة في التنمية.

5. جمع L1 (الطور الأول) يرقات من لوحات العنب

1. إزالة لوحات العنب من زجاجات 22 ساعة بعد أن تم إعداد وقعت في 60 × 15 مم طبق بيتري.
2. وضع لوحة العنب جديدة مع عجينة الخميرة الطازجة على الزجاجة القابضة.
3. واضح وتجاهل جميع اليرقات من لوحة العنب المصنفة باستخدام مسبار تشريح.
4. مسح احتضان لوحات العنب لمدة 4 ساعة في الظروف القياسية.
5. بعد 4 ساعات، واختيار 100 اليرقات L1 في سلالة من لوحات العنب ووضع على لوحات الغذاء.
   1. وضع اليرقات على الغذاء بلطف (بدون تثقيب الطعام ودفن اليرقات) وتجنب الازدحام من خلال توزيع اليرقات عبر لوحة الغذاء.
6. احتضان لوحات الطعام حتى الحيوانات اختبار ما يقرب من 10 ساعة قبل بدء الطواف.
   ملاحظة: في 25 درجة مئوية، 10 ساعة قبل تجول عموما يتوافق مع 72-96 ساعة بعد الفقس. وexacوينبغي أن تحدد كمية طن من فترة حضانة قبل بدء التجربة من خلال جمع مجموعة أولية من يرقات لكل سلالة وتسجيل عدد من الساعات حتى بداية من التيه (وتجول اليرقات الخروج من الطعام على الجانبين وغطاء من المواد الغذائية لوحات).
   ملاحظة: إذا لزم الأمر، ونفس الآباء يمكن استخدامها لجمع اليرقات لمدة 3 - 4 أيام من الاختبار بتكرار الخطوات 4،7-5،5. تغيير الترتيب الذي يتم تعيين سلالات صعودا واختبارها عبر أيام لتجنب تأثير اختبار النظام على مسار طول. اختبار نفسه "السيطرة" سلالة / يجهد كل يوم من أيام الاختبارات للسيطرة على الآثار اليوم.
7. إذا تم اختبار العديد من السلالات، ارباك إعداد وجمع الأوقات من اليرقات لإتاحة الفرصة لاختبار كل سلالة في نقطة زمنية مناسبة في وقت لاحق.

6. اليرقات مسار طول الاختبار

1. حل الخميرة الجافة النشطة في الماء بنسبة 1: 2 نسبة (الوزن الحجم). يجب أن تكون عجينة الخميرة الانتهاء من أرق من السلطة الفلسطينيةncake الخليط، في الطريقة التي عندما رفع ملعقة من معجون، فإنه يقطر ويترك وراءه شرائط على سطح العجينة التي تذوب بسرعة بعيدا.
   ملاحظة: اتساق عجينة الخميرة مهم ويجب أن تكون ثابتة في كافة مراحل التجربة. قد يتعين تعديلها تبعا لنوع ودفعة من الخميرة نسبة الماء: الخميرة بالضبط.
2. اختيار بلطف اليرقات من سلالة الأول لفحصها من لوحة الغذاء باستخدام فرشاة الطلاء.
3. جمع اليرقات في طبق بتري وغسل بلطف بالماء لإزالة جميع المواد الغذائية.
   1. يغسل بسرعة اليرقات مع 1-2 مل من الماء والداب بلطف اليرقات الجافة مع مختبر مسح لتجنب نقل أي مياه عند وضع اليرقات على لوحة الاختبار. لتجنب الإجهاد، والحفاظ على يرقات الرطبة ولكن ليس مغمور في الماء.
4. ترتيب ثلاث لوحات اختبار جنبا الى جنب وتحديد توقيت 5 دقائق لكل لوحة الاختبار.
5. تطبيق عجينة الخميرة في الجزء العلوي من لوحات اختبار واستخدام رش، نشر تكمن رقيقةإيه من معجون الخميرة على كل لوحة الاختبار حتى يتسنى لجميع الآبار لها حتى طبقة من الخميرة.
6. وضع بلطف يرقة واحدة في وسط كل بئر، بدءا الموقت 5 دقائق بعد وضع اليرقات الأولى على كل لوحة. ملاحظة: يمكن القيام به ثلاث لوحات في وقت واحد، مما أسفر عن حجم عينة من يوم 30 / سلالة / اختبار، وتصل إلى ما مجموعه 500 اليرقات.
7. وضع طبق بتري غطاء على رأس كل بئر.
8. عندما توقيت تنفد، دون إزالة اليرقات من لوحة، وبدء تتبع أطوال مسار تركت وراءها في الخميرة باستخدام علامة دائمة. وضعت تتبع مسار أطوال في نفس الترتيب كما اليرقات على لوحات الاختبار.
   1. أداء تتبع بنفس السرعة كما وضعت اليرقات على لوحات. من أجل التناسق في مجال تحليل البيانات في وقت لاحق، استخدم نفس علامة لجميع أطوال المسار. ينصح علامة دائمة.
9. كرر الخطوات من 6.2 إلى 6.8.1 لكل سلالة لفحصها. اختيار كل سلالة من الطعام مباشرة قبل الاختبار لتجنب آثار المجاعة على السلطة الفلسطينيةطول عشر.

7. الغذاء الحرمان

1. إذا اليرقات أن يكون الغذاء يحرم قبل الاختبار، وجمع يرقات كما هو موضح في الخطوات 6،2-6،3، ولكن المبلغ المطلوب من الوقت الحرمان من الطعام في وقت سابق (على سبيل المثال، إذا اليرقات إلى أن الغذاء حرمان لمدة 4 ساعة، وجمع اليرقات 4 ساعات قبل وقت الاختبار).
2. تقسيم اليرقات غسلها إلى مجموعتين ووضع مجموعة المواد الغذائية حرمانا في طبق بتري 60 × 15 ملم مع 5 مل 1٪ أجار والمجموعة الضابطة في طبق بيتري مع 5 مل الغذاء القياسية.
3. وضع الوزن على الجزء العلوي من غطاء المقلوب من أطباق بتري (وإلا اليرقات قادرة على الزحف للخروج عند البحث عن الطعام).
4. احتضان للفترة الحرمان من الطعام المحددة سابقا والمضي قدما في الاختبار كما هو موضح في الخطوات 6،2-6،9.
5. إذا العديد من السلالات هي لفحصها، ارباك الحرمان من الطعام يبدأ مرات للسماح للاختبار من كل سلالة في نقطة زمنية مناسبة.

تحليل 8. البيانات

ملاحظة: يصف هذا القسم طريقة لتحليل البيانات باستخدام يماغيج ⁷ أو ⁸ فيجي لتجهيز مسار أطوال، على الرغم من أن برامج أخرى يمكن استخدامها.

1. استخدام منضدة خفيفة لنقل جميع تتبعت مسار أطوال من الأغطية طبق بتري إلى ورقة بيضاء (يمكن غسلها الأغطية مع الإيثانول واستخدامها لمزيد من تسجيل مسار الطول).
2. تتبع خط إشارة على التوالي 50 ملم على واحد من ورقة من الورق.
3. مسح أطوال مسار بدرجة وضوح 300 نقطة في البوصة، وباستثناء ما نقطية أو شجار ملفات الصور.
4. فتح ملف صورة، حدد "عملية" علامة التبويب> "ثنائي"> "جعل ثنائي". ثم تحت علامة التبويب "عملية"، حدد "ثنائي"> "أصبح هيكل". وهذا ينتج خط عرض بكسل واحدة، بغض النظر عن سمك أثر.
5. تأكد من ظهور كل طول الطريق كخط واحد مستمر مع عدم وجود سيارات الكروس أوفر.
6. فصل أي التقاطعات باستخدام "لي مستقيمأداة شمال شرق "وتلوين البيض خط (استمرارية مسار يمكن التحقق مع" "(تتبع أداة العصا)، ينبغي تسليط الضوء على المسار بالكامل الأصفر (الشكل 2).
7. حدد "تحليل" علامة التبويب> تعيين القياسات وحدد "محيط" و "تسمية العرض".
8. حدد "تحليل" علامة التبويب> "على نطاق تعيين" وحدد "إزالة النطاق".
9. في الصورة، حدد خط إشارة فقط، حدد "تحليل" علامة التبويب> "الجسيمات تحليل" وحدد "عرض: الخطوط العريضة"، "عرض النتائج" و "جدول النتائج واضحة". ملاحظة: سيتم إخراج عرض عدد من بكسل المقابلة لخط مقياس 50 ملم.
10. حدد "تحليل" علامة التبويب> "على نطاق تعيين" وشغل في عدد البكسل في "المسافة بالبكسل" وبعد المقابلة (50 ملم) في "المسافة المعروفة".
11. وأخيرا، حدد كافة الرسومات مسار طول راثى واحدتا الوقت، حدد "تحليل" علامة التبويب> "الجسيمات تحليل" وحدد "عرض: الخطوط العريضة"، "عرض النتائج" و "جدول النتائج واضحة".
    1. إزالة أي علامات مكتوبة أو علامات غريبة واضحة (سوف يتم التعرف على مسار أطوال) ضمن المنطقة المحددة عن طريق تحديد المنطقة وملئه الأبيض.
12. بصريا تفقد "الخطوط العريضة" ملف الإخراج لضمان محيط التأكد بشكل صحيح. سوف إخراج تظهر طول المسار في ملم لكل رسم مسار طول في التحديد. هذا يمكن بسهولة تصديرها إلى جدول بيانات وتحليلها مع أي برنامج الإحصائي.

النتائج

ويوضح الاختلافات في مسار طول روفر وحاضنة للسلالات وتأثير الحرمان من الطعام على مسار طول في الشكل. 3 جمع البيانات على مدى ثلاثة أيام متتالية من التجارب أظهرت تأثير كبير سلالة (F ₍₁₄₂₁₎ = 351.89، ف <2.20 × 10 ^-16؛ الشكل 3A)، مع...

Discussion

فحص مسار بطول المذكورة هنا يوفر مقياسا قوية وبسيطة من السلوك تستخدم علفا لليرقات ذبابة الفاكهة. بروتوكول يتبع المنهجية العامة وصفها في Sokolowski ^2، ولكن منذ ذلك الحين تحسنت في ما يخص الكفاءة والضوابط التجريبية. إلى علمنا هذه الطريقة هي الطريقة الوحيدة المتاحة...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 oz fly culture bottles	Fisher Scientific	AS355
Fly vial plugs	Droso-Plugs	59-201
35 x 10 mm Petri dishes	Falcon	351008
100 x 15 mm Petri dishes	Fisher	875712
60 x 15 mm Petri dishes	VWR	25384-168
Dissecting probes	Almedic	2325-58-5300
Yeast	Lab Scientific	FLY-8040-20F