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要約

遺伝子標的化突然変異誘発は、ゲノム編集の技術を使用して、生物の幅広いことが可能です。ここで、我々はアステュアナクスmexicanus、表面の魚や洞窟魚が含まれて魚の種におけるエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）などの転写活性化因子を用いて標的遺伝子の突然変異誘発のためのプロトコルを示しています。

要約

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

概要

形質進化の遺伝的基礎を理解することは、進化の生物学者の重要な研究目標です。かなりの進歩は、形質の発生の根底にある遺伝子座を同定し、（実施例1-3の場合）、これらの遺伝子座内の候補遺伝子を特定してなされました。形質の進化を研究するために使用される多くの生物は現在、遺伝的に扱いやすいではありませんしかし、機能的にこれらの遺伝子の役割をテストすることは困難なままです。ゲノム編集技術の出現が大幅に広範囲の生物の遺伝的操作性を増加しています。転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）とクラスタ化された定期的interspaced短いパリンドロームリピート（CRISPRs）は、（例えば、4月11日のために）多数の生物の遺伝子の標的に変異を生成するために使用されてきました。進化的に関連したシステムに適用されるこれらのツールは、進化生物学者は進化の遺伝的基礎を勉強方法に革命をもたらす可能性を秘めています。

アステュアナクスのmexicanusは、2つの形態で存在する魚の種である：川に生息する表面形状（表面の魚）と複数の洞窟住居形態（洞窟魚）A. mexicanusの洞窟魚は（12に概説されている）表面の魚の祖先から進化しました。洞窟魚の集団味蕾と頭蓋neuromastsの数を増加させ、色素沈着の減少または損失を目の損失を含む形質の数を進化させてきた、そのような学校教育の行動の損失のような行動の変化は、給紙姿勢と過食症13の変化を侵略を増加しました-19。洞窟魚と表面の魚は異系交配できるであり、遺伝的マッピング実験は、洞窟の形質1,20-26のための遺伝子座および候補遺伝子を同定するために行われてきました。いくつかの候補遺伝子は、他の種21または過剰発現27または過渡ノックダウンUでのモデル生物で、細胞培養1,19で洞窟の特性に貢献する機能的役割のためにテストされていますA.でモルフォリノ28を歌いますmexicanus。しかしながら、これらの方法の各々には限界があります。 A.これらの遺伝子の変異対立遺伝子を生成する能力mexicanusは洞窟魚の進化にそれらの機能を理解するために重要です。したがって、A. mexicanusは、ゲノム編集技術の応用のための理想的な候補生物です。

ここでは、Aのゲノム編集のための方法を概説しますmexicanus TALENsを使用。この方法は、表現型および興味29の遺伝子で安定突然変異を有する魚の行を単離するためのモザイク注入創始魚を評価するために使用することができます。

プロトコル

すべての動物の手順は、国立衛生研究所のガイドラインに従った、アイオワ州立大学、メリーランド大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。

1. TALENデザイン

  1. TALEN設計ウェブサイトに入力された所望の標的配列。 （例： https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ）。入力は、スペーサ/リピート配列の長さを選択しました。
    1. 「シーケンス」と表示されたボックスの中にゲノム配列をコピーします。
    2. 「カスタムスペーサー/ RVD長さの提供」タブ内のスペーサーの長さと配列の長さを選択します。
      注：15塩基対のスペーサーの長さとうまく15-17ワークの配列の長さを繰り返し、アセンブリはあまり複雑にします。
  2. TALENのペアを選択します。ユニークな制限酵素部位を中心に設計TALENのペアは、消化制限酵素によって遺伝子型決定を可能にPCR産物。
  3. デザインプライマーは、プライマー3 30-32としてウェブサイトを使用してTALEN標的部位の周囲のゲノム領域を増幅しました。制限酵素を用いて遺伝子型決定するとき、設計プライマーは、一度だけ制限酵素部位を含む領域を増幅しました。この領域が増幅され、Aの中に存在する多型を同定するためにTALENの建設に先立って配列決定されることをお勧めしますマイクロインジェクションのために使用されるmexicanusラボ集団。

2. TALEN組立（TALENキットプロトコルから変更された）33,34

詳細およびトラブルシューティングについては、プロトコル34を参照してください。

  1. 製造元の指示に従ってTALENキットから、必要なプラスミドを準備し、シーケンス。
  2. ＃を設定し、AとBは反応Aで繰り返し変数diresidues（RVDS）1-10とデスティネーションベクタpFUS_Aを含める反応のための1の反応はRVDS 11-（N-1）と目を含めますNはTALENでRVDSの総数である反応Bでの電子デスティネーションベクターpFUS_B（N-1）。
    1. 各反応に入れる：各RVD（100 ngの/μl）を、デスティネーションベクター（100 ngの/μl）を、1μlのBSA I制限酵素、1μlのウシ血清アルブミン（BSA）（2 mg / mlとを含む各プラスミドの1μlの）、1μlのリガーゼ、全量20μlの水μlの10×リガーゼ緩衝液およびxの2μlの。例えば、 表1を参照してください。
      注：半反応を使用することもできます。
    2. サーモサイクラーで反応を置き、サイクルを実行します。10倍（37℃/ 5分+ 16℃/ 10分）+ 50℃/ 5分+ 80℃/ 5分。
  3. ヌクレアーゼとの反応をインキュベートします。各反応に1μlの25 mMのATPと1μlのヌクレアーゼを追加します。 37℃で1時間反応をインキュベートします。
  4. 反応を変換します。
    1. 25μlの化学的コンピテント細胞に各反応の2.5μLを変換します。
      注：自家製有能なCellsを使用することができます。しかし、低い能力を有する細胞がコロニーの欠如をもたらすことができます。
      1. 化学的コンピテント細胞を25μlとの反応の2.5μLを混ぜます。 5分間氷上でインキュベートします。 42℃で30秒間細胞をインキュベート。
      2. 2分間氷上にチューブを入れます。異化代謝産物抑制（SOC）とスーパー最適ブロス125μlのを追加します。 37℃で1時間チューブを振ります。
    2. スペクチノマイシン（50μg/ mlの）、X-galおよびイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を含むLBプレート上に形質転換された細胞のプレートを100μl。 37℃でO / Nを成長させます。
  5. 各反応について2-3白色コロニーを選択し、プライマーpCR8_F1とpCR8_R1（ 表2）を用いたコロニーPCRによって確認してください。
    1. 試薬のマスターミックスを行います。例えば、 表3を参照してください。
    2. コロニーを採取し、PCRチューブの底にそれを塗抹し、その後2ミリリットルスペクチノマイシンを含むLBにコロニーの残骸を置きます（50μg/ mlの）。コロニーをチューブにマスターミックス15μlのを置きます。
    3. 以下のPCRプログラムを実行する（ 表4）
    4. 電気泳動による1.5％アガロースゲル上でPCRを（ボリューム全体を実行します）を確認してください。正しいクローンが予想されるサイズのバンドだけでなく、汚れやバンドのはしごを持っています。適切なスミアの例については、34,33を参照してください。
    5. 振とう培養器で37℃でLB培地O / Nで正確なクローンの2ミリリットルの文化を育てます。
  6. 製造元の指示に従ってプラスミドをミニプレップ。
  7. pCR8_F1とpCR8_R1でTALENシーケンスを確認するシーケンス。前述の方法35に従ってください。
  8. 配列決定によって確認し、正しいクローンを使用して、デスティネーションベクターにAとBのベクトルと最終RVDからRVDSを配置します反応＃2（TALENキット）を、設定します。
    1. 反応2（ 表5）のためのミックスを調製します。
      注：ハLF反応を使用することができます。
    2. サーモサイクラー中での反応を置き、次のプログラムを実行します。37℃/ 10分+ 16℃/ 15分+ 37℃/ 15分+ 80℃/ 5分。
  9. 反応を変換します。
    1. 25μlの化学的コンピテント細胞に各反応の2.5μLを変換します。
      1. 化学的コンピテント細胞を25μlとの反応の2.5μLを混ぜます。氷上で5分間インキュベートします。熱は42℃で30秒間細胞に衝撃を与えます。
      2. 氷の上にチューブを入れます。 SOCの125μLを加えます。 37℃で1時間振盪インキュベーター内チューブを置きます。
    2. アンピシリン（100μgの/ mlで）、X-galおよびIPTGを含むLBプレート上に形質転換された細胞のプレートを100μl。 37℃でO / N成長
  10. 各反応について1-3白色コロニーを選択し、プライマーTAL_F1とTAL_R2（ 表2）を用いたコロニーPCRによって確認してください。
    1. ポリメラーゼマスターミックス、水およびプライマーとしての溶液を作ります表3に記載した 。コロニーを採取し、PCRチューブの底にそれを不鮮明にしてから、アンピシリン（100μg/ ml）を2ミリリットルのLBにコロニーの残骸を置きます。コロニーをチューブに溶液を15μLを置きます。
    2. PCRプログラム（ 表6）を実行します。
    3. 電気泳動により1.5％アガロースゲルでPCRを確認してください。正しいクローンが不鮮明とバンドのはしごを持っています。適切なスミアの例については、34,33を参照してください。
    4. 振とう培養器で37℃でLB培地O / Nで正確なクローンの2ミリリットルの文化を育てます。
  11. 製造元の指示に従ってプラスミドをミニプレップ。
  12. 前述の方法35次TAL_F1とTAL_R2でTALENシーケンスを確認するシーケンス。

TALENsの3 mRNAの転写

  1. 37℃で2時間、2μlの行き止まり Iで配列検証し、テンプレートの4μgのダイジェスト。
  2. 電気泳動により1.5％アガロースゲル上でのSac I消化し ​​たプラスミドの2μLを実行します。正しく消化されるプラスミドは、単一のバンドが表示されます。
  3. PCR精製キットプロトコールに従って残りのSac I消化し ​​たプラスミドを精製します。溶出前に洗浄溶液で2回洗浄します。ヌクレアーゼフリー水30μlのに溶出。
  4. T3 mRNA産生のための標準プロトコルに従ってください。
    1. 線形化テンプレート0.5μgのを使用して、半反応を設定します（上記で調製）。 37℃で2時間インキュベートします。
    2. （キットに含まれる）DNアーゼの0.5μlを添加して、37℃で15分間インキュベートします。
  5. 製造者の指示に従って、のmRNAを精製します。 30μlのヌクレアーゼフリー水に溶出します。
  6. mRNAをチェックするために電気泳動により1.5％アガロースゲルを実行します。
    1. RNaseの混入を排除し、1.2％ゲルを準備するために、製品にゲル装置を清掃してください。
    2. ミックス1μlのmRNAを+ 4＆＃181;リットルのヌクレアーゼフリー水+ 5μlのグリオキシルローディング色素。 30分間50℃でサンプルをインキュベートします。ゲルを実行する前に、氷上の遠心分離管に簡単と場所。
  7. 核酸濃度を定量する方法を使用して濃度を確認し、-80℃でアリコート中のRNAを保存します。 RNAが複数回解凍/凍結されていないような分量のサイズを選択します。
    注：500〜1,000 ngの/ NLの濃度は、一般的に得られます。 RNAの完全性が維持されるように（バンドではなく、ゲルのスメアにより評価される）、より低い濃度のRNAであれば使用することができます。

TALEN mRNAと4.を注入アステュアナクスmexicanus胚

  1. 注射用のツールを準備します。
    1. ペトリ皿に魚の水（炭酸水素ナトリウムと海塩のpH 7.4へと導電率700μSで調整水）を1.2％アガロースを注ぐことにより、射出プレートを注ぎます。魚用の井戸を作るための突起を持つ金型（プラスチック片を置き、皿の内側の卵）。アガロースが固まったときに金型を外し、4℃で保存します。金型の詳細については36を参照してください。
    2. 製造元の指示に従ってニードルプラーを使用して、注射用の針を引き出します。
      注：適切な針の長さは、注射のために重要です。長すぎる針は注射のためにあまりにも柔軟になります。針を引っ張るためのプロトコルは、針を引っ張るために使用される機器によって異なります。適切な針の例を図1に示されている。当社の機器の場合、我々は長さが5〜6センチメートルある針を引っ張って、壊れたときに、約0.011ミリメートルの先端の外径を有します。しかし、針は開口幅を決定する（ステップ4.3.4）を校正しなければなりません。針を引っ張るためのプログラム例を表7に見ることができます。
    3. 卵が通過するための開口部の大きさが十分であるように、ピペットを破壊することによって胚移植用ガラスピペットを準備します。壊れ最後まで炎それはもはやシャープではありません。
      注：A.で作業する場合には、ガラスピペットとガラスのボウルを使用することが重要です彼らは粘着性であり、プラスチックに付着するように卵や胚をmexicanus。
  2. 1細胞期卵を収集します。
    1. 品種A. mexicanus標準プロトコル37を以下に示します。
      注：たとえば、魚は14光に維持されている場合：10暗サイクルと消灯ようにとZT14光としてZT0とZeitgerber時間（ZT）を使用して、ZT15とZT19の間に私達の表面の魚の産卵。正確な産卵時間は、個々の研究室のために決定されなければなりません。
    2. 交配前に3〜4日間魚をオーバーフィードと新鮮な水の中に魚を置くことによって産卵を誘発します。温度2°Fを上げます。注意：私たちの最初の水の温度は約74°Fです。
    3. 1細胞期卵を得るために15分ごとにチェックし、暗所で表面の魚の卵を収集します。卵の数百人は、表面の魚の単一のペアから得ることができます。
    4. 収集します顕微鏡下で卵を観察し、単一細胞である卵を収集することにより、注射前に1細胞期胚を単離するために、プラスチック表面とソートに粘着を防止するためのガラスボウルで卵。 （pH及び導電率のために処理された成魚が収容されたタンクの水、）新鮮なシステム水に卵を保管してください。
  3. TALENのmRNAを注入します。
    1. 毒性及び効率TALEN対によって異なるように、注射のための最適濃度を決定するために、全mRNA（ペアの各TALEN等量）の異なる量を注入します。 400〜800 pgのある全mRNAの濃度を注入することによって起動します。希釈し、1.5 NLを注入するための所望の濃度にするmRNAを兼ね備えています。
    2. 負荷は、針の背面へのmRNAを希釈し、マイクロインジェクターに針を取り付けます。
    3. 鉗子を使用して針を破ります。
    4. 針のキャリブレーションを行います。例えば、10回を取り出してマイクロキャピラリー中の得られた滴を集めます。使い捨て10×100 1.0のための81;リットル、32ミリメートルマイクロキャピラリー、低下は1.5 NL / 1注射のための0.5ミリメートルのマイクロキャピラリを埋める必要があります。必要に応じて噴射時間と圧力を調整します。
    5. 1つのセルに針を挿入し、mRNAを注入。ない卵黄に、細胞内に直接のmRNAを注入します。
    6. ガラスボウルで注入した胚を収集します。 23-25​​℃で胚を保管してください。死んだ胚定期的に注射した後の最初の数日間（曇りで不規則な形状になる胚）を削除します。コントロール（未注射）と注入されたプレートから死んだと変形した胚のレコード番号。
      注意：増加したmRNAの濃度が増加し、毒性及び胚の変形/死亡につながることができます。このように、効率対毒性は注入するmRNAの最良の濃度を決定するためにバランスをとらなければなりません。

5.表現型創設者の魚とTALEN効率の評価

  1. 制度的動物プロトコルに従って胚を生け贄に捧げます。
    注：私たちは、安楽死させます氷上で急速に冷却することによって胚。
  2. トランスファーピペットを用いて、0.8μlのPCRストリップチューブに胚を収集します。
    注：ジェノタイピングは、個々の胚または胚のプール上で実行することができます。
  3. DNAを抽出します。
    1. 場所胚を100μlの50mM水酸化ナトリウム（NaOH）中に、4℃に冷却し、次いで、30分間95℃でインキュベートします。
    2. 1 Mトリス塩酸pHが8の1/10量（10μl）を追加します。
  4. （サンプルプロトコルの表8および9を参照）ステップ1.3で設計されたプライマーを用いての領域にPCRを行います。個々の胚のためにDNA1μlのPCR反応のために十分です。
  5. 適切な制限酵素を用いて得られたPCR産物を消化し、電気泳動により1.5％アガロースゲルを実行します。
    1. 例えば、注入した胚に眼皮膚白皮症2（OCA2）遺伝子座の遺伝子型を決定するための0を付加することによって、BSR I制限酵素を用いてPCR産物を消化2時間65℃でインキュベート完成PCR反応12.5μlのにBSRの0.5μlの私が直接、。ゲル上で未消化し、消化された製品を実行します。制限酵素耐性バンドが（ すなわち 、消化し ​​ないバンドが）TALEN誘発性の変異が存在する（ 図2）であることを示しています。
  6. （オプション）は、以前に記載29のように各バンドの強度値を算出するためにゲル分析ツールを使用してフィジー38にゲルの画像を解析することにより、未切断生成物の割合を決定することによって、パーセント突然変異率を計算します。
  7. TAはゲル精製し、制限酵素耐性変異体のバンドをクローニングし、クローンを配列決定することにより変異対立遺伝子の配列を決定します。
    1. ゲルは、製造業者の説明書に従って制限酵素耐性変異体のバンドを精製します。 TAは製造者の指示に従ってバンドのクローンを作成します。コロニーを選択し、振とうで37℃で1.5ミリリットルLB O / Nで成長インキュベータ。
    2. 製造元の指示に従うミニプレップ培養。配列決定のためにDNAを送ります。
    3. このようなAPEなどのプログラムを使用して、野生型配列に変異配列を整列させます。
      1. APEファイルに両方の配列をコピーして貼り付けます。 「ツール」メニューから「整列二つの配列」ツールを選択します。
      2. ドロップダウンメニューを使用して、2つのDNA配列を指定します。
        注：クローニングされた配列の逆相補体をPCRクローニングベクターに入った方向に応じて使用される必要があるかもしれません。配列が整列していない場合は、「整列DNA」ボックスに「改訂・コム」ボックスをチェックする手順を繰り返します。
  8. 適切な段階での表現型のために創始者の魚を評価し、予想される表現型29のための適切な方法（例えば、 図3）を使用して。表現型の方法がprotocを使用して研究することによって、標的遺伝子の予想表現型に基づいて行われますオール。

生殖系列伝送用6.画面

注：A. mexicanus 4-8ヶ月で性的成熟に達します。

  1. 野生型の魚に性的に成熟した創始者の魚を渡り。
  2. 画面の胚またはステップ5.1から5.7のメソッドを使用して成魚（ 図4）。成魚のために、尾の部分は、麻酔次クリップすることができます。
    1. フィンクリッピング時の応力を低減するトリカイン（3-アミノ安息香酸エチルエステル）の溶液に魚を浸漬することによって魚を麻酔。フィンクリッピングに続いて、魚は淡水で回復することができます。魚は急速に回復します。彼らが回復するまで観察（通常は泳いでいます）。

結果

TALENペア注射は、非相同末端結合（NHEJ）を介して修復することができる二本鎖休憩39で、その結果、特定のDNAヌクレオチドとRVDSの結合、したがってのFokIドメインの二量体化につながります。 NHEJは、多くの場合、挿入または欠失（インデル）につながるエラーを導入しています。インデルはTALEN標的部位を囲む領域を増幅しTALENスペーサ領域内で切断す...

ディスカッション

長足の進歩は、形質の進化の遺伝的基礎を理解することに向けて、近年で行われています。特徴の数の進化の基礎となる候補遺伝子が同定されたが、それが原因で最も進化興味深い種の遺伝的取り扱いやすさの欠如にインビボでこれらの遺伝子を試験するために困難なままです。ここでは、Aのゲノム編集のための方法を報告しますmexicanus、洞窟動物の進化を研究するため...

開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

この作品は、遺伝学、開発および細胞生物学、アイオワ州立大学の学科によっておよびNIHのグラントEY024941（WJ）.DRによって賄われていました。ジェフリーEssnerは、原稿にコメントを提供しました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Thermocycler
Injection station
Gel apparatus
Needle puller
Nanodrop
NameCompanyCatalog NumberComments
Supplies
Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated
Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0AddgeneKit #1000000024
Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated)FisherBP9724-500
Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, MillerFisherBP1426-500
Teknova TET-15 in 50% EtOHTeknova (ordered through Fisher)50-843-314
Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagentsFisherBP2957-1
Super Ampicillin (1,000x solution)DNA Technologies6060-1
ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-useThermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)FERR0941
IPTG, Fisher BioReagentsFisherBP1620-1
Petri dishesFisher08-757-13
BsaINew England Biolabs (ordered through Fisher)50-812-203Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)
BSANew England Biolabsprovided with restriction enzymes
10x T4 ligase bufferPromega (ordered through Fisher)PR-C1263
GoTaq Green Master mixPromega (ordered through Fisher)PRM7123Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly
Quick ligation kitNew England Biolabs (ordered through Fisher)50-811-728We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions
One Shot TOP10 Chemically Competent E.coliInvitrogenC4040-06Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used
Esp 3IThermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)FERER0451
Plasmid-Safe ATP-dependent DNaseEpicentre (Ordered through Fisher)NC9046399
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104
GeneMate LE Quick Dissolve AgaraoseBioExpressE-3119-125
Sac IPromega (Ordered through Fisher)PR-R6061
mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kitAmbionAM1348M
Rneasy MinElute Cleanup KitQiagen74204
NorthernMax-Gly Sample Loading Dye Ambion (ordered through Fisher)AM8551
EliminaseDecon (ordered through Fisher)04-355-32
Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur PipetsFisher13-678-6B
Standard Glass CapillariesWorld Precision Instruments1B100-4
MicrocapsDrummond Scientific Company1-000-0010
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet MicroinjectorEppendorf (ordered through Fisher)E5242956003
Sodium hydroxideFisherS318-500
Tris baseFisherBP152-1

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