JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

طريقة جديدة ممغطس الإلكترون الرنين (الثوري) وسريعة مسح الثوري (RS-EPR)، ويتضح لل2D التصوير المكاني الطيفي الذي يتفوق على الأسلوب التقليدي موجة مستمرة (CW) ويفتح مجالات جديدة للتصوير في الجسم الحي. وأظهرت النتائج في 250 ميغاهيرتز، ولكن هذه التقنية قابلة للتطبيق في أي تردد.

Abstract

ونحن لشرح طريقة متفوقة من 2D التصوير الطيفي المكاني للاستقرار الجزيئات مراسل جذرية في 250 ميغاهيرتز باستخدام السريع المسح الإلكترون ممغطس بالرنين (RS-EPR)، والتي يمكن أن توفر معلومات كمية تحت المجراة الظروف على تركيز الأكسجين، ودرجة الحموضة، الأكسدة حالة وتركيز الجزيئات يشير (أي، OH •، NO •). تقنية RS-الثوري لديها حساسية أعلى، وتحسين القرار المكانية (1 مم)، وأقصر وقت الشراء بالمقارنة مع أسلوب قياسي موجة مستمرة (CW). وقد تم اختبار مجموعة متنوعة من التشكيلات الوهمية، مع القرار المكانية متفاوتة 1-6 ملم، والعرض الطيفي للجزيئات مراسل تتراوح بين 16 μT (160 ملغ) إلى 5 طن متري (50 G). ومرنان ذات النسقين عبر حلقة على فصل الإثارة والكشف، والحد من الضوضاء، في حين أن تأثير المسح السريع يتيح المزيد من القوة ليكون مدخلا لنظام الدوران قبل التشبع، وزيادة إشارة الثوري. هذايؤدي إلى ارتفاع كبير في نسبة الإشارة إلى الضوضاء مما كانت عليه في التجارب CW الثوري التقليدية.

Introduction

بالنسبة لطرائق التصوير الطبي أخرى، والإلكترون ممغطس صدى التصوير (معهد بحوث البترول) هو فريد قادر على كميا صورة الخصائص الفسيولوجية بما في ذلك درجة الحموضة 1-3، ص 04-07 فبراير، ودرجة الحرارة 8، نضح وسلامة الأنسجة 9، microviscosity وسهولة نشر الجزيئات الصغيرة 10 و 11 الاكسدة. تقدير سهولة انشقاق ثاني كبريتيد من الجلوتاثيون (GSH) في الأنسجة والخلايا 12،13 يستطيع أن يقدم تقريرا عن حالة الأكسدة. للتصوير في الجسم الحي، يتم اختيار الثوري في مدى التردد بين 250 ميغاهيرتز و 1 غيغاهرتز لهذه الترددات توفر عمق كاف من اختراق الأنسجة (تصل إلى عدة سم) لتوليد صور للحيوانات الصغيرة التي لا تضعف شدة من آثار فقدان عازلة. ترددات أعلى، مثل 9.5 غيغاهرتز 14 (اكس باند) و 17 جيجا هرتز (ك ش باند) 15،16 يمكن استخدامها للتصوير من الجلد والشعر، أو الخلايا وحيدة، على التوالي. نجاح معهد بحوث البترول في جميع الترددات يعتمد على تحقيقات تدور ممغطس التي هي محددة لأنسجة بحيث يمكن تصوير مواقعها ومصير.

وإذا كانت البيئة لتحقيق الإلكترون تدور هي غير متجانسة مكانيا، الطيف EPR هو مجموع مساهمات من جميع المواقع. التصوير الطيفي المكانية يقسم حجم العينة إلى مجموعة واسعة من قطاعات المكانية الصغيرة ويحسب الطيف EPR لكل من هذه القطاعات 17. وهذا يسمح رسم الخرائط من البيئة المحلية عن طريق قياس التباين المكاني في الطيف الثوري. تستخدم تدرجات المجال المغناطيسي لترميز المعلومات المكانية إلى أطياف الثوري، والتي تسمى التوقعات. وأعيد بناؤها على صورة طيفية المكاني من هذه التوقعات 18،19.

في RS-الثوري يتم مسح المجال المغناطيسي من خلال الرنين في الوقت الذي هو قصيرة بالنسبة إلى الأوقات الإلكترون تدور الاسترخاء (الشكل 2) 20،21. د econvolution للإشارة المسح السريع يعطي طيف الامتصاص، وهو ما يعادل تكامل الأول من الطيف CW أولا المشتقة التقليدية. تم الكشف عن إشارة المسح السريع في التربيع، بحيث يتم قياس كل من مكونات الامتصاص وتشتت استجابة النظام زيادة ونقصان. هذا هو جمع أساسا ضعف كمية البيانات في وحدة الزمن. تشبع إشارة في تجربة المسح الضوئي السريع يحدث في القوى أعلى من الأسلحة الكيميائية، بحيث يمكن استخدام أعلى السلطات دون القلق من التشبع. 20،22 العديد من المزيد من المتوسطات يمكن القيام به في وحدة الزمن بالمقارنة مع الأسلحة الكيميائية. ارتفاع القوة، والكشف عن التربيع المباشر والمزيد من المتوسطات في وحدة الزمن تجتمع لتعطي المسح الضوئي السريع أفضل إشارة إلى نسبة الضوضاء (SNR)، وخاصة في التوقعات التدرج العالية التي تحدد الفصل المكاني، مما يؤدي إلى صور ذات جودة أعلى. ولتحقيق حول نفس SNR لصورة شبح المطلوبة حوالي 10 مرات طالما لCW بالنسبة للمسح السريع 23.

خيمة "> وزيادة SNR يسمح أيضا تجارب على 250 ميغاهرتز مع انخفاض تركيز تدور adducts فخ التي شكلتها رد فعل OH مع 5 ثالثي butoxycarbonyl-5-ميثيل-1-pyrroline- -oxide N (BMPO-OH) الذي سيكون غير مرئية للطريقة CW 24. Dinitroxides على اتصال مع رابط ثاني كبريتيد لديهم حساسية للانشقاق من الجلوتاثيون، وهكذا يمكن أن يقدم تقريرا عن حالة الأكسدة الخلوية. وجود التوازن، تعتمد على تركيز الجلوتاثيون الحاضر، بين أشكال عرق وأحادية جذري. ملاحظة هذه التغييرات تتطلب القبض على 5 طن متري بأكمله واسعة، ويمكن أن يتحقق بشكل أسرع بكثير مع المسح الضوئي السريع الثوري مقارنة يخطو الحقل المغناطيسي للأرض في تجربة الأسلحة الكيميائية.

ويتكون نظام المسح الضوئي السريع كاملة من أربعة أجزاء: مطياف، المغناطيس الملعب الرئيسي، والسريع سائق لفائف المسح الضوئي، والمسح الضوئي السريع عبر حلقة مرنان. مطياف وظيفة المغناطيس المجال الرئيسية هي نفسها كما في تجربة الأسلحة الكيماوية، وتحديد مجال زيمان الرئيسيوجمع البيانات من مرنان. سائق لفائف المسح السريع يولد الفحص الحالية الجيبية أن يذهب إلى المصممة خصيصا لفائف المسح الضوئي السريع على الفحص السريع عبر حلقة مرنان. لفائف المسح الضوئي السريع على السريع المسح مرنان عبر حلقة تولد حقل مغناطيسي متجانس واسع، والتي اجتاحت في الترددات بين 3 و 15 كيلو هرتز.

Protocol

1. إعداد برنامج تشغيل السريع المسح الضوئي لفائف في 250 ميغاهيرتز

  1. حساب رابيد مسح الظروف التجريبية
    ملاحظة: المعلمة الأكثر أهمية في RS-الثوري هو معدل المسح، α، الذي هو نتاج تردد المسح الضوئي والعرض الضوئي (المعادلة 3). لبعرض مسح الضيقة، وتستخدم معدلات أسرع المسح الضوئي، وبعرض تمشيط واسعة، وتستخدم أبطأ معدلات المسح الضوئي. التعليمات التالية خطوة من خلال هذه القضية الأخيرة وتظهر كيفية التوصل إلى المعلمات سائق لفائف التجريبية من 7 طن متري عرض الاجتياح و 6.8 كيلو هرتز تردد المسح الضوئي.
    1. تحديد عرض النطاق الترددي مرنان (BW احتياط).
      figure-protocol-816 (1)
      حيث الخامس الدقة هي تردد التشغيل من مرنان وس هو عامل الجودة. س = 90، من الشائع للمرنان المسح السريع استخدامها للحصول على البيانات في ممثل النتائج.
    2. تحديد معدل المسح السريع، α، كلالمستحقة على عرض النطاق الترددي مرنان figure-protocol-1198 (2)
      figure-protocol-1276

      حيث N هو ثابت في كثير من الأحيان اختيار متحفظ أن تكون 5-6، ΔB ص هو linewidth مشتق من الذروة إلى الذروة في جبل، وهو معدل المسح إذا T / ق لlinewidth Lorentzian.
      ملاحظة: قيمة مشتركة لالمتطرفين في قسم التمثيلي figure-protocol-1607 = 0.1 طن متري. في مقارنة مع السابق السريع الأدب المسح الضوئي. مشتق المعادلة 2 عن طريق تحديد عرض النطاق الترددي إشارة (BW سيج) يساوي BW الدقة.
    3. تحديد الحد الأقصى لسرعة المسح الضوئي تردد يسمح به معدل.
      figure-protocol-1951 (3)
      figure-protocol-2029
      حيث ث هو عرض من هيئة السلع التموينيةن و f هو تردد المسح الضوئي. وهناك عرض اكتساح 7 طن متري تغطي 100٪ من الطيف للتحقيقات الحالية المستخدمة في الجسم الحي. استخدم هذه القيمة والمعدل المحسوب في (المعادلة 2) لتحديد تردد المسح الضوئي.
      figure-protocol-2365
  2. اختيار من المكثفات ضبط وضبط سائق لفائف المسح السريع
    ملاحظة: برنامج تشغيل ملف المسح الضوئي السريع هو عادة تشغيل في وضع صدى توليد موجة جيبية. يحدث صدى على تردد المسح حيث reactances الاستقرائي وبالسعة فهي ذات حجم والمعاكس علامات المساواة، بحيث الكلي مفاعلة هي قريبة من الصفر.
    1. تحديد السعة المناسبة للتردد محدد في 1.1.3 باستخدام الحث، L، لفائف المسح السريع و(المعادلة 4).
      figure-protocol-2987
      figure-protocol-3060
    2. تقسيم C TOT من (المعادلة 4) في نصف للحصول على القيم مكثف لكل جانب من مربع مكثف سائق لفائف.
      figure-protocol-3285
      figure-protocol-3358
      ملاحظة: سائق لفائف المسح السريع واثنين من مكبرات الصوت. عند اختيار مكثف، يحتاج مربع مكثف لتكون متوازنة مع السعة متساوية على كل جانب من منطقة الجزاء. ويجري الجانبان في السلسلة.
    3. فك الغطاء العلوي من مربع مكثف وإدراج المكثفات على كلا الجانبين التي تساوي القيمة المحددة في الخطوة 1.2.2.
    4. استبدال الجزء العلوي من مربع مكثف والمسمار عليه لضمان أن يبقى.
    5. باستخدام اللوحة الأمامية للسائق لفائف صدى، وضبط وتيرة الانتاج حتى الموجي الجيبية ديه الحد الأقصى للسعة.

2. إعداد الكواشف والخيالات

  1. إعداد راضيتراخيص وصول العملاء
    1. إزالة 15 N-PDT من الفريزر وتسمح للحاوية قادمة إلى درجة حرارة الغرفة (10-15 دقيقة).
    2. تزن من 1،4 ملغ من 15 N-PDT باستخدام الميزان التحليلي.
    3. إضافة 1.4 ملغ من 15 N-PDT إلى 15 مل غير المتأينة (DI) H 2 O لتركيز النهائي من 0.5 ملم.
      ملاحظة: 4 أوكسو 2،2،6،6-رباعي (2 H 3) الميثيل-1- (3،3،5،5- 2 H 4، 1- 15 N) piperdinyloxyl (15 N-PDT)، 4- 1 H-3-الكربامويل-2،2،5،5-رباعي (2 H 3) الميثيل-3-pyrrolinyloxyl (15 N-mHCTPO) و 3-كربوكسي-2،2،5،5-رباعي (2 H 3) ميثيل 1- (3،4،4- 2 H 3، 1- 15 N) pyrrolidinyloxy (15 N-Proxyl) 25 (الشكل 1E-G) الجذور لها الاستقرار على المدى الطويل (2 سنة) في محلول مائي و بدرجة حرارة الغرفة. عادة يتم تخزين بأشكال صلبة في الفريزر أو الثلاجة للحفاظ على هذه الجذور مستقرة لسنوات.استقرار المتطرفين nitroxide عموما جعلها غير سامة، ويمكن أن يتم إعدادها على الفوق طبيعي عندما المذيب هو الماء. عند استخدام المذيبات العضوية، وإعداد الحلول nitroxide داخل غطاء الدخان في حين تجهيزه مع معدات الوقاية الشخصية المناسبة (PPE).
  2. إعداد درجة الحموضة حساسة المتطرفين trityl
    1. تزن من 0،7 ملغ من triaryl الميثيل الراديكالي (ATAM 4) 26 الراديكالي (1400 جم / مول) وتذوب في 200 ميكرولتر من الايثانول المطلق.
    2. تزن 0.00681 غرام من KH 2 PO 4 (136.1 جم / مول) وتذوب في 50 مل من الماء DI لتركيز النهائي من 1 ملم.
    3. تزن 2.8 غرام من KOH (56 جم / مول) وتذوب في 50 مل من الماء DI لتركيز النهائي من 1 م.
    4. إضافة KOH قطرة من الحكمة أن المخزن المؤقت الفوسفات (2.2.2) لضبط درجة الحموضة من 7.0.
    5. إضافة 800 ميكرولتر من العازلة الفوسفات 1 ملم وال 200 ميكرولتر من ATAM 4 في الايثانول المطلق لاضرب النهائيentration من 0.5 ملي في 80:20 عازلة: الإيثانول.
    6. كرر الخطوات من 2.2.1-2.2.5 لإنشاء 4 عينة ATAM في الرقم الهيدروجيني = 7.2.
    7. وضع ATAM 4، ودرجة الحموضة = 7.0 و ATAM 4، ودرجة الحموضة = 7.2 إلى 6 ملم أنابيب العينات الكوارتز منفصلة.
    8. وضع كل من 6 ملم أنابيب الكوارتز الثوري إلى 16 ملم أنبوب الكوارتز الثوري، مع 2 مم هل الستايروفوم سميكة بينهما.
      ملاحظة: جدران أنبوب عينة الكوارتز هي 0.5 مم، وبالإضافة إلى فاصل 2 مم تسفر عن فصل 3 مم بين العينات ATAM. تم توليفها درجة الحموضة المتطرفين trityl الحساسة المستخدمة في جامعة ولاية أوهايو 26. ويطلق على سبيل المثال الذي تم استخدامه للتصوير ATAM 4. ويظهر رد الفعل الذي يشكل حساسية درجة الحموضة في الشكل 1A.
  3. جيل من BMPO-OH
    1. تزن من 680 ملغ من KH 2 PO 4 وتذوب في 100 مل من الماء DI لتركيز النهائي من 50 ملم.
    2. إضافة 1 M KOH قطرة من الحكمةإلى المخزن المؤقت الفوسفات لدرجة الحموضة = 7.3.
    3. تزن من 50 ملغ من BMPO (199.25 جم / مول).
    4. الجمع بين 50 ملغ من BMPO مع 5 مل من العازلة الفوسفات في 16 ملم أنبوب الكوارتز إشعاع.
    5. إضافة 100 ميكرولتر من 300 ملي بيروكسيد الهيدروجين.
    6. أشرق الخليط في 16 ملم أنبوب الكوارتز التشعيع مع الضغط 450 مصباح الأشعة فوق البنفسجية W متوسطة لمدة 5 دقائق.
    7. باستخدام الماصة نقل الزجاج، ونقل 2.5 مل من المشع حل BMPO-OH من أنبوب الكوارتز التشعيع وإلى جانب واحد من 16 مم أنبوب عينة الكوارتز مع 3 مم المفرق.
    8. نقل 2.5 مل المتبقية من المشع BMPO-OH في الجانب الآخر من 16 مم أنبوب عينة الكوارتز مع 3 مم المفرق.
  4. إعداد dinitroxide جذرية
    1. تزن من 24.7 ملغ من 2 H، dinitroxide 15 N-ثاني كبريتيد (الشكل 1C) في 1 مل DMSO عن حل الأسهم من 47.5 ملم.
    2. إعداد 10 العازلة ملي تريس وضبط درجة الحموضة إلى 7.2.
    3. خذ 40ميكرولتر dinitroxide حل الأوراق المالية وتمييع مع العازلة تريس إلى تركيز النهائي من 1 ملم.
    4. وضع 250 ميكرولتر من حل dinitroxide في المخزن في 16 مم أنبوب عينة الكوارتز مع المفرق 10 مم في المركز.
    5. تزن من 154 ملغ من الجلوتاثيون وإضافة إلى 5 مل من العازلة تريس لتركيز النهائي من 100 ملم.
    6. إضافة 5 ميكرولتر من حل 100 ملي الجلوتاثيون إلى 250 ميكرولتر من 1 ملم حل dinitroxide على جانب واحد من المفرق 10 ملم لتحويل diradical إلى monoradical.
  5. إعداد nitroxide nitronyl
    1. إزالة جذرية من الفريزر وتسمح للحاوية قادمة إلى درجة حرارة الغرفة (10-15 دقيقة).
    2. تزن من 1،9 ملغ من nitronyl (390 جم / مول).
    3. وزن من 0.56 ملغ من كوه وتذوب في 10 مل من الماء DI لتركيز النهائي من 1 ملم.
    4. خلط 1،9 ملغ من nitronyl إلى 10 مل من 1 ملم حل KOH لتركيز النهائي من 0.5 ملي nitronyl.
      ملاحظة: إذا necessآرى، استخدم vortexer أو sonicator إلى سرعة اذابة من nitronyl.

3. إعداد الصك السريع المسح في 250 ميغاهيرتز

ملاحظة: ضبط للمرنان مع عينة المائية من nitroxide المتطرفة، والتي لها تأثير مماثل على سؤال مرنان وضبط كحل العازلة، هو وسيلة جيدة لانشاء لعينة للتصوير

  1. ضبط مرنان مع عينة المائية من nitroxide جذري.
    1. إدراج 15 مل من 0.5 ملي 15 N-PDT في عينة المياه إلى 16 ملم أنبوب الكوارتز الثوري.
    2. إدراج أنبوب الكوارتز إلى جانب الكشف عن عبر حلقة RS-الثوري مرنان.
    3. تغيير تردد من مصدر الصك حتى يطابق تردد من جانب الكشف الذي يحتوي على العينة. يدويا تغيير تردد الناقل من مصدر 250 ميغاهيرتز عن طريق إدخال القيمة المطلوبة في مجال البرمجيات.
    4. تغيير التردد من جانب الإثارة لتتناسب مع frequen بعضكاالت مصدر التجربة والجانب الكشف عن مرنان. تغيير التردد من جانب الإثارة عن طريق تحويل مكثف متغير داخل تجويف مرنان وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  2. انشاء وحدة التحكم صك ومغناطيس الرئيسية
    1. بدوره على مطياف واختيار تجربة الذي يسجل بيانات عابرة مع الوقت على الإحداثي السيني.
    2. ضمن البرنامج، تعيين عدد من النقاط إلى 65،536 وقاعدة الوقت إلى 10 نانو ثانية
    3. تعيين عدد من المتوسطات إلى 10000 للإشارة قوية أو الضيقة، وإلى 45000 للإشارة واسعة أو ضعيفة.
    4. اضغط على زر "المشاركة" في برنامج لإرسال المعلمات التجريبية من البرنامج إلى وحدة التحكم وتنشيط المغناطيس الملعب الرئيسي.
    5. تعيين الحقل المغناطيسي الرئيسي إلى 9 طن متري.
    6. تعيين مقبض توهين قوة إلى 50 ديسيبل، وتشغيل 7 W مكبر للصوت عالية الطاقة.

4. تنفيذمن رابيد المسح تجربة

ملاحظة: تعليمات محددة تتصل تحليل الخيالات التي تحتوي على BMPO-OH 24، وتقدم درجة الحموضة حساسة المتطرفين TAM 19،27 والأكسدة dinitroxides حساسة 28 في الأدب.

  1. التشبع قوة عينة nitroxide القياسية
    ملاحظة: من المفيد للقيام منحنى التشبع السلطة على عينة جذرية nitroxide القياسية في ظل الظروف التجريبية نفسها التي سيتم استخدامها للبحث في الجذور الحساسة لدرجة الحموضة أو وضع الأكسدة.
    1. بدوره على سائق لفائف المسح السريع، مع القيم من القسم 1 (تردد المسح من 6.8 كيلو هرتز والعرض الضوئي من 7 طن متري).
    2. ابتداء من الساعة 50 ديسيبل، جمع طائفة المسح السريع مع 100K المتوسط. انخفاض توهين بنسبة 3 ديسيبل وتكرار القياس. تستمر حتى بيئة المخفف من 0 ديسيبل، أو لفترة طويلة مثل قياس العزلة على قراءات الجسر <0.
    3. نقل ركان الخام بيانات المسح السريع إلى برنامج deconvolution (على سبيل المثال كتب في Matlab) ومعالجة البيانات الخام إلى طيف الامتصاص.
    4. إدخال تردد المسح الضوئي، عرض الاجتياح، عدد من النقاط وtimebase في البرنامج، وتشغيل البرنامج لمعالجة الخام السريع إشارة المسح الضوئي إلى إشارة الاستيعاب.
    5. رسم اتساع إشارة امتصاص بوصفها وظيفة من قوة مربع الجذر (في وات) الواقعة على مرنان. في غير تشبع النظام، واتساع تعتمد خطيا على الجذر التربيعي لقوة الحادث.
    6. تناسب خط الاتجاه ابتداء من الساعة 0،0 وتشمل جميع نقاط البيانات التي تقع في المنطقة استجابة الخطية. في المنطقة استجابة الخطية، وزيادة السعة إشارة يتناسب مع الجذر التربيعي للطاقة الميكروويف.
    7. استقراء هذا الاتجاه لأعلى السلطات، والمقارنة بين شدة إشارة الثوري. استخدام أعلى سلطة التي السعة إشارة لا تنحرف أكثر من 3٪ من خط الاتجاه استقراء. في أورديص لdeconvolution للإشارة المسح السريع للعمل بشكل صحيح، يجب أن يكون لا يزال الإشارة في المنطقة استجابة خطية فيما يتعلق قوة الحادث.
      ملاحظة: نقل البيانات المسح السريع الخام يمكن أن يتم عبر اتصال شبكة أو عبر محرك الإبهام. في هذه الحالة نقل ضروري لأن برنامج لمعالجة البيانات الخام (ماتلاب) ليست على نفس الكمبيوتر التي لديها برامج جمع البيانات. ووصف خوارزمية deconvolution الذي يعالج البيانات الخام في 29.

النتائج

نتاج التجربة عبارة عن مجموعة من التوقعات التي يتم بناؤها إلى صور ثنائية الأبعاد (الطيفية واحد والمكانية واحد) مع مقياس اللون كاذبة لتمثيل إشارة السعة. أزرق يدل على الأساس حيث لا توجد إشارة موجودة، الأخضر هو منخفضة السعة والأحمر هو أعلى. شرائح على طو?...

Discussion

إشارات السريع المسح على مكونات تردد أعلى من الأسلحة الكيميائية، وتتطلب عرض النطاق الترددي مرنان أكبر اعتمادا على linewidths اوقات الاسترخاء، وسرعة للمسح السريع. ويستند عرض النطاق الترددي اللازم لتجربة معينة على linewidth ومعدل المسح المجال المغناطيسي (المعادلة 2). تبعا لاوق?...

Disclosures

We have nothing to disclose.

Acknowledgements

دعم جزئي لهذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح NIBIB EB002807 وCA177744 (GRE وSSE) وEB002034 P41 إلى GRE، هوارد J. هالبيرن، PI، وجامعة دنفر ما قدمه من مساعدة. وأيد علامة Tseytlin من المعاهد الوطنية للصحة R21 EB022775، NIH K25 EB016040، المعاهد الوطنية للصحة / NIGMS U54GM104942. الكتاب ممتنون لفاليري Khramtsov، والآن في جامعة غرب فرجينيا، وIllirian Dhimitruka في جامعة ولاية أوهايو لتوليف درجة الحموضة المتطرفين TAM الحساسة، وجيرالد روزين وجوزيف كاو في جامعة ميريلاند لتوليف وmHCTPO ، proxyl، BMPO والمتطرفين nitronyl.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
4-oxo-2,2,6,6-tetra(2H3)methyl-1-(3,3,5,5-2H4,1-15N)piperdinyloxyl (15N-PDT)CDN Isotopes M-232798% atom 15N, 98 % atom D, Quebec Canada
4-1H-3-carbamoyl-2,2,5,5-tetra(2H3)methyl-3-pyrrolinyloxyl (15N-mHCTPO)N/AN/ASynthesized at U. Maryland and described in Reference 29
3-carboxy-2,2,5,5-tetra(2H3)methyl-1-(3,4,4-2H3,1-15N)pyrrolidinyloxyl (15N-Proxyl)N/AN/ASynthesized at U. Maryland and described in Reference 25
4 mm Quartz EPR TubesWilmad Glass707-SQ-100M
4-oxo-2,2,6,6-tetra(2H3)methyl-1-(3,3,5,5-2H4)piperdinyloxyl (14N-PDT)CDN IsotopesD-232898% atom D, Quebec Canada
pH sensitive trityl radical (aTAM4)Ohio State UniversityN/ASynthesized at Ohio State University and described in Reference 26
Potassum Phosphate, MonobasicJ.T. Baker Chemicals1-3246
6 mm Quartz EPR TubesWilmad GlassQ-5M-6M-0-250/RB
8 mm Quartz EPR TubesWilmad GlassQ-7M-8M-0-250/RB
5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide (BMPO)N/AN/ASynthesized at U. Maryland and described in Reference 30
Hydrogen PeroxideSigma AldrichH1009 SIGMA30%
16 mm Quartz EPR tubeWilmad Glass16-7PP-11QTZ
Medium Pressure 450 W UV lampHanovia679-A36Fairfield, NJ
L-Glutathione, reducedSigma AldrichG470-5
NitronylNAN/ASynthesized at U. Maryland and described in Reference 31
Sodium Hydroxide J.T. Baker Chemicals1-3146

References

  1. Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magn. Reson. Med. 67 (6), 1827-1836 (2012).
  2. Utsumi, H., et al. Simultaneous molecular imaging of redox reactions monitored by overhauser-enhanced MRI with 14N-and 15N-labeled nitroxyl radicals. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1463-1468 (2006).
  3. Khramtsov, V. V., Grigor'ev, I. A., Foster, M. A., Lurie, D. J., Nicholson, I. Biological applications of spin pH probes. Cell. Mol. Bio. 46 (8), 1361-1374 (2000).
  4. Halpern, H. J., et al. Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic Resonance. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 91 (26), 13047-13051 (1994).
  5. Matsumoto, S., et al. Low-field paramagnetic resonance imaging of tumor oxygenation and glycolytic activity in mice. J. Clin. Invest. 118 (5), 1965-1973 (2008).
  6. Velan, S. S., Spencer, R. G. S., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Electron paramagnetic resonance oxygen mapping (EPROM): Direct visualization of oxygen concentration in tissue. Magn. Reson. Med. 43 (6), 804-809 (2000).
  7. Elas, M., et al. Electron paramagnetic resonance oxygen image hypoxic fraction plus radiation dose strongly correlates with tumor cure in FSA fibrosarcomas. Int. J. Radiat. Oncol. 71 (2), 542-549 (2008).
  8. Dreher, M. R., et al. Nitroxide conjugate of a thermally responsive elastin-like polypeptide for noninvasive thermometry. Med. Phys. 31 (10), 2755-2762 (2004).
  9. Gallez, B., Mader, K., Swartz, H. M. Noninvasive measurement of the pH inside the gut by using pH-sensitive nitroxides. An in vivo EPR study. Magn. Reson. Med. 36 (5), 694-697 (1996).
  10. Halpern, H. J., et al. Diminished aqueous microviscosity of tumors in murine models measured with in vivo radiofrequency electron paramagnetic resonance. Cancer Res. 59 (22), 5836-5841 (1999).
  11. Elas, M., Ichikawa, K., Halpern, H. J. Oxidative Stress Imaging in Live Animals with Techniques Based on Electron Paramagnetic Resonance. Radiat. Res. 177 (4), 514-523 (2012).
  12. Kuppusamy, P., et al. Noninvasive imaging of tumor redox status and its modification by tissue glutathione levels. Cancer Res. 62 (1), 307-312 (2002).
  13. Khramtsov, V. V., Yelinova, V. I., Glazachev, Y. I., Reznikov, V. A., Zimmer, G. Quantitative determination and reversible modification of thiols using imidazolidine biradical disulfide label. J. Biochem. Biophys. Methods. 35 (2), 115-128 (1997).
  14. Plonka, P. M. Electron paramagnetic resonance as a unique tool or skin and hair research. Exp. Dermatol. 18, 472-484 (2009).
  15. Halevy, R., Shtirberg, L., Shklyar, M., Blank, A. Electron Spin Resonance Micro-Imaging of Live Species for Oxygen Mapping. J. Vis. Exp. (42), e122 (2010).
  16. Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. Microimaging of oxygen concentration near live photosynthetic cells by electron spin resonance. Biophys J. 99 (3), 971-978 (2010).
  17. Eaton, G. R., Eaton, S. S. . Concepts Magn. Reson. 7, 49-67 (1995).
  18. Maltempo, M. M. Differentiaon of spectral and spatial components in EPR imaging using 2-D image reconstruction algorithms. J. Magn. Reson. 69, 156-161 (1986).
  19. Tseitlin, M., et al. New spectral-spatial imaging algorithm for full EPR spectra of multiline nitroxides and pH sensitive trityl radicals. J. Magn. Reson. 245, 150-155 (2014).
  20. Mitchell, D. G., Radu, N., Koch, S., et al. . Abstracts of Papers of the American Chemical Society. 242, (2011).
  21. Stoner, J. W., et al. Direct-detected rapid-scan EPR at 250 MHz. J. Magn. Reson. 170 (1), 127-135 (2004).
  22. Tseytlin, M., Biller, J. R., Mitchell, D. G., Yu, Z., Quine, R. W., Rinard, G. A., Eaton, S. S., Eaton, G. R. . EPR Newsletter. 23, 8-9 (2014).
  23. Biller, J. R., et al. Imaging of nitroxides at 250 MHz using rapid-scan electron paramagnetic resonance. J. Magn. Reson. 242, 162-168 (2014).
  24. Biller, J. R., et al. Improved Sensitivity for Imaging Spin Trapped Hydroxyl Radical at 250 MHz. Chem. Phys. Chem. 16 (3), 528-531 (2015).
  25. Burks, S. R., Bakhshai, M. A., Makowsky, M. A., Muralidharan, S., Tsai, P., Rosen, G. M., Kao, J. Y. 2H, 15N-Substituted nitroxides as sensitive probes for electron paramagnetic resonance imaging. J. Org. Chem. 75, 6463-6467 (2010).
  26. Dhimitruka, I., Bobko, A. A., Hadad, C. M., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Synthesis and characterization of amino derivatives of persistent trityl radicals as dual function pH and oxygen paramagnetic probes. J. Am. Chem. Soc. 130 (32), 10780-10787 (2008).
  27. Elajaili, H. B., et al. Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals. Magn. Reson. Chem. 53 (4), 280-284 (2015).
  28. Elajaili, H., Biller, J. R., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y., Tseytlin, M., Buchanan, L. B., Rinard, G. A., Quine, R. W., McPeak, J., Shi, Y., Eaton, S. S., Eaton, G. R. Imaging Disulfides at 250 MHz to Monitor Redox. J. Magn. Reson. , (2015).
  29. Tseitlin, M., Rinard, G. A., Quine, R. W., Eaton, S. S., Eaton, G. R. Deconvolution of sinusoidal rapid EPR scans. J. Magn. Reson. 208 (2), 279-283 (2011).
  30. Halpern, H. J., Peric, M., Nguyen, T. D., Spencer, D. P., Teicher, B. A., Lin, Y. J., Bowman, M. K. Selective isotopic labeling of a nitroxide spin label to enhance sensitivity for T2 oxymetry. J. Magn. Reson. 90, 40-51 (1990).
  31. Tsai, P., et al. Esters of 5-carboxyl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide: A family of spin traps for superoxide. J. Org. Chem. 68 (20), 7811-7817 (2003).
  32. Biller, J. R., et al. Frequency dependence of electron spin relaxation times in aqueous solution for a nitronyl nitroxide radical and perdeuterated-tempone between 250 MHz and 34 GHz. J. Magn. Reson. 225, 52-57 (2012).
  33. Rosen, G. M., et al. Dendrimeric-containing nitronyl nitroxides as spin traps for nitric oxide: Ssynthesis, kinetic, and stability studies. Macromolecules. 36 (4), 1021-1027 (2003).
  34. Bobko, A. A., et al. Redox-sensitive mechanism of no scavenging by nitronyl nitroxides. Free Radical Biol. Med. 36 (2), 248-258 (2004).
  35. Roshchupkina, G. I., et al. In vivo EPR measurement of glutathione in tumor-bearing mice using improved disulfide biradical. Free Radical Bio. Med. 45 (3), 312-320 (2008).
  36. Mitchell, D. G., et al. Use of Rapid-Scan EPR to Improve Detection Sensitivity for Spin-Trapped Radicals. Biophysical Journal. 105 (2), 338-342 (2013).
  37. Bobko, A. A., Dhimitruka, I., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Trityl radicals as persistent dual function pH and oxygen probes for in vivo electron paramagnetic resonance spectroscopy and imaging: Concept and experiment. J. Am. Chem. Soc. 129 (23), (2007).
  38. Biller, J. R., et al. Electron spin-lattice relaxation mechanisms of rapidly-tumbling nitroxide radicals. J. Magn. Reson. 236, 47-56 (2013).
  39. Redler, G., Barth, E. D., Bauer, K. S., Kao, J. P. Y., Rosen, G. M., Halpern, H. J. In vivo electron paramagnetic resonance imaging of differential tumor targeting using cis-3,4-di(acetoxymethoxycarbonyl)-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxyl. Magn. Reson. Med. 71 (4), 1650-1656 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

115 nitroxide 250

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved