Foraggiamento protocollo percorso di lunghezza per<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Le larve

Riepilogo

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

Abstract

La Drosophila melanogaster larvale percorso di lunghezza fenotipo è una misura stabilita utilizzato per studiare i contributi genetici e ambientali a variazione comportamentale. Il saggio percorso di lunghezza larvale è stato sviluppato per misurare le differenze individuali nel comportamento di foraggiamento che sono stati successivamente legato al gene foraggiamento. Larvale percorso di lunghezza è una caratteristica facilmente segnato che facilita la raccolta di campioni di grandi dimensioni, a costi minimi, per gli schermi genetici. Qui forniamo una descrizione dettagliata del protocollo corrente per il saggio percorso di lunghezza larvale la prima volta da Sokolowski. Dettagli Il protocollo come gestire in modo riproducibile animali da laboratorio, eseguire il test comportamentale e analizzare i dati. Un esempio di come il saggio può essere utilizzato per misurare la plasticità comportamentale in risposta a cambiamenti ambientali, manipolando alimentando ambiente prima di eseguire il test, è prevista anche. Infine, il disegno di prova adeguato, così come i fattori ambientali che possono modificarelarvale percorso di lunghezza come la qualità dei prodotti alimentari, età evolutiva e gli effetti di giorno sono discussi.

Introduzione

Dalla scoperta del gene bianco in laboratorio di Thomas Hunt Morgan nel 1910, la mosca della frutta, Drosophila melanogaster (D. melanogaster), è stato utilizzato come modello per lo studio delle basi molecolari e fisiologiche di vari processi biologici. La popolarità di D. melanogaster deriva in gran parte dalla notevole quantità e la varietà di strumenti genetici. ridotte dimensioni di Drosophila, relativa facilità di movimentazione e di breve tempo la generazione lo rendono un modello ideale per gli studi di genetica. Altrettanto importante è la capacità di Drosophila dimostrare molti dei fenotipi espresse da organismi più complessi inclusi i mammiferi. Questo include fenotipi complessi come comportamento che stanno alla interfaccia tra l'organismo e il suo ambiente. Come tale, studi comportamentali sulla mosca della frutta hanno contribuito in modo sostanziale alla nostra comprensione di come i geni e l'ambiente mediare comportamento1.

Uno dei primi studi di D. comportamento larvale melanogaster ha indagato le differenze individuali nelle strategie di foraggiamento larvali misurando le lunghezze di percorso-di larve ^2, mentre l'alimentazione. Path-lunghezza è stata definita come la distanza totale percorsa da una singola larva su lieviti, entro un periodo di cinque minuti. Entrambi i ceppi di laboratorio e mosche da una popolazione naturale a Toronto variavano nei loro comportamenti di foraggiamento e c'era una componente genetica delle differenze individuali nel percorso di lunghezza. Due morph di foraggiamento larvali sono stati descritti dalle distribuzioni quantitative percorso di lunghezza e sono stati chiamati rover e sitter. Rovers esibiscono path-lunghezze superiori durante l'attraversamento di una zona più ampia, mentre su un substrato alimentare di sitter. Usando questo test percorso di lunghezza, de Belle et al. ³ mappato il foraggiamento gene (per) alla base di queste differenze individuali di comportamento in una posizione discreta su chromosome- 2 (24A3-24C5). Il D. melanogaster per il gene è stato poi clonato ⁴ e ha rivelato di essere un dipendente proteina chinasi cGMP ^5, un modulatore della fisiologia e del comportamento in Drosophila e altri organismi ^6.

Qui descriviamo l'attuale protocollo per il saggio larvale percorso di lunghezza originariamente sviluppato in Sokolowski ^2. Anche se alcuni aspetti del test sono cambiati nel corso degli anni, il concetto alla base della progettazione non ha. Forniamo anche i dati per illustrare le potenzialità del test per valutare i contributi genetici e ambientali alle differenze individuali nel comportamento di foraggiamento delle larve di Drosophila. Il saggio percorso di lunghezza larvale è semplice, efficiente e robusta. Una sola persona può testare fino a 500 larve con facilità in quattro ore ei risultati possono essere ottenuti con un elevato grado di riproducibilità. Originariamente sviluppato per localizzare per, esso può essere utilizzato in schermi genetici, mappatura quantitativa locus tratto, e in studidel gene-by-ambiente (GXE) interazioni. Inoltre, la sua semplicità e la riproducibilità ne fanno una grande risorsa per l'insegnamento universitario.

Protocollo

1. Preparare piatti d'uva e bottiglie della tenuta per la raccolta delle larve

1. Per rendere le bottiglie in possesso, tagliare i fori in un lato del 6 oz bottiglie cultura fly, grande abbastanza da contenere una spina fiala di volo per l'alimentazione dell'aria (Fig. 1D).
2. Per rendere piastre uva, preparare 250 ml di mezzo di succo d'uva (1,8% agar, 45% succo d'uva, acido acetico 2,5%, 2,5% etanolo) facendo bollire l'agar, succo d'uva e la maggior parte dell'acqua, raffreddare a 70 ° C ( mescolare durante il raffreddamento), quindi aggiungere acido acetico ed etanolo e portare a volume con acqua.
3. Utilizzare una siringa (senza ago) per riempire 35 x 10 mm Petri coperchi piatto fino alla superficie del terreno succo d'uva effettua una cupola sopra il labbro del coperchio (Fig. 1A).
4. piastre uva Conservare in un contenitore ermetico e umido a 4 ° C fino al momento dell'uso (fino a un massimo di 2 settimane).

2. Preparazione di piatti alimentari

1. Preparare standard di ricetta cibo mosca.
   Nota: per test effetti di qualità alimentare che allevano sul percorso di lunghezza abbiamo usato il cibo povero di nutrienti fly: 10% di saccarosio, 1,3% agar, 0,8% tartrato di sodio e di potassio, 0,1% fosfato monopotassico, cloruro di sodio allo 0,05%, 0,05% di cloruro di calcio, 0,05% di cloruro di magnesio, 0,05% di solfato ferrico, 5% lievito e acido propionico 0,5% in acqua; ed alta cibo mosca nutrient: 1,5% di saccarosio, 1,4% agar, 3% di glucosio, 1,5% di farina di mais, 1% germe di grano, 1% di farina di soia, 3% di melassa, 3,5% lievito, acido propionico 0,5%, 0,2% Tegosept e 1 % di etanolo in acqua. Per entrambi gli alimenti autoclave la soluzione e raffreddare a 50 ^° C prima di aggiungere l'acido propionico, Tegosept ed etanolo.
2. Versare 40 ml di cibo volare in 100 x 15mm piastre di Petri.
3. piatti di cibo Conservare in un contenitore ermetico e umido a 4 ° C fino al momento dell'uso (fino a un massimo di 2 settimane).

3. Preparare piastre di prova

1. Preparare 58 x 25 cm, spessore di 6 mm lastre in plexiglas nero con 10, 1 mm pozzi circolari profondi, 10 cm di diametro e disposti in 2 x 5 design (Fig. 1C) per testare larve.
   Nota: Fino a 30 larve possono essere testati in un momento, se 3 o più delle piastre di cui sopra in plexiglas sono disponibili. In alternativa, le larve possono essere testati in piastre di Petri, 10 cm di diametro. Questa opzione è molto più laboriosa e consente il decremento delle larve da testare.
2. Ottenere un nero di 39 x 8 cm, 6 millimetri di spessore plexiglas spreader per la diffusione della pasta di lievito sulle piastre di prova in plexiglas.
3. Preparare 100 x 15 mm coperchi Petri dish per la registrazione del percorso lunghezze larvali separando coperchi di fondo in anticipo.

4. Configurare Popolazioni genitori

1. Mantenere condizioni di allevamento costante durante l'intero test (ad esempio, 25 ° C, 60% di umidità e una leggera 12:12: ciclo scuro sul cibo fly standard).
2. Sollevare la popolazione dei genitori nella stesse condizioni di allevamento.
3. Raccogliere 100 - 150 femmine e 50 - 75 maschi e li invecchiare per 5 ± 1 giorni per la fecondità ottimale.
4. consentire females e maschi si accoppiano durante la notte in una bottiglia cultura mosca 6 oz con il cibo volare standard.
5. Trasferimento vola in una bottiglia tenuta e sicuro un piatto d'uva (una piccola quantità di pasta di lievito fresco sul piatto d'uva promuoverà la deposizione delle uova; Fig. 1B) sopra le righe con nastro adesivo (Fig. 1E).
6. Lascia bottiglie in piedi a testa in giù (Fig. 1F), con la piastra di uva in basso per permettere agli adulti di deporre le uova sulla piastra di uva.
7. Scartare il primo piatto di uva dopo 24 ore e inserire una nuova piastra di uva in bottiglia azienda. Questa sarà la piastra di uva da cui larve sono raccolti il ​​giorno successivo.
   Nota: le piastre d'uva dovranno essere sgombra da larve di 22 ore dopo essere stato impostato, impostare le piastre in modo che possano essere cancellati all'inizio del giorno successivo (es., Istituito piatto alle ore 12 e chiaro alle ore 10 del giorno successivo). Si consiglia di scartare il primo piatto di uva per evitare le uova che le donne potrebbero essere stati ritenuta e that potrebbe essere avanzata in fase di sviluppo.

5. Raccogliere L1 (primo stadio) larve da piastre d'uva

1. Rimuovere le piastre di uva da bottiglie di 22 ore dopo che sono stati istituiti e posto in un 60 x 15 mm piastra di Petri.
2. Mettere una nuova piastra di uva con pasta di lievito fresco sulla bottiglia tenuta.
3. Cancella e scartare tutte le larve dalla piastra di uva senza semi utilizzando una sonda dissezione.
4. Incubare cancellato piastre d'uva per 4 ore in condizioni standard.
5. Dopo 4 ore, prendere 100 L1 larve per ceppo dalle piastre d'uva e mettere su piatti di cibo.
   1. Posizionare le larve sul cibo delicatamente (senza perforare il cibo e seppellendo le larve) ed evitare affollamento distribuendo le larve attraverso la piastra alimentare.
6. Incubare le piastre di cibo fino a quando gli animali di prova sono circa 10 ore prima dell'inizio del vagabondaggio.
   Nota: A 25 ° C, 10 ore prima di passeggiare in genere corrisponde a 72-96 ore dopo la schiusa. il exact tempo di incubazione deve essere determinato prima di iniziare l'esperimento raccogliendo un insieme iniziale di larve per ogni ceppo e registrare il numero di ore fino all'inizio di vagare (vagando larve si sposterà all'esterno del cibo sui lati e coperchio del cibo piatti).
   Nota: Se necessario, gli stessi genitori possono essere utilizzati per raccogliere larve per 3 - 4 giorni di test ripetendo i punti 4.7 a 5.5. Modificare l'ordine in cui vengono impostati i ceppi e testati attraverso giorni per evitare un effetto di ordine di prova sul percorso di lunghezza. Prova lo stesso ceppo "controllo" / ceppi ogni giornata di test per controllare per effetti da giorni.
7. Se molti ceppi sono testati, sfalsare le impostare e raccolta volte delle larve per consentire la verifica di ciascun ceppo al punto momento opportuno seguito.

6. larvale Test percorso di lunghezza

1. Sciogliere secco attivo lievito di birra in acqua a un rapporto 1: 2 (peso a volume). La pasta di lievito finito deve essere più sottile pancake pastella, in modo che quando si solleva un cucchiaio di pasta, gocciola e lascia dietro nastri sulla superficie della pasta che si sciolgono rapidamente via.
   Nota: La consistenza della pasta di lievito è importante e dovrebbe essere costante durante l'esperimento. L'esatta del lievito: rapporto acqua potrebbe dover essere regolata a seconda della marca e il lotto di lievito.
2. Delicatamente raccogliere larve del primo ceppo da testare dalla piastra cibo con un pennello.
3. Raccogliere le larve in una capsula di Petri e lavare delicatamente con acqua per rimuovere tutti gli alimenti.
   1. lavare rapidamente le larve con 1 - 2 ml di acqua e tamponare delicatamente larve secco con un laboratorio di pulire per evitare di trasferire l'acqua quando si posiziona le larve sulla piastra di prova. Per evitare lo stress, mantenere le larve umido ma non immerso in acqua.
4. Disporre tre lati piastre di prova a fianco e impostare un timer 5 minuti per ogni piastra di prova.
5. Applicare pasta di lievito all'inizio delle piastre di prova e con il divaricatore, sviluppa un sottile layer di pasta di lievito su ogni piastra di prova in modo che tutti i pozzetti presentano uno strato uniforme di lievito.
6. Posizionare delicatamente una larva nel centro di ogni pozzetto, a partire il timer 5 min dopo aver posizionato il primo larve su ciascun piatto. Nota: Tre piastre possono essere effettuate in un tempo, ottenendo un campione di giorno 30 / ceppo / test, fino ad un totale di 500 larve.
7. Collocare un piatto Petri coperchio sulla parte superiore di ciascun pozzetto.
8. Quando il timer si esaurisce, senza rimuovere le larve dalla piastra, iniziare a tracciare il percorso lunghezze lasciati nel lievito utilizzando un pennarello indelebile. Trace percorso lunghezze nello stesso ordine come larve sono stati posti sulle piastre di prova.
   1. Eseguire tracciando alla stessa velocità come larve sono stati posizionati sulle piastre. Per coerenza nell'analisi dei dati in seguito, utilizzare lo stesso indicatore per tutti i percorso lunghezze. Si raccomanda pennarello indelebile.
9. Ripetere i passaggi da 6.2 a 6.8.1 per ogni ceppo da testare. Raccogliere ogni ceppo dal cibo immediatamente prima del test per evitare gli effetti della fame, il path-length.

7. Gli alimenti privazione

1. Se larve sono di essere alimentare privato prima del test, raccogliere le larve come descritto nei punti da 6.2 a 6.3, ma la quantità di tempo desiderato cibo privazione in precedenza (ad es., Se le larve sono da alimentare privato per 4 ore, raccogliere le larve 4 ore prima tempo di test).
2. Dividere larve lavato in due gruppi e posizionare il cibo priva gruppo in un 60 x 15 mm piastra Petri con 5 ml 1% agar e il gruppo di controllo in una capsula di Petri con 5 ml di cibo standard.
3. Collocare un peso sopra del coperchio invertita delle piastre di Petri (altrimenti larve sono in grado di eseguire la scansione quando cerca di cibo).
4. Incubare per il periodo di privazione alimentare stabilita in precedenza e procedere con i test come descritto nei passaggi da 6.2 a 6.9.
5. Se molti ceppi sono da testare, sfalsare la privazione alimentare gli orari di inizio per consentire il test di ciascun ceppo al punto di tempo appropriato.

Analisi 8. Dati

Nota: Questa sezione descrive un metodo per l'analisi dei dati utilizzando ImageJ ⁷ o ⁸ Fiji per l'elaborazione del percorso lunghezze, anche se altri software può essere utilizzato.

1. Utilizzare un tavolo luminoso per trasferire tutti i path-lunghezze tracciate dai coperchi capsula di Petri di carta bianca (coperchi possono essere lavati con etanolo e riutilizzati per ulteriori registrazioni percorso di lunghezza).
2. Tracciare una linea di riferimento diritto 50 mm su uno dei fogli di carta.
3. Eseguire la scansione delle path-lunghezze a una risoluzione di 300 dpi e salvare come file immagine bitmap o TIFF.
4. Aprire il file di immagine, selezionare la scheda "Processo"> "binario"> "Make binario". Poi sotto la scheda "Processo", selezionare "binario"> "skeletonize". Ciò produce una linea di larghezza di un pixel, indipendentemente dallo spessore della traccia.
5. Assicurarsi che ogni percorso di lunghezza appare come una linea singola continua senza crossover.
6. Separare eventuali intersezioni utilizzando il "Li drittostrumento ne "e colorare la linea bianca (la continuità del percorso possono essere controllati con il" (rintracciamento strumento bacchetta "), l'intero percorso deve essere evidenziata in giallo (Fig. 2).
7. Selezionare i "Analyse" scheda> Imposta misure e selezionare e "etichetta Display" "perimetrale".
8. Selezionare la scheda "Analyse"> "Imposta scala" e selezionare "Rimuovi scala".
9. Sull'immagine, selezionare la linea di riferimento, selezionare la scheda "Analyse"> "particelle Analyse" e selezionare "Mostra: Contorni", "Risultati" e "indice chiaro i risultati". Nota: L'uscita mostrerà il numero di pixel corrispondente alla linea in scala 50 mm.
10. Selezionare "Analyse" scheda> "Imposta scala" e inserire il numero di pixel in "Distanza in pixel" e la distanza corrispondente (50 mm) in "distanza nota".
11. Infine, selezionare tutti i disegni percorso di lunghezza di un genotipo di unatempo ta, selezionare la scheda "Analyse"> "particelle Analyse" e selezionare "Mostra: contorni", "Risultati" e "indice chiaro i risultati".
    1. Rimuovere eventuali etichette scritte o segni estranei evidenti (che saranno riconosciuti come percorso-lunghezze) all'interno dell'area selezionata selezionando l'area e lo riempie bianco.
12. Ispezionare visivamente il file di output "Profili" per garantire i perimetri sono stati correttamente accertate. L'output mostrerà un percorso di lunghezza in mm per ciascun disegno percorso di lunghezza nella selezione. Questo può essere facilmente esportato in un foglio di calcolo e analizzati con qualsiasi software statistico.

Risultati

Differenze nella path-lunghezza del rover e sitter per i ceppi e l'effetto della privazione di cibo sul percorso di lunghezza sono illustrati in Fig. . 3 I dati raccolti nel corso di tre giorni consecutivi di test hanno mostrato un significativo effetto ceppo (F _(1.421) = 351,89, p <2,20 x 10 ^-16; Fig. 3A), con rover viaggiare più lontano di sitter. Oltre all'effetto ceppo, c'era anche...

Discussione

Il saggio percorso di lunghezza qui delineato offre una misura robusto e semplice del comportamento di foraggiamento delle larve di Drosophila. Il protocollo segue la metodologia generale descritta in Sokolowski ^2, ma dal momento che è stato migliorato per quanto riguarda l'efficienza e controlli sperimentali. Per quanto a nostra conoscenza questo metodo è l'unico metodo disponibile per la misurazione larvale percorso di lunghezza. La versione originale del protocollo ^{2, 3, 15, 16}

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 oz fly culture bottles	Fisher Scientific	AS355
Fly vial plugs	Droso-Plugs	59-201
35 x 10 mm Petri dishes	Falcon	351008
100 x 15 mm Petri dishes	Fisher	875712
60 x 15 mm Petri dishes	VWR	25384-168
Dissecting probes	Almedic	2325-58-5300
Yeast	Lab Scientific	FLY-8040-20F