الجينوم التحرير في<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; استخدام النسخ المنشط مثل المستجيب Nucleases (TALENs)

Summary

الطفرات التي تستهدف الجين هو ممكن الآن في مجموعة واسعة من الكائنات الحية باستخدام تقنيات التحرير الجينوم. هنا، علينا أن نظهر بروتوكول لالطفرات الجينية المستهدفة باستخدام النسخ المنشط مثل nucleases المستجيب (TALENs) في Astyanax mexicanus، وهي من الأنواع من الأسماك التي تشمل الأسماك السطحية وcavefish.

Abstract

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Introduction

فهم الأساس الجيني للتطور سمة هو هدف البحث النقدي من علماء البيولوجيا التطورية. وقد تم إحراز تقدم كبير في تحديد مواضع الكامنة وراء تطور الصفات وإبراز الجينات المرشحة ضمن هذه المكاني (على سبيل المثال ^1-3). ومع ذلك، وظيفيا اختبار دور هذه الجينات قد ظلت تتحدى العديد من الكائنات الحية تستخدم لدراسة تطور الصفات ليست حاليا لين العريكة وراثيا. ظهور تقنيات التحرير الجينوم ازداد الى حد كبير manipulability الجيني للمجموعة واسعة من الكائنات الحية. وقد استخدمت النسخ nucleases مثل المنشط المستجيب (TALENs) وتتجمع interspaced بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (CRISPRs) لتوليد الطفرات المستهدفة في الجينات في عدد من الكائنات الحية (على سبيل المثال ^4-11). هذه الأدوات، وتطبيقها على نظام ذات الصلة تطويريا، لديها القدرة على إحداث ثورة في طريقة البيولوجيا التطورية الدراسة الأساس الجيني للتطور.

Astyanax mexicanus هي نوع من الأسماك التي توجد في شكلين: أ (الأسماك السطحية) شكل السطح التي تعيش في النهر ومتعددة الأشكال التي تعيش في كهف (cavefish) أ. mexicanus cavefish تطورت من أسلاف الأسماك السطحية (استعرضت في ^12). وقد تطورت سكان cavefish في عدد من الصفات بما في ذلك فقدان العينين، وانخفاض أو فقدان تصبغ، وأعداد متزايدة من براعم الذوق وneuromasts الجمجمة، وتغييرات في السلوك مثل فقدان السلوك المدرسي، وزيادة العدوان، والتغيرات في تغذية الموقف وفرط الأكل ^{13 -19.} Cavefish والأسماك السطحية interfertile، وقد أجريت تجارب رسم الخرائط الوراثية لتحديد الجينات مواضع والمرشح لصفات كهف ^1،20-26. وقد تم اختبار بعض الجينات المرشحة لدور وظيفي في المساهمة في الصفات كهف في ثقافة الخلية ^1،19، في الكائنات نموذج من الأنواع الأخرى ²¹ أو overexpression ²⁷ أو ضربة قاضية عابرة شالغناء morpholinos ²⁸ في A. mexicanus. ومع ذلك، كل من هذه الأساليب له حدود. القدرة على توليد أليل متحولة من هذه الجينات في A. mexicanus أمر بالغ الأهمية لفهم وظيفتها في تطور cavefish. وهكذا، A. mexicanus هو كائن حي المرشح المثالي لتطبيق تكنولوجيات تحرير الجينوم.

نحن هنا الخطوط العريضة لطريقة لتحرير الجينوم في A. mexicanus باستخدام TALENs. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم فسيفساء حقن الأسماك مؤسس للالظواهر ولعزل خطوط السمك مع الطفرات مستقرة في الجينات التي تهم ^29.

Protocol

وكانت جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة وتمت الموافقة من قبل لجنة الحيوان الرعاية المؤسسية واستخدم في جامعة ولاية ايوا وجامعة ميريلاند.

1. TALEN التصميم

1. المدخلات المطلوبة تسلسل الهدف لتصميم الموقع TALEN. (على سبيل المثال: https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ). إدخال اختيار أطوال مجموعة هل / تكرار.
   1. نسخ التسلسل الجيني في المربع المسمى "تسلسل".
   2. ضمن علامة التبويب "توفير مخصص فاصل / RVD أطوال" تحديد طول الفاصل وطول المصفوفة.
      ملاحظة: أطوال فاصل من 15 زوج قاعدي وتكرار أطوال مجموعة من 15-17 تعمل بشكل جيد وجعل التجمع أقل تعقيدا.
2. اختيار زوج TALEN. TALEN أزواج يتمحور حول الفريد موقع انزيم التقييد تسمح التنميط الجيني بواسطة انزيم تقييد هضممنتج PCR.
3. الاشعال تصميم لتضخيم المنطقة المحيطة الجينومية الموقع المستهدف TALEN باستخدام موقع على شبكة الانترنت مثل Primer3 ^30-32. عندما التنميط الجيني مع انزيم التقييد، الاشعال تصميم لتضخيم منطقة تحتوي على موقع انزيم التقييد مرة واحدة فقط. فمن المستحسن أن هذه المنطقة يتم تضخيمه والتسلسل قبل البناء TALEN لتحديد أي الأشكال الموجودة في A. mexicanus السكان المختبر لاستخدامها ل microinjection.

2. الجمعية TALEN (معدلة من بروتوكول TALEN كيت) ^33،34

للحصول على تفاصيل إضافية واستكشاف الأخطاء وإصلاحها، انظر البروتوكول ^34.

1. إعداد وتسلسل البلازميدات اللازمة من عدة TALEN وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
2. إعداد # 1 ردود الفعل لردود الفعل ألف وباء وتشمل تكرار-متغير diresidues (RVDs) 1-10 وpFUS_A ناقلات جهة في رد الفعل A. تشمل RVDs 11- (N-1) وعشرناقلات ه جهة pFUS_B (N-1) في رد الفعل B حيث N هو العدد الإجمالي للRVDs في TALEN.
   1. إضافة إلى كل رد فعل: 1 ميكرولتر من كل تحتوي على البلازميد كل RVD (100 نانوغرام / ميكرولتر)، وناقلات الوجهة (100 نانوغرام / ميكرولتر)، 1 ميكرولتر بسه أنا انزيم التقييد، 1 ميكرولتر الأبقار مصل الزلال (BSA) (2 ملغ / مل )، 1 ميكرولتر يغاز، 2 ميكرولتر من العازلة 10X يغاز و x ميكرولتر من الماء لحجم ما مجموعه 20 ميكرولتر. على سبيل المثال، انظر الجدول 1.
      ملاحظة: يمكن أيضا ردود فعل نصف استخدامها.
   2. وضع ردود الفعل في thermocycler وتشغيل دورة: 10X (37 ° C / 5 دقائق + 16 ° C / 10 دقيقة) + 50 ° C / 5 دقائق + 80 ° C / 5 دقائق.
3. احتضان ردود الفعل مع نوكلياز. إلى كل رد فعل إضافة 1 ميكرولتر 25 ملي ATP و 1 ميكرولتر نوكلياز. احتضان ردود الفعل عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
4. تحويل ردود الفعل.
   1. تحويل 2.5 ميكرولتر من كل التفاعل إلى 25 ميكرولتر كيميائيا الخلايا المختصة.
      ملاحظة: محلية الصنع ج المختصةملتعلمي اللغة اإلنكليزية يمكن استخدامها. ومع ذلك، يمكن خلايا بكفاءة منخفضة يؤدي إلى عدم وجود المستعمرات.
      1. مزيج 2.5 ميكرولتر من رد الفعل مع 25 ميكرولتر من الخلايا المختصة كيميائيا. احتضان على الجليد لمدة خمس دقائق. احتضان الخلايا لمدة 30 ثانية في 42 درجة مئوية.
      2. وضع أنابيب على الجليد لمدة 2 دقيقة. إضافة 125 ميكرولتر من مرق سوبر الأمثل مع القمع مقيضة (SOC). هزة الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
   2. لوحة 100 ميكرولتر من الخلايا تحولت على لوحات LB مع السبيكتينوميسين (50 ميكروغرام / مل)، X-غال والآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). تنمو O / N عند 37 درجة مئوية.
5. اختيار 2-3 مستعمرات بيضاء لكل رد فعل وتحقق من مستعمرة PCR باستخدام بادئات pCR8_F1 وpCR8_R1 (الجدول 2).
   1. جعل مزيج الرئيسي من الكواشف. على سبيل المثال، انظر الجدول 3.
   2. اختيار مستعمرة وتشويه صورتها في الجزء السفلي من أنبوب PCR، ومن ثم وضع ما تبقى من مستعمرة إلى 2 مل LB مع السبيكتينوميسين(50 ميكروغرام / مل). ضع 15 ميكرولتر من مزيج الرئيسي في أنبوب مع مستعمرة.
   3. تشغيل البرنامج PCR التالية (الجدول 4)
   4. فحص PCR (تشغيل وحدة التخزين بالكامل) على هلام الاغاروز 1.5٪ من قبل الكهربائي. فإن استنساخ الصحيحة لها الفرقة في الحجم المتوقع فضلا عن تشويه وسلم من العصابات. للحصول على مثال مسحة المناسبة، انظر ^34،33.
   5. تنمو 2 مل الثقافات من الحيوانات المستنسخة الصحيحة في LB سائل الإعلام O / N عند 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز.
6. Miniprep البلازميدات وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
7. تسلسل للتحقق من تسلسل TALEN مع pCR8_F1 وpCR8_R1. اتبع الأساليب المذكورة سابقا ^(35).
8. استخدام الحيوانات المستنسخة الصحيحة التحقق من التسلسل، إعداد رد فعل # 2 (مجموعة TALEN)، والتي سوف تضع RVDs من ناقلات ألف وباء وRVD النهائي في ناقلات الوجهة.
   1. إعداد مزيج لرد فعل 2 (جدول رقم 5).
      ملاحظة: هاردود الفعل LF يمكن استخدامها.
   2. وضع ردود الفعل في thermocycler وتشغيل البرنامج التالي: 37 ° C / 10 دقيقة + 16 ° C / 15 دقيقة + 37 ° C / 15 دقيقة + 80 ° C / 5 دقائق.
9. تحويل ردود الفعل.
   1. تحويل 2.5 ميكرولتر من كل التفاعل إلى 25 ميكرولتر كيميائيا الخلايا المختصة.
      1. مزيج 2.5 ميكرولتر من رد الفعل مع 25 ميكرولتر من الخلايا المختصة كيميائيا. احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق. حرارة صدمة الخلايا لمدة 30 ثانية في 42 درجة مئوية.
      2. وضع أنابيب على الجليد. إضافة 125 ميكرولتر من شركة نفط الجنوب. وضع أنابيب في حاضنة تهتز عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
   2. لوحة 100 ميكرولتر من الخلايا تحولت على لوحات LB مع الأمبيسيلين (100 ميكروغرام / مل)، X-غال وIPTG. تنمو O / N عند 37 درجة مئوية.
10. اختيار 1-3 مستعمرات بيضاء لكل رد فعل وتحقق من مستعمرة PCR باستخدام بادئات TAL_F1 وTAL_R2 (الجدول 2).
    1. جعل حل البلمرة mastermix والمياه والاشعال كماهو موضح في الجدول 3. اختيار مستعمرة وتشويه صورتها في الجزء السفلي من أنبوب PCR، ومن ثم وضع ما تبقى من مستعمرة إلى 2 مل LB مع الأمبيسيلين (100 ميكروغرام / مل). ضع 15 ميكرولتر من الحل في أنبوب مع مستعمرة.
    2. تشغيل البرنامج PCR (الجدول 6).
    3. فحص PCR على هلام الاغاروز 1.5٪ من قبل الكهربائي. فإن استنساخ الصحيحة لها رتوش وسلم من العصابات. للحصول على مثال مسحة المناسبة، انظر ^34،33.
    4. تنمو 2 مل الثقافات من الحيوانات المستنسخة الصحيحة في LB سائل الإعلام O / N عند 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز.
11. Miniprep البلازميدات وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
12. تسلسل للتحقق من تسلسل TALEN مع TAL_F1 وTAL_R2 التالية الأساليب المذكورة سابقا ^35.

3. مرنا النسخ من TALENs

1. هضم 4 ميكروغرام من القالب التحقق من التسلسل مع 2 ميكرولتر الحويصلة أنا لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية.
2. تشغيل 2 ميكرولتر من البلازميد هضمها I-ساك على هلام الاغاروز 1.5٪ من قبل الكهربائي. سوف البلازميدات التي يتم هضمها بشكل صحيح عرض شريط واحد.
3. تنقية المتبقية البلازميد هضمها I-الحويصلة بعد PCR بروتوكول عدة تنقية. يغسل مرتين مع محلول الغسيل قبل شطف. أزل إلى 30 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه.
4. اتبع بروتوكول قياسي لإنتاج T3 مرنا.
   1. إعداد ردود الفعل نصف باستخدام 0.5 ميكروغرام من قالب خطي (المعد أعلاه). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
   2. إضافة 0.5 ميكرولتر من الدناز (موجودة في الطقم)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
5. تنقية مرنا، باتباع إرشادات الشركة المصنعة. أزل إلى 30 nuclease خالية من المياه ميكرولتر.
6. تشغيل هلام الاغاروز 1.5٪ من قبل الكهربائي للتحقق من مرنا.
   1. تنظيف الجهاز هلام مع منتج للقضاء على التلوث ريبونوكلياز وإعداد جل 1.2٪.
   2. مزيج 1 مرنا ميكرولتر + 4 &# 181؛ ل nuclease خالية من الماء + 5 ميكرولتر glyoxyl تحميل صبغ. احتضان العينات عند 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة الأنابيب ومكان على الجليد قبل تشغيل هلام.
7. للتحقق من تركيز باستخدام طريقة قياس تركيز الأحماض النووية وتخزين الحمض النووي الريبي في aliquots في -80 درجة مئوية. اختر حجم قسامة مثل أن الحمض النووي الريبي لا المجمدة / إذابة أكثر من مرة.
   ملاحظة: تركيزات 500-1،000 نانوغرام / يتم الحصول عليها عادة نيكولا لانغ. RNA مع تركيز أقل ويمكن استخدام طويلة كما يتم الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي (وفقا لتقييم الفرقة بدلا من مسحة على هلام).

4. حقن Astyanax mexicanus الأجنة مع TALEN مرنا

1. إعداد أدوات للحقن.
   1. صب لوحات الحقن عن طريق سكب 1.2٪ الاغاروز في أسماك المياه (المياه مكيفة مع بيكربونات الصوديوم وملح البحر إلى 7.4 درجة الحموضة والموصلية 700 ميكرو ثانية) في طبق بتري. وضع قالب (قطعة من البلاستيك مع توقعات لجعل الآبار للأسماكالبيض) داخل الطبق. إزالة العفن عندما تصلب الاغاروز وتخزينها في 4 درجات مئوية. لمزيد من التفاصيل على القالب يرى ^36.
   2. سحب الإبر لحقن باستخدام مجتذب إبرة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      ملاحظة: مناسب طول الإبرة مهم للحقن. والإبر التي هي فترة طويلة جدا أن تكون مرنة جدا لحقن. فإن بروتوكول للإبر سحب تختلف مع المعدات المستخدمة لسحب الإبر. ويرد مثال على الإبرة المناسبة في الشكل 1. بالنسبة للمعدات لدينا، وسحب الإبر التي هي 5-6 سم في الطول، ويكون قطرها الخارجي في غيض من حوالي 0.011 مم عندما كسر. ومع ذلك، يجب أن تكون محسوبة الإبر (الخطوة 4.3.4) لتحديد عرض الافتتاح. يمكن العثور على البرنامج المثال لسحب الإبر في الجدول 7.
   3. إعداد الماصات الزجاجية لنقل الأجنة عن طريق كسر ماصة بحيث تكون الفتحة كبيرة بما يكفي لبيضة بالمرور. لهب نهاية كسر حتىلم يعد حاد.
      ملاحظة: من المهم استخدام الماصات الزجاجية والزجاج السلطانيات عند العمل مع أ. البيض mexicanus والأجنة لأنها لزجة، وستلتزم البلاستيك.
2. اجمع 1-خلية المرحلة البيض.
   1. سلالة أ. mexicanus التالية البروتوكولات القياسية ^37.
      ملاحظة: على سبيل المثال، إذا تم الحفاظ على الأسماك على 14 ضوء: دورة الظلام 10 واستخدام الوقت Zeitgerber (ZT) مع ZT0 أضواء على وZT14 كما الأنوار، لدينا تفرخ الأسماك السطحية بين ZT15 وZT19. يجب تحديد وقت التبويض بدقة لكل مختبر على حدة.
   2. تفريخ من قبل فرط السمك لمدة 3-4 أيام قبل التزاوج ووضع الأسماك في المياه العذبة. رفع درجة فهرنهايت درجة الحرارة 2. ملاحظة: لدينا درجة حرارة الماء الأولية ما يقرب من 74 درجة فهرنهايت.
   3. جمع بيض الأسماك السطحية في الظلام، والتحقق من كل 15 دقيقة للحصول على البيض في المرحلة 1 خلية. ويمكن الحصول على مئات من البيض من زوج واحد من الأسماك السطحية.
   4. جمعالبيض في أوعية زجاجية لمنع الالتصاق على السطوح البلاستيكية والفرز لعزل الأجنة في مرحلة 1 خلية قبل الحقن من خلال مراقبة البيض تحت المجهر وجمع البيض التي هي خلية واحدة. إبقاء البيض في المياه العذبة النظام (خزان المياه وتستضيف الأسماك البالغة، التي تمت معالجتها للدرجة الحموضة والموصلية).
3. حقن TALEN مرنا.
   1. ضخ كميات مختلفة من إجمالي مرنا (كميات متساوية من كل TALEN في الزوج) لتحديد تركيز الأمثل للحقن على سميتها والكفاءة تختلف من زوج TALEN. تبدأ عن طريق حقن مجموع تركيزات مرنا التي هي 400-800 ص. تمييع والجمع بين مرنا لتركيزات المطلوب لحقن 1.5 نيكولا لانغ.
   2. الحمل تضعف مرنا في الجزء الخلفي من الإبرة وإرفاق الإبرة إلى حاقن الصغرى.
   3. كسر إبرة باستخدام ملقط.
   4. معايرة الإبرة. على سبيل المثال، إخراج 10 مرات وجمع قطرة مما أدى إلى الشعيرات الدموية الصغيرة. لمدة 10 × 100 المتاح 1.081؛ ل، 32 مم الشعرية الصغيرة، ينبغي أن انخفاض ملء الشعرية الصغيرة إلى 0.5 ملم مقابل 1.5 نيكولا لانغ حقن / 1. ضبط الوقت الحقن والضغط حسب الحاجة.
   5. ادخال الإبرة في خلية واحدة وحقن مرنا. حقن مرنا مباشرة في الخلية، وليس في صفار البيض.
   6. جمع الأجنة المحقونة في أوعية زجاجية. إبقاء الأجنة في 23-25 ​​درجة مئوية. إزالة الأجنة الميتة (الأجنة التي أصبحت غائما وغير منتظمة الشكل) بانتظام خلال الأيام القليلة الأولى بعد الحقن. أعداد قياسية من الأجنة الميتة والمشوهة من سيطرة (uninjected) وألواح حقن.
      ملاحظة: زيادة تركيز مرنا يمكن أن يؤدي إلى زيادة السمية والتشوه / فاة الأجنة. وبالتالي، يجب أن تكون متوازنة سمية مقابل الكفاءة لتحديد أفضل تركيز مرنا لحقن.

5. النمط الظاهري مؤسس الأسماك وتقييم TALEN الكفاءة

1. التضحية الأجنة وفقا لبروتوكول الحيوان المؤسسي.
   ملاحظة: نحن الموت ببطءالأجنة عن طريق السريع تقشعر لها الأبدان على الجليد.
2. جمع الأجنة إلى 0.8 ميكرولتر PCR أنابيب الشريط باستخدام ماصة نقل.
   ملاحظة: لا يمكن أن يؤديها التنميط الجيني على الأجنة الفردية أو برك من الأجنة.
3. استخراج الحمض النووي.
   1. مكان الأجنة في 100 ميكرولتر 50 هيدروكسيد الصوديوم ملم (هيدروكسيد الصوديوم)، واحتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم تبرد إلى 4 درجة مئوية.
   2. إضافة 10/01 حجم ^ال (10 ميكرولتر) من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة (8).
4. إجراء PCR على المنطقة باستخدام بادئات مصممة في الخطوة 1.3 (انظر الجداول 8 و 9 لبروتوكولات العينة). لأجنة الفردية 1 ميكرولتر من الحمض النووي غير كافية للتفاعل PCR.
5. هضم المنتج PCR الناتج مع انزيم التقييد المناسب وتشغيل جل الاغاروز 1.5٪ من قبل الكهربائي.
   1. على سبيل المثال، لالتنميط الجيني موضع عيني جلدي المهق 2 (oca2) في حقن الأجنة هضم المنتج PCR باستخدام انزيم التقييد فرقة البحث وأنا بإضافة 00.5 ميكرولتر من فرقة البحث الأول مباشرة إلى 12.5 ميكرولتر من رد فعل PCR الانتهاء، يحتضنها عند 65 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. تشغيل عسر الهضم والمنتج هضمها على هلام. انزيم التقييد عصابات المقاومة (أي العصابات التي لا تهضم) تشير إلى أن الطفرات المستحثة TALEN-هي موجودة (الشكل 2).
6. (اختياري) حساب معدل الطفرات مئوية خلال تحديد نسبة مئوية من الناتج تقطيعه عن طريق تحليل الصور من المواد الهلامية في فيجي ³⁸ باستخدام أداة تحليل هلام لحساب قيمة كثافة كل فرقة كما هو موضح سابقا ^(29).
7. تحديد تسلسل من الأليلات الطافرة التي كتبها TA استنساخ هلام تنقية تقييد انزيم الفرقة متحولة مقاومة وتسلسل الحيوانات المستنسخة.
   1. هلام تنقية تقييد انزيم الفرقة متحولة مقاومة باتباع إرشادات الشركة المصنعة. استنساخ TA الفرقة باتباع إرشادات الشركة المصنعة. اختيار المستعمرات والنمو في 1.5 مل LB O / N عند 37 درجة مئوية في هزالحاضنة.
   2. الثقافات Miniprep باتباع إرشادات الشركة المصنعة. إرسال الحمض النووي لتسلسل.
   3. باستخدام برنامج مثل القرد، محاذاة متواليات متحولة إلى تسلسل wildtype.
      1. نسخ ولصق كل من متواليات إلى ملفات القرد. اختيار "محاذاة اثنين من سلاسل" أداة من قائمة "أدوات".
      2. تحديد اثنين من تسلسل الحمض النووي باستخدام القوائم المنسدلة.
         ملاحظة: تكملة العكسي للتسلسل المستنسخة قد تحتاج لاستخدامها اعتمادا على اتجاه ذهب PCR في ناقلات الاستنساخ. إذا كان تسلسل لا محاذاة، كرر الخطوات من التحقق من مربع "القس كوم" في خانة "محاذاة الحمض النووي".
8. تقييم الأسماك مؤسس للالظواهر في مرحلة مناسبة واستخدام الأساليب المناسبة لالنمط الظاهري المتوقع ²⁹ (على سبيل المثال، الشكل 3). وستستند أساليب phenotyping على النمط الظاهري المتوقع لهذا الجين المستهدف من قبل الباحث باستخدام protocرأ.

6. الشاشة لنقل سلالة الجرثومية

ملاحظة: أ. mexicanus تصل إلى مرحلة النضج الجنسي في 4-8 أشهر.

1. عبور الأسماك مؤسس الناضجة جنسيا لنوع الأسماك البرية.
2. الأجنة الشاشة أو الأسماك البالغة باستخدام الأساليب في الخطوات 5،1-5،7 (الشكل 4). وبالنسبة للأسماك الكبار، وقطعة من الذيل يمكن أن يثقب بعد التخدير.
   1. تخدير الأسماك غمر الأسماك في حل من تريكين (حمض 3-أمينو إيثيل استر) للحد من التوتر خلال لقطة الزعانف. وبعد لقطة الزعانف، والسماح الأسماك للتعافي في المياه العذبة. الأسماك تتعافى بسرعة؛ مراقبة الا بعد ان تعافى (تسبح عادة).

النتائج

TALEN حقن زوج تؤدي إلى الملزم للRVDs إلى النيوكليوتيدات الحمض النووي محددة وبالتالي dimerization من المجالات FokI، مما أدى إلى انقطاع في الذين تقطعت بهم السبل مزدوجة ³⁹ التي يمكن اصلاحها من خلال نهاية غير المتجانسة الانضمام (NHEJ). في كثير من الأحيان يدخ...

Discussion

وقد خطت خطوات واسعة في السنوات الأخيرة نحو فهم الأساس الجيني للتطور الصفات. بينما الجينات المرشحة الكامنة وراء تطور في عدد من الصفات تم تحديدها، إلا انه لا يزال تحديا لاختبار هذه الجينات في الجسم الحي بسبب عدم وجود قابلية الإستطراق الجيني للأنواع الأكثر إثارة ل...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Thermocycler
Injection station
Gel apparatus
Needle puller
Nanodrop
Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies
Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated
Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0	Addgene	Kit #1000000024
Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated)	Fisher	BP9724-500
Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller	Fisher	BP1426-500
Teknova TET-15 in 50% EtOH	Teknova (ordered through Fisher)	50-843-314
Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents	Fisher	BP2957-1
Super Ampicillin (1,000x solution)	DNA Technologies	6060-1
ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use	Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)	FERR0941
IPTG, Fisher BioReagents	Fisher	BP1620-1
Petri dishes	Fisher	08-757-13
BsaI	New England Biolabs (ordered through Fisher)	50-812-203	Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)
BSA	New England Biolabs	provided with restriction enzymes
10x T4 ligase buffer	Promega (ordered through Fisher)	PR-C1263
GoTaq Green Master mix	Promega (ordered through Fisher)	PRM7123	Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly
Quick ligation kit	New England Biolabs (ordered through Fisher)	50-811-728	We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions
One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli	Invitrogen	C4040-06	Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used
Esp 3I	Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)	FERER0451
Plasmid-Safe ATP-dependent DNase	Epicentre (Ordered through Fisher)	NC9046399
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106	The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104
GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose	BioExpress	E-3119-125
Sac I	Promega (Ordered through Fisher)	PR-R6061
mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kit	Ambion	AM1348M
Rneasy MinElute Cleanup Kit	Qiagen	74204
NorthernMax-Gly Sample Loading Dye	Ambion (ordered through Fisher)	AM8551
Eliminase	Decon (ordered through Fisher)	04-355-32
Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur Pipets	Fisher	13-678-6B
Standard Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100-4
Microcaps	Drummond Scientific Company	1-000-0010
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector	Eppendorf (ordered through Fisher)	E5242956003
Sodium hydroxide	Fisher	S318-500
Tris base	Fisher	BP152-1