Forrajeo Protocolo Ruta de longitud de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Las larvas

Resumen

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

Resumen

El melanogaster larvas fenotipo longitud del recorrido de Drosophila es una medida establecida usada para estudiar las contribuciones genéticas y ambientales a la variación del comportamiento. El ensayo de la longitud del recorrido de las larvas fue desarrollado para medir las diferencias individuales en el comportamiento de alimentación que más tarde fueron ligado al gen de forrajeo. Larval la longitud del recorrido es un rasgo marcado un gol que facilita la recogida de muestras de gran tamaño, a un costo mínimo, para las pantallas genéticos. A continuación se realiza una descripción detallada del protocolo actual para el ensayo de la longitud del recorrido de larvas utilizado por primera vez por Sokolowski. El protocolo se detalla cómo manejar de forma reproducible animales de prueba, realice el ensayo de conducta y analizar los datos. Un ejemplo de cómo el ensayo puede ser usado para medir la plasticidad de comportamiento en respuesta al cambio del medio ambiente, mediante la manipulación de la alimentación de medio ambiente antes de realizar el ensayo, también se proporciona. Por último, el diseño de prueba adecuado, así como los factores ambientales que pueden modificarSe discuten las larvas de longitudes de trayecto como la calidad de los alimentos, la edad de desarrollo y efectos de los días.

Introducción

Desde el descubrimiento del gen blanco en el laboratorio de Thomas Hunt Morgan en 1910, la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster (D. melanogaster), se ha utilizado como modelo para el estudio de las bases moleculares y fisiológicas de diversos procesos biológicos. La popularidad de D. melanogaster se deriva en gran medida de la cantidad considerable y la variedad de herramientas genéticas. El tamaño pequeño de Drosophila, relativa facilidad de manipulación y generación de corto tiempo de procesamiento es un modelo ideal para estudios de genética. Igualmente importante es la capacidad de Drosophila para demostrar muchos de los fenotipos expresados ​​por organismos más complejos, incluyendo los mamíferos. Esto incluye fenotipos complejos tales como el comportamiento que se interponen en la interfaz entre el organismo y su medio ambiente. Como tales, los estudios sobre el comportamiento de la mosca de la fruta han contribuido en gran medida a nuestra comprensión de cómo los genes y el medio ambiente median en el comportamiento1.

Uno de los primeros estudios de D. melanogaster comportamiento de las larvas se investigaron las diferencias individuales en las estrategias de búsqueda de alimento de las larvas mediante la medición de las longitudes de caminos de las larvas de ² mientras se alimenta. La longitud del recorrido se define como la distancia total recorrida por una sola larva en la levadura, dentro de un período de cinco minutos. Ambas cepas de laboratorio y las moscas de una población natural en Toronto variaron en sus comportamientos de forrajeo y había un componente genético a las diferencias individuales en la longitud del recorrido. Dos morfos de forrajeo de larvas se describen a partir de las distribuciones de longitudes de trayecto cuantitativos y fueron llamados Rover y niñera. Rovers exhiben más largas longitudes de caminos al atravesar un área más grande, mientras que en un sustrato alimenticio de modelos. Utilizando este ensayo la longitud del recorrido, de Belle et al. ³ mapeado el gen búsqueda de alimento (para) que subyace a estas diferencias de comportamiento individuales en una ubicación discreta en chromosome- 2 (24A3-24C5). El D. metroelanogaster para el gen fue posteriormente clonado ⁴ y revela como una proteína quinasa dependiente de cGMP ^5, un modulador de la fisiología y el comportamiento en Drosophila y otros organismos ^6.

Aquí describimos el actual protocolo para el ensayo de la longitud del recorrido de larvas desarrollado originalmente en Sokolowski ^2. Aunque algunos aspectos del ensayo han cambiado con los años, el concepto detrás del diseño no tiene. También proporcionamos los datos que ilustran el potencial del ensayo para evaluar las contribuciones genéticas y ambientales a las diferencias individuales en el comportamiento de alimentación de las larvas de Drosophila. El ensayo de la longitud del recorrido de las larvas es simple, eficiente, y sin embargo robusto. Una sola persona puede probar hasta 500 larvas con facilidad en cuatro horas y los resultados se pueden obtener con un alto grado de reproducibilidad. Originalmente desarrollado para localizar para, que puede ser utilizado en las pantallas de genética, mapeo de locus de rasgos cuantitativos, y en estudiosdel gen por medio ambiente (G *) interacciones. Por otra parte, su simplicidad y reproducibilidad lo convierten en un gran recurso para la enseñanza de pregrado.

Protocolo

1. Preparar placas de uva y botellas de celebración para la recolección de larvas

1. Para hacer botellas de celebración, cortar agujeros en un lado de las botellas de cultivo de 6 oz mosca, lo suficientemente grande para encajar un tapón vial mosca de suministro de aire (Fig. 1D).
2. Para hacer las placas de uva, preparar 250 ml de medio de zumo de uva (1,8% de agar, el jugo de uva 45%, ácido acético 2,5%, 2,5% de etanol) hirviendo el agar, zumo de uva y la mayor parte del agua, enfríe a 70 ºC ( revuelva mientras se enfría), a continuación, añadir el ácido acético y etanol y llevar al volumen con agua.
3. Usar una jeringa (sin aguja) para llenar 35 x 10 mm de Petri tapas de los recipientes hasta que la superficie del medio de zumo de uva hace una cúpula por encima del labio de la tapa (Fig. 1A).
4. placas tienda de uva en un recipiente húmedo y hermético a 4 ° C hasta su uso (hasta un máximo de 2 semanas).

2. Preparación de platos de comida

1. Prepare la receta de comida mosca estándar.
   Nota: Para sacarest alimentos crianza de efectos de calidad en la longitud del recorrido que utilizan alimentos bajos mosca de nutrientes: 10% de sacarosa, 1,3% de agar, 0,8% de tartrato de sodio y potasio, 0,1% de fosfato monopotásico, cloruro de sodio al 0,05%, cloruro de calcio 0,05%, 0,05% de cloruro de magnesio, 0,05% de sulfato férrico, 5% de levadura y el ácido propiónico 0,5% en agua; y alta comida mosca de nutrientes: 1,5% de sacarosa, 1,4% de agar, 3% de glucosa, 1,5% de harina de maíz, 1% de germen de trigo, harina de soja 1%, 3% de melaza, 3.5% de levadura, ácido propiónico 0,5%, 0,2% Tegosept y 1 % de etanol en agua. Tanto para los alimentos en autoclave la solución y se enfría a 50 ^° C antes de añadir el ácido propiónico, Tegosept y etanol.
2. Verter 40 ml de alimentos mosca en 100 x 15 mm placas de Petri.
3. platos de comida tienda en un recipiente hermético y húmeda a 4 ° C hasta su uso (hasta un máximo de 2 semanas).

3. Preparar placas de prueba

1. Preparar 58 x 25 cm, 6 mm de espesor placas de plexiglás de color negro con 10, 1 mm de pozos profundos y circulares, 10 cm de diámetro y dispuestos en un 2 x 5 design (Fig. 1C) para poner a prueba las larvas sucesivamente.
   Nota: hasta 30 larvas se pueden ensayar a la vez si 3 o más de las placas de plexiglás anteriores están disponibles. Alternativamente, las larvas se puede probar en placas de Petri, 10 cm de diámetro. Esta opción es mucho más laboriosa y permite un menor número de larvas a ensayar.
2. Obtener un negro de 39 x 8 cm, de 6 mm de espesor de plexiglás esparcidor para la difusión de la pasta de levadura en las placas de ensayo de plexiglás.
3. Preparar 100 x 15 mm tapas de los recipientes Petri para el registro de las larvas de caminos longitudes mediante la separación de las tapas de fondos por adelantado.

4. Configuración de las poblaciones parentales

1. Mantener condiciones de cría constante durante todo el ensayo (por ejemplo, 25 ºC, 60% de humedad y un 12:12 luz: oscuridad ciclo en alimentos mosca estándar).
2. Elevar población parental, en las mismas condiciones de cría.
3. Recoger 100 - 150 hembras y 50 - 75 machos y les envejecer durante 5 ± 1 días para la fecundidad óptima.
4. permitiendo que females y machos para aparearse durante la noche en una botella de cultivo mosca 6 oz con comida estándar mosca.
5. Transferencia vuela en una botella de retención y asegure una placa de uva (una pequeña cantidad de pasta de levadura fresca en la placa de uva promoverá la puesta de huevos; Fig. 1B) sobre la parte superior con cinta adhesiva (Fig. 1E).
6. Dejan las botellas se colocan boca abajo (Fig. 1F), con la placa de uva en la parte inferior para permitir que los adultos ponen los huevos en la placa de uva.
7. Desechar la primera placa de uva después de 24 horas y colocar una nueva placa de uva en la botella de retención. Esta será la placa de uva de la que las larvas se recogen al día siguiente.
   Nota: Las placas de uva tendrán que ser limpiado de larvas de 22 horas después de haber sido creado, establecido placas de modo que se pueden borrar día siguiente temprano (. Por ejemplo, configurar la placa a las 12 pm y clara a las 10 horas del día siguiente). Es recomendable descartar la primera placa de uva para evitar cualquier tipo de huevos que las hembras podrían haber estado reteniendo y that podría ser avanzado en el desarrollo.

5. Recoger L1 (primer estadio) Las larvas de las placas de uva

1. Retire las placas de uva de las botellas de 22 horas después de haber sido creados y colocar en una placa de Petri de 60 x 15 mm.
2. Colocar una nueva placa de uva con pasta de levadura fresca en la celebración de una botella.
3. Claro y desechar todas las larvas de la placa de uva sin semilla utilizando una sonda de disección.
4. Incubar las placas se aclaró la uva durante 4 horas en condiciones estándar.
5. Después de 4 horas, recoger 100 L1 larvas por cepa de las placas de uva y colocar en platos de comida.
   1. Coloque las larvas en la comida suavemente (sin perforar la comida y enterrar las larvas) y evitar el hacinamiento mediante la distribución de las larvas a través de la placa de alimentación.
6. Incubar las placas de alimentos hasta que los animales de ensayo son de aproximadamente 10 hr antes del inicio de errante.
   Nota: A los 25 ºC, 10 horas antes de pasear por lo general corresponde a 72 - 96 horas después de la eclosión. el EXACt cantidad de tiempo de incubación debe ser determinado antes de comenzar el experimento mediante la recopilación de un conjunto inicial de larvas para cada cepa y registrando el número de horas hasta el comienzo de errante (larvas errante se moverá fuera de la comida sobre los lados y la tapa de la comida platos).
   Nota: Si es necesario, los mismos padres pueden utilizar para recoger larvas durante 3 - 4 días de prueba repitiendo los pasos 4.7 a 5.5. Cambiar el orden en el que las cepas están configurados y probados a través de días para evitar un efecto de orden de la prueba en la longitud del recorrido. Prueba de la misma cepa de "control" / cepas de cada día de pruebas para controlar los efectos del día.
7. Si se prueban muchas cepas, escalonar la puesta en marcha y recolección de tiempos de las larvas para permitir el análisis de cada cepa en el punto de tiempo apropiado más adelante.

6. larval prueba de ruta de larga duración

1. Disolver en seco activo levadura de panadero en agua a una proporción de 1: 2 (peso a volumen). La pasta de levadura terminado debe ser más delgado que pancake bateador, de una manera que al levantar una cuchara de la pasta, que gotea y deja tras de las cintas en la superficie de la pasta que se funden rápidamente.
   Nota: La consistencia de la pasta de levadura es importante y debe ser constante durante todo el experimento. La hora exacta de la levadura: proporción de agua podría tener que ajustarse dependiendo de la marca y lote de levadura.
2. recoger suavemente larvas de la primera cepa a ensayar de la placa de alimentos utilizando un pincel.
3. Recoger las larvas en una placa de Petri y lavar suavemente con agua para eliminar todos los alimentos.
   1. lavar rápidamente con larvas de 1 - 2 ml de agua y larvas de lenguado seca suavemente con una toallita de laboratorio para evitar la transferencia de agua al colocar las larvas en la placa de prueba. Para evitar el estrés, mantener las larvas húmedo pero no sumergida en agua.
4. Organizar tres placas de prueba lado a lado y establecer un temporizador de 5 minutos para cada placa de prueba.
5. Aplicar la pasta de levadura a la parte superior de las placas de prueba y con el separador, se extendió un laico delgadaer de la pasta de levadura en cada placa de prueba de modo que todos los pozos tienen una capa uniforme de la levadura.
6. colocar suavemente una larva en el centro de cada pocillo, a partir del temporizador de 5 minutos después de la colocación de la primera larvas en cada placa. Nota: Tres placas se pueden hacer a la vez, produciendo un tamaño de la muestra del día 30 / cepa / prueba, hasta un total de 500 larvas.
7. Colocar una tapa de la placa Petri en la parte superior de cada pocillo.
8. Cuando se acabe el tiempo, sin necesidad de retirar las larvas de la placa, comenzar trazando el camino del largo dejados atrás en la levadura utilizando un marcador permanente. Traza de trayecto de longitudes en el mismo orden que las larvas se colocaron en las placas de ensayo.
   1. Realizar el seguimiento en la misma velocidad que las larvas se colocaron en las placas. Para mantener la coherencia en el análisis de datos más adelante, utilice el mismo marcador para todas las longitudes de caminos. Se recomienda marcador permanente.
9. Repita los pasos 6.2 a 6.8.1 para cada cepa a ensayar. Recoger cada cepa de los alimentos inmediatamente antes del ensayo para evitar los efectos del hambre en paº de longitud.

7. Carencia de Alimentos

1. Si las larvas son para ser comida privada antes de la prueba, recolectar larvas como se describe en los pasos 6.2 a 6.3, pero la cantidad de tiempo deseada privación de alimentos antes (por ejemplo., Si las larvas son para ser comida privó durante 4 horas, recoger larvas de 4 horas antes tiempo de prueba).
2. Divida larvas se lavó en dos grupos y colocar el grupo de alimentos privada en una placa de Petri de 60 x 15 mm con agar 5 ml 1% y el grupo de control en una placa de Petri con 5 ml de alimentos estándar.
3. Coloque un peso en la parte superior de la tapa invertida de los platos de Petri (de lo contrario larvas son capaces de arrastrarse en la búsqueda de alimentos).
4. Incubar durante el período de privación de alimentos previamente establecido y proceder con la prueba como se describe en los pasos 6.2 a 6.9.
5. Si son muchas cepas a ensayar, escalonar la privación de alimentos tiempos de inicio para permitir la comprobación de cada cepa en el punto de tiempo apropiado.

Análisis de datos 8.

Nota: Esta sección describe un método para el análisis de datos usando ImageJ ⁷ o Fiji ⁸ para el procesamiento de la trayectoria de longitudes, aunque otro software puede ser utilizado.

1. Utilice una mesa de luz para transferir todas las longitudes de caminos trazados de las tapas de los recipientes Petri de papel blanco (tapas se pueden lavar con etanol y se reutilizan para otra grabación de longitudes de trayecto).
2. Trazar una línea recta de referencia de 50 mm en una de las hojas de papel.
3. Analiza las longitudes de caminos con una resolución de 300 dpi y guardar como mapa de bits o archivos de imagen TIFF.
4. Abra el archivo de imagen, seleccione la pestaña "Procesos"> "binario"> "Hacer binario". A continuación, en la pestaña "Procesos", seleccione "binario"> "esqueletizar". Esto produce un ancho de línea de un píxel, independientemente del grosor del trazo.
5. Asegúrese de que cada longitud de trayectoria aparece como una sola línea continua sin cruces.
6. Separar las intersecciones utilizando el "li rectaherramienta ne "y colorear la línea blanca (la continuidad de la trayectoria se puede comprobar con la" herramienta Varita "(rastreo), todo el camino debe ser resaltado en amarillo (Fig. 2).
7. Seleccione la opción "Analizar" ficha> Set mediciones y seleccione "Perímetro" y "Mostrar etiqueta".
8. Seleccione la pestaña "Analyse"> "Ajuste de escala" y seleccione "Quitar escala".
9. En la imagen, seleccione la línea de referencia solamente, seleccione la pestaña "Analyse"> "partículas" Analizar y seleccione "Mostrar: Esquemas", "Mostrar resultados" y "tabla de resultados claros". Nota: La salida se mostrará el número de píxeles correspondientes a la línea escala de 50 mm.
10. Seleccione "Analyse" pestaña> "ajustado en la escala" y rellenar el número de píxeles en "Distancia en píxeles" y la distancia correspondiente (50 mm) en la "distancia conocida".
11. Por último, seleccionar todos los dibujos ruta de longitud de un genotipo de unatiempo de ta, seleccionar la pestaña "Analyse"> "partículas Analizar" y seleccione "Mostrar: contornos", "Mostrar resultados" y "tabla de resultados claros".
    1. Quite las etiquetas escritas o marcas extrañas obvias (que serán reconocidos como ruta-longitudes) dentro del área seleccionada mediante la selección de la zona y llenándolo blanco.
12. Inspeccione visualmente el archivo de salida "contornos" para asegurar los perímetros se determinaron correctamente. La salida se mostrará un camino de longitud en mm por cada dibujo longitud de trayectoria en la selección. Esto puede ser fácilmente exportado a una hoja de cálculo y se analizaron con el software estadístico.

Resultados

Las diferencias en la longitud del recorrido del vehículo y niñera para las cepas y el efecto de la privación de alimentos en la longitud del recorrido se ilustran en la Fig. . 3 Los datos recogidos durante tres días consecutivos de las pruebas mostraron un efecto significativo de tracción (F _(1,421) = 351,89, p <2.20 x 10 ^-16; Fig. 3A), con exploradores que viajan más lejos que los canguros....

Discusión

El ensayo de la longitud del recorrido descrito aquí ofrece una medida robusta y sencilla de comportamiento de alimentación de las larvas de Drosophila. El protocolo sigue la metodología general descrita en Sokolowski ^2, pero desde entonces se ha mejorado en lo que respecta a la eficiencia y controles experimentales. A lo mejor de nuestro conocimiento, este método es el único método disponible para la medición de la longitud del recorrido de las larvas. La versión original del protocolo ^...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 oz fly culture bottles	Fisher Scientific	AS355
Fly vial plugs	Droso-Plugs	59-201
35 x 10 mm Petri dishes	Falcon	351008
100 x 15 mm Petri dishes	Fisher	875712
60 x 15 mm Petri dishes	VWR	25384-168
Dissecting probes	Almedic	2325-58-5300
Yeast	Lab Scientific	FLY-8040-20F