için yiyecek arama yolu uzunluğu Protokolü<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

Özet

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

Özet

Drosophila melanogaster larva yol uzunluğu fenotip davranışsal değişim genetik ve çevresel katkılarını incelemek için kullanılan bir tesis ölçüsüdür. Larva yol uzunluğu tahlil sonra toplayıcı genin bağlantılı olduğunu toplayıcı davranış bireysel farklılıkları ölçmek için geliştirilmiştir. Larva yol uzunluğu genetik ekranlar için, en az maliyetle, büyük örneklem boyutlarının toplama kolaylaştıran bir kolay gol özelliktir. Burada ilk Sokolowski tarafından kullanılan larva yol uzunluğu tahlil için geçerli protokol ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. protokol tekrarlanabilir test hayvanları ele davranışsal tahlil gerçekleştirmek ve verileri analiz nasıl ayrıntıları. Deney ortamı besleme manipüle önce tahlil gerçekleştirerek çevresel değişikliğe yanıt olarak davranış plastisite ölçmek için nasıl kullanılabileceğini bir örneği, aynı zamanda temin edilmektedir. Son olarak, uygun test tasarımı yanı sıra çevresel faktörlerin değiştirebileceğinizBöyle gıda kalitesi, gelişimsel yaş ve gündüz etkileri gibi larva yol uzunluğu tartışılmıştır.

Giriş

1910 yılında Thomas Hunt Morgan laboratuvarında beyaz genin bulunmasından bu yana, meyve sineği, Drosophila melanogaster (D. melanogaster), çeşitli biyolojik süreçlerin moleküler ve fizyolojik temellerinin çalışma için bir model olarak kullanılmıştır. D. popülerlik melanogaster büyük ölçüde genetik araçları önemli miktarı ve çeşitliliği kaynaklanmaktadır. Drosophila en küçük boyutlu, taşıma ve kısa nesil süresi göreli kolaylığı o genetik çalışmalar için ideal bir model oluşturmak. Aynı derecede önemli olan memeliler dahil olmak üzere daha karmaşık organizmalar tarafından ifade fenotipleri birçok göstermek için Drosophila kapasitesidir. Bu organizma ve çevresi arasındaki arayüzde durmak böyle bir davranışa gibi karmaşık fenotipleri içerir. meyve sineği böyle, davranışsal çalışmalar genler ve çevre davranışı aracılık nasıl anlayışımıza önemli ölçüde katkıda bulunmuştur olarak1.

D. ilk çalışmalardan biri melanogaster larva davranış beslerken larva ² yolu-uzunluklarını ölçerek larva toplayıcı stratejileri bireysel farklılıkları araştırıldı. Yol uzunluğu beş dakikalık bir süre içinde, maya tek bir larva tarafından katedilen toplam mesafe olarak tanımlanmıştır. Toronto'da bir doğal nüfus hem laboratuar suşları ve sinekler kendi toplayıcı davranışlarında farklılık ve yol uzunluğu bireysel farklılıklara genetik bir bileşeni oldu. İki larva toplayıcı morphs nicel yol uzunluğu dağıtımlarından tarif edildi ve onlar gezici ve bakıcısı çağrıldı. daha büyük bir alanı geçme sırasında Rovers ise oturabilenler daha gıda alt tabaka üzerinde uzun yol-uzunlukları sergilerler. Bu yol uzunluğu deneyi kullanılarak, de Belle ve ark., ³ chromosome- 2 (24A3-24C5) bir ayrık konuma bu bireysel davranış farklılıkları altında yatan toplayıcılık (için) genini eşleştirilmiş. D. mgen için elanogaster sonra ⁴ klonlanabilir ve bir cGMP bağımlı protein kinaz ^5, fizyoloji ve davranış Drosophila ve diğer organizmaların ⁶ bir modülatörü olduğu ortaya çıkmıştır.

Burada aslında Sokolowski ² geliştirilen larva yol uzunluğu tahlil için geçerli protokol özetlemektedir. testinin bazı yönleri yıllar içinde değişti olmasına rağmen, tasarımın arkasındaki kavram değildir vardır. Biz de Drosophila larva toplayıcı davranış bireysel farklılıklara genetik ve çevresel katkılarını değerlendirmek deney potansiyelini göstermek için veri sağlar. larva yol uzunluğu tahlil, basit, verimli ve henüz sağlam. Tek bir kişi, dört saat içinde kolaylıkla 500 larva kadar test ve sonuçlar tekrarlanabilirlik yüksek düzeyde elde edilebilir. Başlangıçta çalışmalarda genetik ekranlar, niceliksel özellik lokusu haritalama kullanılan ve edilebilir için lokalize için geliştirilmişgen-by-çevre (GXE) etkileşimleri. Dahası, onun basitliği ve uyarlık o lisans öğretimi için büyük bir kaynaktır olun.

Protokol

1. Larva Tahsil Üzüm Plakaları ve Holding Şişeler hazırlayın

1. Tutan şişe yapmak için, hava temini için bir sinek flakon fiş sığacak kadar büyük 6 oz sinek kültürü şişeleri, (Şek. 1D) bir tarafında delikler kesti.
2. (Ağar, üzüm suyu kaynatma ile üzüm suyu ortamında (% 1.8 ağar,% 45 üzüm suyu,% 2.5 asetik asit,% 2.5 etanol) 250 ml hazırlanması ve suyun büyük bölümü, 70 ° C kadar soğumaya, üzüm plakaları yapmak için ) soğutma sırasında, daha sonra asetik asit ve etanol ekleyin ve su ile hacme getirmek karıştırın.
3. Üzüm suyu ortamının yüzey kapağının (Şek. 1A) dudak üzerinde bir kubbe edinceye kadar 35 x 10 mm Petri kabı kapaklarını doldurmak için (iğne olmadan) bir şırınga kullanın.
4. 4 ° C'de nemli ve hava almayan kaplarda saklayın üzüm plakaları kullanıma kadar (2 hafta maksimum).

Gıda Tabaklar 2. Hazırlık

1. Standart sinek gıda tarifi hazırlayın.
   Not: t için% 10 sakroz,% 1.3 ağar,% 0.8 potasyum sodyum tartrat, 0.1% monopotasyum fosfat,% 0.05 sodyum klorür,% 0.05 kalsiyum klorid,% 0.05 magnezyum klorür: yol uzunluğu EST yetiştirme gıda kalitesi etkisi Bu düşük besin sinek gıda kullanılan % 0.05 su içinde demir sülfat,% 5 ve% 0.5 maya propionik asit; ve yüksek besin sinek gıda:% 1.5 sukroz,% 1.4 ağar,% 3 glükoz,% 1.5 mısır unu,% 1 buğday tohumu,% 1 soya unu,% 3 melas,% 3.5 maya,% 0.5 propionik asit,% 0.2 Tegosept 1 su içinde% etanol. Her iki yiyeceklerde propiyonik asit, Tegosept ve etanol eklemeden önce 50 ^o C ^'çözüm ve serin otoklav.
2. 100 x 15mm Petri kapları içine sinek gıda 40 ml dökün.
3. 4 ° C'de nemli ve hava almayan kaplarda saklayın gıda plakaları kullanıma kadar (2 hafta maksimum).

3. Test Plakaları hazırlayın

1. çapı 58 x 25 cm, 10, 1 mm derinliğinde dairesel çukurlar 6 mm kalınlığında siyah Pleksiglas plakalar, 10 cm hazırlamak ve 2 x 5 gün içinde düzenlenmişlarva üzerinde test etmek esign (Şek. 1C).
   Not: 3 ya da yukarıdaki pleksiglas plakaların daha mevcut olup olmadığını 30 larva kadar bir seferde test edilebilir. Seçenek olarak ise, larvalar petri kase çapı 10 cm test edilebilir. Bu seçenek daha zahmetlidir ve test edilecek larvaların düşük sayılar için izin verir.
2. Pleksiglas testi plakalar üzerinde maya macunu yaymak için bir siyah 39 x 8 cm, 6 mm kalınlığında pleksiglas serpme edinin.
3. önceden dipleri kapaklarını ayırarak larva yol-uzunlukları kayıt için 100 x 15 mm Petri kabı kapaklarını hazırlayın.

4. Ebeveyn Populasyonlarında ayarlama

1. Tüm tahlil boyunca sabit yetiştirme koşulları tutmak (örneğin, 25 ºC,% 60 nem ve 12:12 ışık: Standart sinek gıda karanlık döngüsü).
2. Aynı yetiştirme koşullarında ebeveyn nüfusu kaldırın.
3. 150 kadın ve 50 - - 100 toplayın 75 erkek ve optimum doğurganlık için 5 ± 1 gün boyunca onları yaş.
4. f izinemales ve erkekler standart sinek gıda ile 6 oz sinek kültür şişe gecede çiftleşme.
5. Maskeleme bandı (Şekil 1E.) Ile üst üzerinde, Transfer tutma şişenin içine uçar ve bir üzüm plakasını (Şekil 1B döşeme yumurta teşvik edecektir üzüm plaka üzerinde taze maya hamur küçük bir miktar.) Sabitleyin.
6. Altındaki üzüm plaka ile, baş aşağı (Şek. 1F) ayakta şişeleri yetişkin üzüm plaka üzerinde yumurtalarını bırakmak için izin bırakın.
7. 24 saat sonra ilk üzüm plaka atın ve tutma şişe yeni bir üzüm plakasını yerleştirin. Bu larvalar, ertesi gün toplanıp getirildiği, üzüm plaka olacaktır.
   Not: Üzüm plakaları kurmak erken ertesi gün silinebilir, böylece plakaları kurmak sonra larva 22 saat temizlenecek gerekecektir (. Örneğin 12 pm plaka kurmak ve 10 net ertesi gün ben). Kadın stopaj ve tha olmuş olabilecek yumurta önlemek için ilk üzüm plaka atmak için tavsiye edilirt gelişiminde ileri olabilir.

5. Üzüm Tabaklar L1 (İlk Evre) Larva toplayın

1. 60 x 15 mm Petri kabındaki onlar kuruldu 22 saat sonra şişe ve yerden üzüm plakaları çıkarın.
2. tutma şişesi üzerinde taze maya macun ile yeni bir üzüm plaka koyun.
3. Açık ve diseksiyon prob kullanılarak seri başı üzüm plaka tüm larvaların atın.
4. Inkübe standart koşullarda 4 saat süreyle üzüm plakaları temizlenir.
5. 4 saat sonra, üzüm plakalardan suş başına 100 L1 larvaları almak ve gıda plakaları üzerinde yerleştirin.
   1. (Larva gıda delme ve gömme olmadan) nazikçe gıda larvaları koyun ve gıda plaka üzerinde larvaları dağıtarak kalabalığı önlemek.
6. Test hayvanları dolaşıp başlamadan önce yaklaşık 10 saat kadar gıda inkübe.
   Not: - yumurtadan çıktıktan sonra 96 ​​saat 25 ºC 'de, genel olarak dolaşıp 10 saat önce 72 karşılık gelir. exacinkübasyon süresi t miktarı her bir suş için larva bir başlangıç ​​seti toplama ve göçebe başlangıcına kadar saat sayısını kaydederek deney başlamadan önce belirlenmelidir (dolaşıp larvalar gıda tarafına ve kapağın üzerine gıda dışında hareket edecek levha).
   Not: Gerekirse, aynı anne 3 larva toplamak için kullanılabilir - 5.5 adımları 4.7 tekrarlayarak test 4 gün. suşları yol uzunluğu bir test sipariş etkisini önlemek için gün boyunca kurmak ve test edildiği sırasını değiştirin. Aynı "kontrol" gerginlik test / gün etkileri kontrol etmek için test her gün suşları.
7. Birçok suş test edilir ise, daha sonra, uygun bir zaman noktasında her bir suş test edilmesi için izin vermek için, larvaların kurmak ve toplama süreleri sersemleme.

6. Larva Yol boyu Testi

1. 2 oranında (hacime göre ağırlık) bir 1: su içinde, kuru aktif fırıncı mayası içinde çözülür. bitmiş maya yapıştırmak pa daha ince olmalıdırncake meyilli, macun dışında bir kaşık kaldırma bir şekilde, o damlar ve hızlı bir şekilde eriyip hamur yüzeyinde şeritler geride bırakır.
   Not: Maya macunun kıvamı önemlidir ve deney boyunca sabit olmalıdır. Tam maya: su oranı marka ve maya toplu bağlı ayarlanması gerekebilir.
2. Yavaşça ilk gerginlik larvaları bir boya fırçası kullanarak gıda plaka test edilecek seçin.
3. Bir Petri kabındaki larvaları toplayın ve yavaşça tüm yiyecek çıkarmak için su ile yıkayın.
   1. bir laboratuvar ile 2 ml su ve hafifçe dab larva kuru test plakası üzerinde larvaları verirken suyun aktarılmasını engellemek için silin - Çabuk 1 ile larva yıkayın. , Stres önlemek nemli ama suya batırıldıktan değil larvaları tutmak için.
4. yan üç test plakaları yan düzenleyin ve her bir test plakası için 5 dk zamanı ayarlayın.
5. Test plakalarının üstüne maya macunu sürün ve serpme kullanarak, ince yatıyordu yayıldıtüm kuyuları maya düz bir tabaka var ki her test plakası üzerinde maya hamur er.
6. Yavaşça her tabakta ilk larvaları yerleştirdikten sonra 5 dakika zamanlayıcı başlayarak her bir merkezi bir larva yerleştirin. Not: Üç tabak 500 larva toplam kadar 30 / suş / test günün bir örneklem büyüklüğü veren, bir defada yapılabilir.
7. her bir üstüne bir Petri kabı kapağı yerleştirin.
8. Zamanlayıcı bittiğinde, plakadan larvaları çıkarmadan, kalıcı bir kalem kullanarak maya geride bıraktığı yol-uzunlukları izleme başlar. larva aynı sırayla iz yolu uzunlukları testi plakalar üzerine yerleştirildi.
   1. Larvalar tabakalarına yerleştirildi ile aynı hızda izlemeyi gerçekleştirin. Daha sonra veri analizinde tutarlılık için, tüm yol-uzunlukları aynı işaretleyici kullanın. Kalıcı işaretleyici tavsiye edilir.
9. Yineleyin her suş test edilecek için 6.8.1 için 6.2 adımları tekrarlayın. hemen pa üzerinde açlık etkilerini önlemek için test etmeden önce gıda her yük almakinci uzunlukta.

7. Gıda Yoksunluk

1. Larvalar, gıda test edilmeden önce yoksun olması adım 6.2 6.3'e tarif edildiği gibi larvaları toplamak için, ancak gıda yoksunluğu zaman istenilen miktarda daha önce (örn., Larvalar eğer gıda 4 saat yoksun olması ise daha önce larva 4 saat toplama Test süresi).
2. iki gruba yıkanmış larvaları bölün ve 5 ml standart gıda ile bir Petri kabındaki 5 ml% 1 agar ve kontrol grubu ile 60 x 15 mm Petri kabındaki gıda yoksun grubu yerleştirin.
3. Petri yemekleri ters kapak (Aksi larva yiyecek ararken Sürünerek edebiliyoruz) üstüne bir ağırlık koyun.
4. Daha önce kurulan gıda yoksunluğu dönemi boyunca inkübe ve adımları 6.9 6.2 tarif edildiği gibi test ile devam edin.
5. Birçok suş test edilecek ise, aç bırakma, uygun bir zaman noktasında her bir suş test edilmesi için sürelerin başlangıç ​​yalpalayarak.

8. Veri Analizi

Not: diğer yazılım kullanılabilir olmasına rağmen, bu bölümde, yol-uzunlukları işleme ImageJ ⁷ veya Fiji ⁸ kullanılarak veri analizi için bir yöntemi anlatmaktadır.

1. (Kapaklar etanol ile yıkandı ve daha fazla yol uzunluğu kayıt için tekrar edilebilir) beyaz kağıda Petri kabı kapaklarının tüm takip yolu-uzunlukları aktarmak için bir ışık tabloyu kullanın.
2. kağıt yaprak birinde 50 mm düz referans çizgisi çiziniz.
3. 300 dpi çözünürlükte yol-uzunlukları tarayın ve bitmap veya TIFF görüntü dosyaları olarak kaydedin.
4. "Süreç" sekmesine> "Binary"> "ikili olun" seçeneğini görüntü dosyasını açın. Sonra "Süreç" sekmesi altında,> "iskeletini" "İkili" seçeneğini seçin. Bu ne olursa olsun iz kalınlığı, bir piksel genişliği hattını oluşturur.
5. Her yol uzunluğu hiçbir geçitler ile sürekli tek bir satır olarak göründüğünden emin olun.
6. "Düz li kullanarak herhangi kavşakları ayırınne aracı Wand "(izleme) aracı" ve çizgi beyaz (yolun devamlılığını boyama ile kontrol edilebilir ", tüm yolu sarı vurgulanmış olmalıdır (Şek. 2).
7. "Analiz" sekmesi> Set ölçümleri seçin ve "Çevre" ve "Ekran etiketi" seçeneğini seçin.
8. "Analiz" sekmesi> "Set ölçeği" seçin ve "ölçek Kaldır" seçeneğini seçin.
9. resmin üzerine,> "Analiz parçacıkları" "Analiz" sekmesini seçin, sadece referans satırı seçin ve "Göster: Anahatları", "sonuçlarını görüntüle" ve "Temizle sonuç tablosu". Not: Çıktı 50 mm çaplı hattına gelen piksel sayısını gösterir.
10. "Analiz" sekmesi> "Set ölçeği" seçin ve "piksel uzaklığı" piksel sayısı ve "Bilinen mesafe" karşılık gelen mesafe (50 mm) doldurun.
11. Son olarak, bir genotip a tüm yol uzunluğu çizimleri seçinta zaman, "Analiz" sekmesi> "Analiz parçacıkları" seçeneğini seçin "Göster: hatlarını", "sonuçlarını görüntüle" ve "Temizle sonuç tablosu".
    1. alanı seçerek ve beyaz doldurularak seçilen alanın içinde herhangi bir yazılı etiketleri veya bariz yabancı işaretleri (onlar yol-uzunlukları olarak kabul edilecektir) çıkarın.
12. Görme perimeters doğru tespit emin olmak için "Ana Hatları" çıktı dosyası kontrol edin. çıkışı seçimi her yol uzunluğu çizim için mm cinsinden bir yol-uzunluğunu gösterecektir. Bu kolay bir elektronik tablo ihraç ve herhangi bir istatistik yazılımı ile analiz edilebilir.

Sonuçlar

Gezici ve bakıcısı suşlar için ve yol uzunluğu gıda yoksunluk etkisi yolu uzunluğu farklılıklar Şekil l'de gösterilmiştir. . Rovers uzak oturabilenler daha yolculuk ile; (Şekil 3A. F _(1,421) = 351,89, p <2.20 x 10 ^-16) 3 Veri test üç ardışık gün boyunca toplanan önemli bir gerilme etkisi gösterdi. Gıda, dört saat önce test için yoksun bırakıldı larvaları ile, suş ...

Tartışmalar

Burada özetlenen yol uzunluğu tahlil Drosophila larvaların toplayıcı davranış sağlam ve basit bir ölçü sunmaktadır. Protokol Sokolowski ^2'de tarif edilen genel metodolojiyi takip eder, ancak bu yana verimlilik ve deneysel kontrol açısından iyileştirilmiştir. Bizim bilgimize göre bu yöntem larva yol-uzunluk ölçüm için mevcuttur yöntemdir. Yol uzunluğu protokol ^{2, 3, 15,} bir fırça ile uygulanır maya hamur ince bir tabaka, ve çubuk yayılan, daha sonra bir bar...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 oz fly culture bottles	Fisher Scientific	AS355
Fly vial plugs	Droso-Plugs	59-201
35 x 10 mm Petri dishes	Falcon	351008
100 x 15 mm Petri dishes	Fisher	875712
60 x 15 mm Petri dishes	VWR	25384-168
Dissecting probes	Almedic	2325-58-5300
Yeast	Lab Scientific	FLY-8040-20F