대한 꼴 경로 길이 프로토콜<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 애벌레

요약

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

초록

초파리 melanogaster의 애벌레 경로 길이의 표현형은 행동 변화에 유전과 환경 기여를 연구하는 데 사용 설립 척도이다. 애벌레 경로 길이 분석 나중에 꼴 유전자에 링크 된 구하고 동작의 개체 차이를 측정하기 위해 개발되었다. 애벌레 경로 길이의 유전자 스크린에 대해, 최소한의 비용으로 큰 샘플 크기의 수집을 용이하게하는 특징을 쉽게 획득된다. 여기에서는 제 Sokolowski 의해 사용 애벌레 경로 길이의 분석에 대한 현재 프로토콜의 상세한 설명을 제공한다. 프로토콜은 재현성, 시험 동물을 처리 행동 분석을 수행하고 데이터를 분석하는 방법을 자세히. 분석 환경 공급 조작 이전에 분석을 수행함으로써, 환경 변화에 응답 행동 가소성을 측정하기 위해 어떻게 사용될 수 있는지의 일례도 제공한다. 마지막으로, 적절한 시험 디자인뿐만 아니라 환경 적 요인 수정할 수식품의 품질, 발달 연령과 일의 영향과 애벌레 경로 길이는 설명합니다.

서문

1910 년 토머스 헌트 모건의 실험실에서 흰색 유전자의 발견 이후, 초파리, 초파리 melanogaster의 (D. melanogaster의)는 다양한 생물학적 과정의 분자 및 생리 학적 토대의 연구를위한 모델로 사용되어왔다. D.의 인기 melanogaster의 대부분 유전 도구의 상당한 수량과 다양성에서 유래한다. 초파리의 작은 크기, 취급 및 짧은 생성 시간을 상대적으로 쉽게 그것을 유전학 연구에 이상적인 모델을 렌더링합니다. 마찬가지로 중요한 포유류를 포함하여 더 복잡한 유기체로 표시되는 표현형의 많은 것을 보여주기 위해 초파리의 용량입니다. 이 유기체와 환경 사이의 인터페이스에 서 그런 행동 같은 복잡한 표현형을 포함한다. 초파리에 같은 행동 연구는 유전자와 환경이 행동 중재 방법에 대한 우리의 이해에 실질적으로 기여으로1.

D.의 제 연구 한 melanogaster의 애벌레 행동 먹이 동안 애벌레 ^2의 경로 길이를 측정하여 애벌레 꼴 전략의 개체 차이를 조사 하였다. 경로 길이는 5 분 이내에, 효모 단일 유충으로 이동 한 총 거리로 정의 하였다. 토론토의 자연 인구에서 두 실험실 균주와 파리는 꼴 행동에 변화 및 ​​경로 길이의 개체 차이에 유전 적 요소가 있었다. 두 애벌레 꼴 모프는 양적 경로 길이의 분포에서 설명하고 그들은 로버와 보모라고했다. 큰 면적을 순회하면서 로버스주는 동안보다 음식 기판 상 긴 경로 길이를 나타낸다. 이 경로 길이의 분석을 이용하여, 드 벨 등. ³ chromosome- 2 (24A3-24C5)의 개별 위치에 이러한 개별 행동 차이 근본적인 꼴 (용) 유전자 매핑. D. 엠유전자 elanogaster 나중에 ⁴ 복제 및 cGMP에 의존 단백질 키나제 ^(5), 생리학과 행동 초파리와 다른 생물 ^(6)의 변조기로 밝혀졌다.

여기에서 우리는 원래 Sokolowski ^2에서 개발 애벌레 경로 길이 분석에 대한 현재의 프로토콜을 설명합니다. 분석의 일부 측면은 수년에 걸쳐 변화하고 있지만, 디자인 뒤에 개념은 없습니다. 우리는 또한 초파리 유충의 먹이를 행동의 개체 차이에 유전과 환경 기여를 평가하는 분석의 가능성을 설명하는 데이터를 제공합니다. 애벌레 경로 길이의 분석은 단순하고 효율적이며 또 강하다. 한 사람은 4 시간 내에 용이 500 유충까지 테스트하고 결과는 재현성이 높은 수준으로 얻을 수있다. 원래는 연구에서 유전자 스크린 양적 형질 위치 맵핑에 이용 될 수 있고, 개발에 대한 지역화유전자 별 환경 (GXE)의 상호 작용. 또한, 단순하고 재현성은 학부 교육을위한 훌륭한 자원합니다.

프로토콜

1. 애벌레의 컬렉션을 위해 포도 접시와 지주 병을 준비합니다

1. 들고 병을하려면 공기 공급을위한 비행 유리 병 플러그를 맞게 충분히 큰 6온스 플라이 문화 병 (그림. 1D)의 한쪽에 구멍을 잘라.
2. (한천, 포도 주스를 끓여 포도 주스 매체 (1.8 % 한천, 45 % 포도 주스, 2.5 % 아세트산, 2.5 % 에탄올) 250 ml의를 준비하고 대부분의 물이, 70 ºC까지 냉각, 포도 판을 만들려면 ) 냉각시키면서 후 아세트산 및 에탄올을 추가하고, 물로 부피 불러 교반 하였다.
3. 포도 주스 매체의 표면 뚜껑 (그림. 1A)의 입술 위의 돔을하게 될 때까지 35 X 10mm 페트리 접시의 뚜껑을 채우기 위해 (바늘없이) 주사기를 사용합니다.
4. 4 ºC에서 습기와 밀폐 용기에 보관 포도 접시 사용할 때까지 (2 주 최대까지).

음식 플레이트 2. 준비

1. 표준 플라이 음식의 조리법을 준비합니다.
   참고 : T하려면10 % 수 크로스, 1.3 % 한천, 0.8 % 칼륨 나트륨 타르트 레이트, 0.1 % 인산 일 칼륨, 0.05 % 염화나트륨, 0.05 % 염화칼슘, 0.05 % 염화 마그네슘 : 경로 길이 EST 양육 식품 품질 효과는 우리가 저 영양 즉석 식품 사용 0.05 % 물에 황산 제이철, 5 % 효모 0.5 % 프로피온산; 높은 영양소 플라이 음식 : 1.5 % 수 크로스, 1.4 % 한천, 3 % 글루코스, 1.5 % 옥수수 가루 1 % 소맥 배아, 1 % 대두 분, 3 % 당밀, 3.5 % 효모, 0.5 % 프로피온산, 0.2 % Tegosept 1 물 % 에탄올. 모두 음식에 대한 프로피온산, Tegosept 에탄올을 추가하기 전에 ⁵⁰ ℃의 해결책과 멋진 오토 클레이브.
2. 100 × 15mm 배양 접시에 플라이 음식의 40 ml에 따르십시오.
3. 4 ºC에서 습기와 밀폐 용기에 보관 음식 접시 사용할 때까지 (2 주 최대까지).

3. 테스트 플레이트를 준비

1. 직경 58 X 25cm, 10, 1mm 깊은 원형 우물 6 mm 두께의 블랙 플렉시 글라스 판, 10cm를 준비하고 2 × 5 D에 배치유충에 테스트하는 디자인을 재미있게 다룬 (그림. 1C).
   주 : 3 또는 상기 플렉시 유리 플레이트 이상 사용할 경우 30 유충까지 한번에 시험 할 수있다. 또한, 유충은 페트리 접시, 직경 10cm에서 테스트 할 수 있습니다. 이 옵션은 훨씬 더 힘든하고 테스트 할 유충의 낮은 번호 수 있습니다.
2. 플렉시 유리 테스트 판에 효모 페이스트를 확산하기위한 블랙 (39) × 8 cm의 6mm 두께의 유리 야 스프레더를 얻습니다.
3. 미리 바닥에서 뚜껑을 분리하여 애벌레 경로 길이를 기록 100 × 15mm 페트리 접시의 뚜껑을 준비합니다.

4. 부모의 인구를 설정

1. 전체 분석을 통해 지속적인 양육 상태를 유지합니다 (예를 들어, 25 ºC, 60 % 습도와 12시 12분 등 : 표준 비행 음식에 어두운 사이클).
2. 동일한 사육 조건에서 부모의 인구를 올립니다.
3. (150) 여성 50 - - 100 모아 75 명의 남성을 최적의 번식력 5 ± 1 일을 나이.
4. F 허용emales과 남성은 표준 플라이 음식 6 온스 플라이 배양 병에 하룻밤 짝짓기를합니다.
5. 마스킹 테이프 (그림 1E.)와 맨 위에, 전송 유지 병에 날아와 포도 플레이트 (그림 1B 누워 계란을 촉진 포도 접시에 신선한 효모 붙여 넣기의 작은 금액을.) 고정합니다.
6. 맨 아래에있는 포도 판에, 거꾸로 (그림. 1 층) 서 병은 성인 포도 접시에 알을 낳기 할 수 있도록 둡니다.
7. 24 시간 후 첫 포도 판을 취소하고 유지 병에 새로운 포도 접시를 놓습니다. 이 애벌레는 다음날 수집되는 포도 판 될 것입니다.
   참고 : 포도 플레이트, 설정들이 초기에 다음날 해제 할 수 있도록 판을 설정 한 후 유충 22 시간의 취소되어야 할 것이다 (. 예를 들면, 정오에 판을 설치하고 10에서 분명 다음 날 오전). 여성이 원천 징수하고 그쪽되었을 수있는 모든 계란을 방지하기 위해 최초의 포도 판을 폐기하는 것이 바람직하다t는 개발 진행 될 수 있습니다.

5. 포도 플레이트에서 L1 (제 탈피) 애벌레를 수집

1. 60 X 15mm 페트리 접시에 그들이 설정 한 22 시간 후 병 및 장소에서 포도 플레이트를 제거합니다.
2. 유지 병에 신선한 효모 붙여 넣기로 새로운 포도 접시를 놓습니다.
3. 명확하고 해부 프로브를 사용하여 시드 포도 판에서 모든 애벌레를 폐기합니다.
4. 품어은 표준 조건에서 4 시간 동안 포도 판을 클리어.
5. 4 시간 후, 포도 판에서 변형 당 100 L1 유충을 선택하고 음식 접시에 배치합니다.
   1. (애벌레를 음식을 천공 및 매장 제외) 부드럽게 음식 유충을 놓고 음식 접시에서 애벌레를 배포하여 군집을 피하십시오.
6. 시험 동물이 방황의 시작하기 전에 약 10 시간까지 음식 접시를 품어.
   참고 : - 부화 후 96 시간 25 ºC에서 일반적으로 방황하는 10 시간 전에 72에 해당합니다. exac배양 시간 t 량이 각 균주 유충의 초기 세트를 수집하고 방랑이 시작될 때까지 시간을 기록하여, 실험을 시작하기 전에 결정되어야한다 (방황 유충 음식의 측면과 덮개에 음식의 밖으로 이동할 판).
   참고 : 필요한 경우, 같은 부모가 3 유충 수집하는 데 사용할 수 있습니다 - 5.5 단계 4.7를 반복하여 테스트 4 일. 균주 경로 길이에 테스트 순서 효과를 방지하기 위해 일에 걸쳐 설정하고 테스트하는 순서를 변경합니다. 같은 "컨트롤"변형을 테스트 / 일의 효과를 제어하는​​ 테스트 매일 균주.
7. 많은 균주를 테스트하는 경우, 이후의 적절한 시점에서 각 균주의 테스트를 허용하는 유충의 설정 및 수집 시간을 엇갈리게.

6. 애벌레 경로 길이 테스트

1. 2 비율 (용적 중량) : 1에서 물에 건조 활성 빵 효모를 녹여. 완성 된 효모 페이스트 파보다 얇은해야ncake 타자는 페이스트의 밖으로 숟가락을 해제하는 방식으로, 그것은 똑똑 떨어지는 빠르게 녹아 페이스트의 표면에 리본 뒤에 떠난다.
   참고 : 효모 페이스트의 일관성이 중요하며 실험을 통해 일정해야한다. 정확한 효모 : 물 비율은 브랜드와 효모의 배치에 따라 조정해야 할 수도 있습니다.
2. 조심스럽게 첫 번째 변형의 유충이 페인트 브러시를 사용하여 음식 접시에서 테스트 할 선택합니다.
3. 페트리 접시에 애벌레를 수집하고 부드럽게 모든 음식을 제거하기 위해 물로 씻는다.
   1. 실험실 2 ml의 물 부드럽게 소량 애벌레 건조 시험 접시에 애벌레를 배치 할 때 어떤 물을 전송하지 않도록 닦아 - 빨리 1 애벌레 씻는다. 스트레스를 방지 습기하지만 물에 침수되지 유충을 유지합니다.
4. 옆에 세 개의 테스트 판 측을 배열하고 각 테스트 판을위한 5 분 타이머를 설정합니다.
5. 테스트 판의 상단에 효모 페이스트를 적용하고 스프레더를 사용하여, 얇은 평신도를 확산모든 우물이 효모의 짝수 층이 그렇게하는 각 시험 접시에 효모 페이스트 어.
6. 조심스럽게 각각의 접시에 최초의 유충을 배치 한 후 5 분 타이머를 시작, 각 웰의 중심에 하나의 유충을 배치합니다. 주 : 3 개의 판 (500) 애벌레의 총 최대 30 / 균주 / 시험 당일의 샘플 크기를 산출 한 번에 수행 될 수있다.
7. 물론 각각의 상단에 페트리 접시의 뚜껑을 놓습니다.
8. 타이머가 다 떨어지기 때, 판에서 유충을 제거하지 않고, 영구 마커를 사용하여 효모에 남긴 경로 길이를 추적을 시작합니다. 애벌레와 동일한 순서로 추적 경로 길이는 테스트 플레이트에 넣었다.
   1. 유충이 판에 배치했다와 같은 속도로 추적을 수행합니다. 나중에 데이터 분석에서 일관성을 위해, 모든 경로 길이가 같은 마커를 사용합니다. 영구 마커를 권장합니다.
9. 반복 각 변형 테스트 할 수 있도록 6.8.1 6.2 단계를 반복합니다. 즉시 파에 기아 효과를 방지하기 위해 테스트하기 전에 음식에서 각 변형을 선택제 길이.

7. 식품 박탈

1. 애벌레, 음식이 시험 전에 박탈 할 단계 6.2 6.3에 설명 된대로 애벌레를 수집 할 수 있지만, 음식 부족 시간의 원하는 양의 이전 (예., 유충 경우에하는 음식을 4 시간 동안 박탈 될 경우, 이전에 유충 4 시간을 수집 테스트 시간).
2. 두 그룹으로 세정 유충 나누고 5 ㎖ 표준 음식 페트리 접시에 5 ml의 1 % 아가과 대조군 60 X 15mm 페트리 접시 내의 음식 박탈기를 놓는다.
3. 페트리 접시의 반전 뚜껑 (그렇지 않으면 애벌레가 음식을 검색 할 때 밖으로 크롤링 할 수있다)의 상단에 무게를 둡니다.
4. 이전에 설립 된 식품 박탈 기간 동안 품어 및 단계 6.9-6.2에 설명 된대로 테스트를 진행합니다.
5. 많은 변형 테스트 할 경우, 음식 박탈 적절한 시점에서 각 균주의 테스트를 허용하는 시작 시간을 엇갈리게.

8. 데이터 분석

주의 : 다른 소프트웨어를 사용할 수 있지만,이 부분은, 경로 길이의 처리 ImageJ에 피지 ⁷ 또는 ^8을 사용하여 데이터 분석을위한 방법을 설명한다.

1. (뚜껑 에탄올로 세척하고, 추가 경로 길이의 녹화를 위해 재사용 될 수있다) 백서를 페트리 접시 뚜껑에서 모든 추적 경로 길이를 전송 라이트 테이블을 사용합니다.
2. 종이 시트 중 하나에 50mm 직선 기준선을 추적.
3. 300 dpi의 해상도로 경로 길이를 스캔 및 비트 맵 또는 TIFF 이미지 파일로 저장합니다.
4. "프로세스"탭> "이진"> "바이너리 만들기"를 선택, 이미지 파일을 엽니 다. 그런 다음 "프로세스"탭> "해골로", "이진"를 선택합니다. 에 관계없이 추적의 두께, 하나의 픽셀 너비 라인을 생산하고 있습니다.
5. 각 경로 길이는 더 크로스 오버와 연속 한 줄로 표시해야합니다.
6. 은 "스트레이트 리를 사용하여 교차로를 분리네브라스카 도구 지팡이 "(추적) 도구"와 라인 화이트 (경로의 연속성을 착색이 확인할 수 있습니다 "전체 경로가 노란색 강조한다 (그림. 2).
7. 은 "분석한다"탭> 설정 측정을 선택하고 "경계"와 "표시 라벨"을 선택합니다.
8. 은 "분석한다"탭> "설정 규모"를 선택하고 "스케일 제거"를 선택합니다.
9. 이미지에서> "를 분석한다 입자"는 "분석한다"탭을 선택 만 기준선을 선택하고 "쇼 : 개요", "결과 표시"와 "지우기 결과 테이블을". 주 : 출력은 50mm 스케일 라인에 대응하는 화소 수를 표시한다.
10. "분석한다"탭> "설정 규모"를 선택하고 "거리 (픽셀 단위)"의 화소 수와 "알려진 거리"에 해당하는 거리 (50mm)를 입력합니다.
11. 마지막으로, 하나의 유전자형 A의 전체 경로 길이를 선택 도면타 시간은 "분석한다"탭> "를 분석한다 입자"를 선택하고 "쇼 : 개요", "결과 표시"와 "지우기 결과 테이블을".
    1. 지역을 선택하고 흰색을 작성하여 선택된 영역 내에서 서면 레이블 또는 명백한 외부 표시 (그들은 경로 길이로 인식됩니다)를 제거합니다.
12. 시각적으로 둘레가 정확하게 확인 된 보장하기 위해 "개요"출력 파일을 검사합니다. 출력은 선택의 각 경로 길이 드로잉 mm의 경로 길이를 표시합니다. 이것은 쉽게 스프레드 시트로 익스포트 및 통계 소프트웨어로 분석 될 수있다.

결과

로버와 참석자 균주 및 경로 길이 음식 박탈의 효과의 경로 길이의 차이도에 도시되어있다. . 탐사선은 멀리 시터보다 여행으로, (도 3A. F _(1,421) = 351.89, p <2.20 × 10 ^-16) 3 데이터 테스트의 세 연속 일 동안 수집은 상당한 변형 효과를 나타내었다. 음식 4 시간 시험을하기 전에 박탈 하였다 유충; 스트레인 효?...

토론

여기에 설명 된 경로 길이의 분석은 초파리 애벌레의 먹이를 행동의 강력하고 간단한 측정을 제공합니다. 프로토콜은 Sokolowski ^2에 기재된 일반적 방법을 따르지만 보낸 효율 실험 제어에 관해서 개선되었다. 우리가 아는 한이 방법은 애벌레 경로 길이를 측정하기위한 유일하게 사용할 수있는 방법입니다. 경로 길이 프로토콜 ^{2, 3, 15,} 브러시로 적용 효모 붙여 넣기의 얇은 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 oz fly culture bottles	Fisher Scientific	AS355
Fly vial plugs	Droso-Plugs	59-201
35 x 10 mm Petri dishes	Falcon	351008
100 x 15 mm Petri dishes	Fisher	875712
60 x 15 mm Petri dishes	VWR	25384-168
Dissecting probes	Almedic	2325-58-5300
Yeast	Lab Scientific	FLY-8040-20F