Forrageamento Protocolo Caminho de comprimento para<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larvas

Resumo

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

Resumo

A Drosophila melanogaster larval fenótipo caminho de comprimento é uma medida estabelecida usada para estudar as contribuições genéticas e ambientais para a variação comportamental. O ensaio de caminho de comprimento das larvas foi desenvolvido para medir as diferenças individuais em comportamento de forragem que foram depois ligados ao gene A alimentar. Larval caminho de comprimento é uma característica facilmente marcado que facilita a coleta de grandes tamanhos de amostra, a um custo mínimo, para telas genéticos. Aqui nós fornecemos uma descrição detalhada do actual protocolo para o ensaio caminho de comprimento larval utilizado pela primeira vez por Sokolowski. Os detalhes do protocolo como lidar com os animais de teste de forma reprodutível, realizar o ensaio comportamental e analisar os dados. Um exemplo de como o ensaio pode ser utilizado para medir a plasticidade comportamental em resposta às alterações do ambiente, através da manipulação de alimentação ambiente antes de realizar o ensaio, também é fornecido. Finalmente, o design de teste adequado, bem como fatores ambientais que podem modificarlarval caminho de comprimento, tais como a qualidade dos alimentos, idade de desenvolvimento e os efeitos dia são discutidas.

Introdução

Desde a descoberta do gene branco no laboratório de Thomas Hunt Morgan em 1910, a mosca da fruta, Drosophila melanogaster (D. melanogaster), tem sido utilizada como um modelo para o estudo dos fundamentos moleculares e fisiológicos de diversos processos biológicos. A popularidade de D. melanogaster em grande parte decorre da considerável quantidade e variedade de ferramentas genéticas. pequeno tamanho da Drosophila, relativa facilidade de manuseio e de geração curto tempo torná-lo um modelo ideal para estudos de genética. Igualmente importante é a capacidade de Drosophila para demonstrar muitos dos fenótipos expressas pelos organismos mais complexos, incluindo mamíferos. Isto inclui os fenótipos complexos, tais como o comportamento que se na interface entre o organismo e o seu ambiente. Como tais estudos, comportamentais sobre a mosca da fruta, têm contribuído significativamente para a nossa compreensão de como os genes eo ambiente mediar comportamento1.

Um dos primeiros estudos de D. comportamento larval melanogaster investigou as diferenças individuais nas estratégias de forrageamento larvais através da medição do trajeto de comprimentos de larvas ^2, enquanto a alimentação. Caminho de comprimento foi definido como a distância total percorrida por uma única larva em leveduras, dentro de um período de cinco minutos. Ambas as estirpes laboratoriais e moscas de uma população natural em Toronto variou em seus comportamentos de forrageamento e havia um componente genético para as diferenças individuais no caminho de comprimento. Duas formas de forrageamento larvas foram descritas a partir das distribuições caminho de comprimento quantitativos e eles foram chamados rover e sitter. Rovers exibem caminho mais longo de comprimentos ao atravessar uma área maior, enquanto em um substrato de alimentos do que sitters. Usando este ensaio caminho de comprimento, de Belle et al. ³ mapeou o (a) gene forrageamento subjacente a estas diferenças comportamentais individuais para um local discreto em chromosome- 2 (24A3-24C5). O D. melanogaster para o gene foi depois clonado ⁴ e revelou ser uma proteína quinase dependente de cGMP ^5, um modulador de fisiologia e comportamento em Drosophila e outros organismos ^6.

Aqui destacamos o protocolo atual para o ensaio de caminho de comprimento larval originalmente desenvolvido na Sokolowski ^2. Embora alguns aspectos do ensaio mudaram ao longo dos anos, o conceito por trás do projeto não tem. Nós também fornecemos dados para ilustrar o potencial do ensaio para avaliar contribuições genéticas e ambientais para as diferenças individuais no comportamento de forrageamento de larvas de Drosophila. O ensaio caminho de comprimento larval é simples, eficiente, e ainda assim robusto. Uma única pessoa pode testar-se a 500 larvas com facilidade em quatro horas e os resultados podem ser obtidos com um elevado grau de reprodutibilidade. Desenvolvida originalmente para localizar, ele pode ser utilizado em rastreios genéticos, mapeamento locus da característica quantitativa, e em estudosde gene-a-ambiente (GxE) interações. Além disso, sua simplicidade e reprodutibilidade torná-lo um grande recurso para o ensino de graduação.

Protocolo

1. Prepare placas de uvas e garrafas Dadas para a coleção de larvas

1. Para fazer garrafas segurando, cortar buracos em um lado do 6 oz garrafas de cultura mosca, grandes o suficiente para caber um plug frasco da mosca para a alimentação de ar (Fig. 1D).
2. Para fazer placas de uva, preparar 250 ml de meio de sumo de uva (1,8% de agar, 45% de sumo de uva, 2,5% de ácido acético, 2,5% de etanol) à ebulição, o agar, sumo de uva e a maior parte da água, arrefecer a 70 ° C ( agitar durante o resfriamento), em seguida, adicionar ácido acético e etanol e completar o volume com água.
3. Utilize uma seringa (sem agulha) para encher 35 x 10 mm de Petri tampas prato até que a superfície do meio de sumo de uva faz uma cúpula acima do lábio da tampa (Fig. 1A).
4. placas de uva armazenar em um recipiente hermético úmido e a 4 ºC até à sua utilização (até um máximo de 2 semanas).

2. Preparação de placas Food

1. Prepare receita mosca padrão alimentos.
   Nota: a TEst efeitos da qualidade da criação de alimentos no caminho de comprimento foi utilizado alimentar com baixo teor de nutrientes mosca: 10% de sacarose, 1,3% de ágar, 0,8% de tartarato de sódio e potássio, fosfato monopotássico 0,1%, cloreto de sódio 0,05%, 0,05% de cloreto de cálcio, cloreto de magnésio a 0,05%, 0,05% de sulfato férrico, 5% de levedura e 0,5% de ácido propiónico em água; e altos níveis de nutrientes alimentos mosca: 1,5% de sacarose, 1,4% de ágar, 3% de glucose, 1,5% de farinha de milho, 1% de germe de trigo, 1% de farinha de soja, 3% de melaço, 3,5% de levedura, 0,5% de ácido propiónico, 0,2% Tegosept e 1 % de etanol em água. Para ambos os alimentos autoclave a solução e arrefecer a 50 ^° C antes de adicionar o ácido propiônico, Tegosept e etanol.
2. Despeje 40 ml de alimentos mosca em 100 x 15mm placas de Petri.
3. placas de alimentos armazenar em um recipiente hermético úmido e a 4 ºC até à sua utilização (até um máximo de 2 semanas).

3. Prepare placas de teste

1. Prepare 58 x 25 cm, 6 mm de espessura placas de acrílico preto com 10, 1 mm poços circulares de profundidade, 10 cm de diâmetro e dispostos de 2 x 5 design (Fig. 1C) para testar em larvas.
   Nota: até 30 larvas podem ser testados em um momento se três ou mais das placas de Plexiglas acima estão disponíveis. Alternativamente, as larvas podem ser testadas em placas de Petri, de 10 cm de diâmetro. Esta opção é muito mais laboriosa e permite menor número de larvas a serem testados.
2. Obter um preto 39 x 8 cm, 6 milímetros de espessura Plexiglas espalhador para espalhar a pasta de leveduras sobre as placas de teste de Plexiglas.
3. Prepare 100 x 15 mm tampas placa de Petri para a gravação de larvas de caminho-comprimentos, separando tampas de fundos com antecedência.

4. Criação de populações parentais

1. Mantenha condições de criação constante durante todo o ensaio (por exemplo, 25 ºC, 60% de umidade e luz 00:12: ciclo escuro em alimentos mosca standard).
2. Levante população parental em condições mesmas de criação.
3. Colete 100 - 150 do sexo feminino e 50 - 75 do sexo masculino e idade-los por 5 ± 1 dias para fecundidade ideal.
4. permitir females e machos para acasalar durante a noite em uma garrafa de cultura mosca 6 oz com alimentos mosca padrão.
5. Transferência de moscas em uma garrafa de exploração e garantir uma placa de uva (uma pequena quantidade de pasta de levedura fresca na placa de uva irá promover a postura de ovos; A Fig. 1B) sobre a parte superior com fita adesiva (Fig. 1E).
6. Deixar garrafas em pé de cabeça para baixo (Fig. 1F), com a placa de uva na parte inferior para permitir que os adultos para colocar ovos na placa de uva.
7. Rejeitar a primeira placa de uva depois de 24 horas e colocar uma nova placa de uva na garrafa exploração. Esta será a placa de uva a partir do qual as larvas são recolhidas no dia seguinte.
   Nota: placas de uvas terão de ser apuradas de larvas de 22 horas depois de ser criada, configurar as placas de modo que possam ser apuradas início dia seguinte (. Por exemplo, configurar placa às 12 horas e clara às 10 horas do dia seguinte). É aconselhável descartar a primeira placa de uva para evitar todos os ovos que as fêmeas poderiam ter sido retido na fonte e thaT pode ser avançada em desenvolvimento.

5. Recolher L1 (primeiro estádio) Larvas de placas de uva

1. Remover placas de uva de garrafas de 22 horas depois de terem sido criados e coloque em um 60 x 15 mm placa de Petri.
2. Colocar uma nova placa de uva com pasta de fermento fresco no frasco exploração.
3. Limpar e descartar todas as larvas a partir da placa de uva sem sementes, utilizando uma sonda de dissecação.
4. Incubar apagada placas de uva durante 4 horas em condições normais.
5. Após 4 horas, escolher 100 L1 larvas por tensão das placas de uva e coloque em pratos de comida.
   1. Coloque as larvas no alimento com cuidado (sem perfurar a comida e enterrando as larvas) e evitar aglomeração, distribuindo as larvas ao longo da placa de alimentos.
6. Incubar as placas de comida até animais de teste são aproximadamente 10 horas antes do início do errante.
   Nota: A 25 ºC, 10 horas antes de passear geralmente corresponde a 72-96 horas após a eclosão. o EXACt quantidade de tempo de incubação deve ser determinado antes do início do experimento através da recolha de um conjunto inicial de larvas para cada estirpe e gravar o número de horas até o início da vagando (larvas vagando irá se mover para fora do alimento para os lados e tampa do alimento pratos).
   Nota: Se for necessário, os mesmos pais podem ser usadas para recolher larvas durante 3 - 4 dias de testes, repetindo os passos 4,7-5,5. Alterar a ordem em que as estirpes são criados e testados através dias para evitar um efeito de ordem de teste no caminho de comprimento. Teste a mesma estirpe "controle" / cepas cada dia de testes para controlar os efeitos dia.
7. Se muitas estirpes são testadas, escalonar os definidos acima e recolha vezes das larvas para permitir o teste de cada estirpe no ponto de tempo apropriado mais tarde.

6. Teste de passagem de comprimento larval

1. Dissolva o fermento de padeiro seca-activo em água numa proporção de 1: 2 proporção (em peso por volume). A pasta de levedura terminou deve ser mais fino do que pancake massa, de uma maneira que ao levantar uma colher para fora da pasta, goteja e deixa para trás fitas sobre a superfície da pasta que rapidamente derreter.
   Nota: A consistência da pasta de levedura é importante e deve ser constante ao longo da experiência. A exata de levedura: proporção de água pode ter que ser ajustado, dependendo da marca e lote de levedura.
2. Suavemente escolher larvas da primeira estirpe a ser testado a partir da placa de alimentos usando um pincel.
3. Recolhe larvas numa placa de Petri e lavar cuidadosamente com água para remover todos os alimentos.
   1. lavar rapidamente larvas com 1 - 2 ml de água e delicadamente dab larvas seco com um laboratório wipe para evitar a transferência de toda a água ao colocar as larvas na placa de teste. Para evitar o estresse, manter larvas úmido, mas não submerso em água.
4. Organizar três placas de teste lado a lado e definir a 5 min temporizador para cada placa de teste.
5. Aplicar pasta de levedura para o topo das placas de teste usando o espalhador e, se espalhar um leigo finaer de pasta de levedura em cada placa de ensaio de modo que todos os poços tem uma camada uniforme de levedura.
6. Suavemente colocar uma larva no centro de cada poço, a partir do temporizador 5 min após a colocação do primeiro larvas em cada placa. Nota: Três pratos pode ser feito ao mesmo tempo, obtendo-se um tamanho de amostra de 30 dias / estirpe / teste, até um total de 500 larvas.
7. Colocar uma tampa de placa de Petri por cima de cada poço.
8. Quando o tempo se esgota, sem necessidade de remover as larvas a partir da placa, inicie traçando o caminho de comprimentos deixados para trás na levedura usando um marcador permanente. Rastrear caminho de comprimentos na mesma ordem que as larvas foram colocadas sobre as placas de teste.
   1. Executar o rastreio com a mesma velocidade como larvas foram colocadas nas placas. Para consistência na análise de dados posteriormente, use o mesmo marcador para todos os caminho de comprimentos. marcador permanente é recomendado.
9. Repita os passos 6.2 a 6.8.1 para cada estirpe a ser testado. Escolha cada cepa do alimento imediatamente antes do teste para evitar os efeitos de fome no paTH-comprimento.

7. Food Privação

1. Se as larvas estão a ser privados de alimentos antes do teste, recolher larvas, tal como descrito nas etapas 6.2 e 6.3, mas a quantidade desejada de tempo de privação alimentar anterior (por exemplo., Se larvas devem ser privados de alimentos durante 4 horas, recolher larvas de 4 h antes de tempo de ensaio).
2. Divide larvas lavado em dois grupos e colocar o grupo privados de alimentos em uma placa de Petri de 60 x 15 mm com 5 ml de agar a 1% e o grupo de controlo numa placa de Petri com 5 ml de comida padrão.
3. Coloque um peso em cima da tampa invertida das placas de Petri (caso contrário, as larvas são capazes de arrastar para fora na busca de alimento).
4. Incubar durante o período de privação de alimento previamente estabelecido e prosseguir com ensaios, tal como descrito nas etapas 6.2 a 6.9.
5. Se muitas estirpes estão a ser testados, escalonar a privação de alimento começam vezes para permitir o teste de cada estirpe no ponto de tempo apropriado.

Análise 8. Dados

Nota: Esta secção descreve um método para a análise dos dados utilizando o ImageJ ⁷ ou ⁸ Fiji para processamento de caminho de comprimentos, apesar de outro software pode ser utilizado.

1. Use uma mesa de luz para transferir todas as caminho de comprimentos rastreados desde o tampas prato de Petri com papel branco (tampas podem ser lavados com etanol e reutilizados para outras gravações caminho de comprimento).
2. Seguir a uma linha de referência direita 50 mm em uma das folhas de papel.
3. Digitalizar o trajeto de comprimentos com uma resolução de 300 dpi e salvar como arquivos de imagem bitmap ou tiff.
4. Abra o arquivo de imagem, selecione a guia "Processo"> "Binary"> "Fazer binário". Em seguida, na guia "Processos", selecione "Binary"> "esqueletizar". Isso produz uma linha de largura de um pixel, independentemente da espessura do traço.
5. Certifique-se de cada caminho de comprimento aparece como uma única linha contínua, sem cruzamentos.
6. Separar quaisquer cruzamentos usando o "li Heterone ferramenta "e colorindo a linha branca (a continuidade do caminho pode ser verificado com o" (rastreamento Wand Tool "), todo o caminho deve ser destacado amarelo (Fig. 2).
7. Selecione a opção "Analisar" guia> medições Definir e selecione "Perímetro" e "etiqueta Display".
8. Selecione a aba "Analyse"> "Definir escala" e selecione "Remover escala".
9. Na imagem, selecione a linha de referência única, selecione a guia "Analyse"> "partículas Analisar" e selecione "Mostrar: Contornos", "Mostrar resultados" e "table Limpar resultados". Nota: A saída irá mostrar o número de pixels correspondente à linha de escala de 50 mm.
10. Selecione "Analyse" tab> "escala de Ajuste" e preencha o número de pixels em "Distância em pixels" e a distância correspondente (50 mm) em "distância conhecida".
11. Por fim, selecione todos os desenhos caminho de comprimento de um genótipo de umtempo ta, selecione a guia "Analyse"> "partículas Analisar" e selecione "Mostrar: contornos", "Mostrar resultados" e "table Limpar resultados".
    1. Remova as eventuais etiquetas escritas ou marcações estranhas óbvias (que será reconhecido como caminho-comprimentos) dentro da área selecionada, selecionando a área e enchendo-a de branco.
12. inspecionar visualmente o arquivo de saída "Esboços" para garantir os perímetros foram correctamente apurado. A saída irá mostrar um caminho de comprimento em mm para cada desenho caminho de comprimento na selecção. Isso pode ser facilmente exportados para uma planilha e analisados ​​com qualquer software estatístico.

Resultados

As diferenças de caminho de comprimento da sonda e acompanhante para as estirpes e o efeito de privação de alimento no caminho de comprimento são ilustrados na Fig. . 3 Os dados recolhidos ao longo de três dias consecutivos de testes mostraram um efeito significativo tensão (F _(1,421) = 351,89, p <2,20 x 10 ^-16; A Fig. 3A), com rovers viajar mais longe do que sitters. Além disso para o efeit...

Discussão

O ensaio caminho de comprimento descrito aqui oferece uma medida robusta e simples de comportamento de forrageamento de larvas de Drosophila. O protocolo segue a metodologia geral descrita no Sokolowski ^2, mas desde que foi melhorada no que diz respeito à eficiência e controles experimentais. Para o melhor de nosso conhecimento, este método é o único método disponível para medir a caminho de comprimento larval. A versão original do protocolo ^{2, 3, 15, 16} larvas testadas em placas d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 oz fly culture bottles	Fisher Scientific	AS355
Fly vial plugs	Droso-Plugs	59-201
35 x 10 mm Petri dishes	Falcon	351008
100 x 15 mm Petri dishes	Fisher	875712
60 x 15 mm Petri dishes	VWR	25384-168
Dissecting probes	Almedic	2325-58-5300
Yeast	Lab Scientific	FLY-8040-20F