Genoma Edição na<em&gt; Mexicanus Astyanax</em&gt; Usando Transcrição Activator-like Effector nucleases (TALENS)

Resumo

mutagénese de direccionamento de genes é agora possível em uma ampla gama de microrganismos utilizando técnicas de edição genoma. Aqui, nós demonstramos um protocolo para mutagénese gene alvo usando ativador de transcrição como nucleases efetoras (TALENS) em Astyanax mexicanus, uma espécie de peixe que inclui peixes de superfície e cavefish.

Resumo

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Introdução

A compreensão da base genética da evolução característica é uma meta pesquisa crítica dos biólogos evolutivos. Um progresso considerável foi feito na identificação de loci subjacentes à evolução dos traços e identificar genes candidatos dentro destes loci (por exemplo ^1-3). No entanto, funcionalmente testar o papel destes genes manteve-se como um desafio muitos organismos utilizados para o estudo da evolução de traços não são actualmente tratável geneticamente. O advento das tecnologias de edição genoma aumentou significativamente a manipulabilidade genética de uma larga gama de organismos. Transcrição nucleases-activadores como efectoras (TALENS) e agrupados regularmente interespaçadas palindr�icas repetições curtas (CRISPR) foram usadas para gerar mutações pontuais em genes em vários organismos (por exemplo, ^4-11). Essas ferramentas, aplicados a um sistema evolutivamente relevantes, têm o potencial de revolucionar a forma como os biólogos evolucionistas estudar a base genética da evolução.

Astyanax mexicanus é uma espécie de peixe que existe em duas formas: a. (Peixe de superfície) forma de superfície-moradia rio e múltiplas formas cavernícolas (cavefish) A. mexicanus cavefish evoluíram a partir de ancestrais peixes de superfície (revisto em ^12). Populações de cavefish desenvolveram uma série de características, incluindo a perda dos olhos, diminuição ou perda da pigmentação, aumento do número de papilas gustativas e neuromasts cranianos e alterações no comportamento, como a perda do comportamento de escolaridade, aumento da agressividade, mudanças na alimentação postura e hiperfagia ^{13 -19.} Cavefish e peixes de superfície são interférteis e experimentos de mapeamento genético foram realizados para identificar genes loci e candidatos para características caverna ^1,20-26. Alguns genes candidatos foram testados para um papel funcional em contribuir para traços caverna em cultura de células ^1,19, em organismos modelo de outras espécies de ²¹ ou pela superexpressão ²⁷ ou knockdown transitória ucantar morpholinos ²⁸ em A. mexicanus. No entanto, cada um destes métodos tem limitações. A capacidade para gerar alelos mutantes desses genes em A. mexicanus é fundamental para a compreensão de sua função na evolução da cavefish. Assim, A. mexicanus é um organismo candidato ideal para a aplicação de tecnologias de edição genoma.

Aqui destacamos um método para edição genoma em A. mexicanus usando TALENS. Este método pode ser utilizado para avaliar mosaico injectado peixe fundador para fenótipos e para o isolamento de linhas de peixes com mutações estáveis ​​em ²⁹ genes de interesse.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais estavam de acordo com as orientações dos Institutos Nacionais de Saúde e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use em Iowa State University e da Universidade de Maryland.

1. TALEN projeto

1. Entrada desejada sequência alvo para um site de design TALEN. (Por exemplo: https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ). Entrada escolhida comprimentos de matriz espaçador / repetição.
   1. Copie a sequência genómica na caixa chamada "seqüência".
   2. Dentro da aba "fornecer personalizado Spacer / RVD Comprimentos", selecione o comprimento do espaçador e comprimento da matriz.
      Nota: comprimentos de espaçador de 15 pares de bases e repetir comprimentos de matriz de 15-17 de trabalho bem e fazer a montagem menos complexo.
2. Escolha um par TALEN. pares TALEN concebidos em torno de um local de enzima de restrição único para permitir a genotipagem por digestão com enzimas de restriçãoum produto de PCR.
3. Projeto primers para amplificar a região genômica em torno do local alvo TALEN usando um site como Primer3 ^30-32. Quando a genotipagem com uma enzima de restrição, de concepção iniciadores para amplificar uma região que contém o local de enzima de restrição de uma única vez. Recomenda-se que esta região é amplificado e sequenciado antes da construção TALEN para identificar quaisquer polimorfismos presentes na A. mexicanus população laboratório para ser usado para microinjecção.

2. Montagem TALEN (modificado a partir do Protocolo TALEN Kit) ^33,34

Para obter detalhes adicionais e solução de problemas, consulte o protocolo ^34.

1. Preparar e sequenciar os plasmídeos necessários a partir do kit de TALEN de acordo com as instruções do fabricante.
2. Configure o # 1 Reacções para as reacções A e B. Incluir repetir-variáveis ​​diresidues (RVDS) 1-10 eo pFUS_A destino vector na Reacção A. Incluir RVDS 11- (N-1) e the destino vector pFUS_B (N-1) na Reacção B, em que N é o número total de RVDS na TALEN.
   1. Adicionar a cada reacção: 1 uL de cada um dos plasmídeos contendo cada RVD (100 ng / ul), o vector de destino (100 ng / uL), 1 ul Bsa I da enzima de restrição, 1 ul de Albumina de Soro Bovino (BSA) (2 mg / ml ), 1 ul de ligase, 2 ul de tampão ligase 10x e X ul de água para um volume total de 20 ul. Por exemplo, ver Tabela 1.
      Nota: Meio reacções também podem ser usados.
   2. Coloque reacções num termociclador e executar o ciclo: 10x (37 ° C / 5 min + 16 ° C / 10 min) + 50 ° C / 5 min + 80 ° C / 5 min.
3. Incubam-se as reacções com a nuclease. Para cada reacção de adicionar 1 ul de ATP 25 mM e 1 uL de nuclease. Incubar as reacções a 37 ° C durante 1 h.
4. Transformar reações.
   1. Transformação com 2,5 ul de cada reacção em 25 ul de células competentes quimicamente.
      Nota: caseiro c competenteells pode ser usado. No entanto, as células com competência baixa pode resultar em falta de colónias.
      1. Misture 2,5 ul da reacção com 25 ul de células competentes quimicamente. Incubar em gelo durante cinco min. Incubam-se as células durante 30 segundos a 42 ° C.
      2. Colocar os tubos em gelo durante 2 min. Adicionar 125 mL de Super Optimal caldo com repressão catabólica (SOC). Agitar os tubos a 37 ° C durante 1 h.
   2. Placa de 100 ul das células transformadas em placas de LB com espectinomicina (50 ug / ml), X-gal e isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). Cresça O / N a 37 ° C.
5. Escolha 2-3 colónias brancas para cada reacção e verificar pela colônia PCR usando primers pCR8_F1 e pCR8_R1 (Tabela 2).
   1. Faça uma mistura mestre dos reagentes. Por exemplo, ver Tabela 3.
   2. Escolha uma colônia e manchá-lo no fundo de um tubo PCR, e depois colocar os restos da colônia em 2 ml LB com espectinomicina(50 ug / ml). Colocar 15 ul da mistura principal para dentro do tubo com a colónia.
   3. Executar o seguinte programa de PCR (Tabela 4)
   4. Verifique a PCR (executado de todo o volume) num gel de agarose a 1,5% por electroforese. Os clones correctos terão uma banda com o tamanho esperado, bem como uma mancha e uma escada de bandas. Para um exemplo de o esfregaço adequado, consulte ^34,33.
   5. Cresça 2 ml de culturas dos clones correctos em meio LB O / N a 37 ° C numa incubadora com agitação.
6. Miniprep os plasmídeos de acordo com as instruções do fabricante.
7. Sequência de verificar sequência TALEN com pCR8_F1 e pCR8_R1. Siga métodos previamente descritos ^35.
8. Utilizando os clones correctos verificados por sequenciação, definir-se a reacção # 2 (TALEN kit), que irá colocar os RVDS a partir dos vectores A e B e a RVD final para o vector de destino.
   1. Prepare a mistura de reacção 2 (Tabela 5).
      Nota: Hareacções LF pode ser usado.
   2. Coloque as reacções num termociclador e executar o seguinte programa: 37 ° C / 10 min + 16 ° C / 15 min + 37 ° C / 15 min + 80 ° C / 5 min.
9. Transformar reações.
   1. Transformação com 2,5 ul de cada reacção em 25 ul de células competentes quimicamente.
      1. Misture 2,5 ul da reacção com 25 ul de células competentes quimicamente. Incubar em gelo durante 5 min. Choque térmico das células durante 30 segundos a 42 ° C.
      2. Colocar os tubos em gelo. Adicionar 125 ul de SOC. Colocar os tubos em um incubador com agitação a 37 ° C durante 1 h.
   2. Placa de 100 ul das células transformadas em placas de LB com ampicilina (100 ug / ml), X-gal e IPTG. Crescer O / N a 37 ° C.
10. Escolha 1-3 colónias brancas para cada reacção e verificar pela colônia PCR usando primers TAL_F1 e TAL_R2 (Tabela 2).
    1. Adicione uma solução do mastermix polimerase, e iniciadores como águadescrita na Tabela 3. Escolher uma colónia e esfregaço-o no fundo de um tubo de PCR, e em seguida colocar os restos da colónia em 2 ml de LB com ampicilina (100 ug / ml). Colocar 15 ul da solução no tubo com a colónia.
    2. Executar o programa de PCR (Tabela 6).
    3. Verifique a PCR num gel de agarose a 1,5% por electroforese. Os clones correctos terão um manchas e uma escada de bandas. Para um exemplo de o esfregaço adequado, consulte ^34,33.
    4. Cresça 2 ml de culturas dos clones correctos em meio LB O / N a 37 ° C numa incubadora com agitação.
11. Miniprep os plasmídeos de acordo com as instruções do fabricante.
12. Sequência de verificar sequência TALEN com TAL_F1 e TAL_R2 seguindo os métodos descritos anteriormente ^35.

3. A transcrição de ARNm TALENS

1. Digerir 4 ug do modelo verificou-sequência com 2 ul Sac I durante 2 horas a 37 ° C.
2. Executar 2 ul do plasmídeo Sac I digerido num gel de agarose a 1,5% por electroforese. Os plasmídeos que são correctamente digeridos irá exibir uma única banda.
3. Purifica-se o plasmídeo restante Sac I digerido seguindo o protocolo do kit de purificação de PCR. Lavar duas vezes com a solução de lavagem antes da eluição. Eluir em 30 mL de água livre de nuclease.
4. Siga o protocolo padrão para a produção de mRNA T3.
   1. Configurar meias reações usando 0,5 mg de modelo linearizado (preparado acima). Incubar a 37 ° C durante 2 h.
   2. Adicionar 0,5 ul de ADNase (incluído no estojo) e incubar a 37 ° C durante 15 min.
5. Purifica-se o ARNm, seguindo as instruções do fabricante. Eluir em 30 de água livre de nuclease ul.
6. Executar um gel de agarose a 1,5% por electroforese para verificar o ARNm.
   1. Limpar o aparelho de gel com um produto para eliminar a contaminação com RNase e preparar um gel de 1,2%.
   2. Mix 1 mRNA ul + 4 &# 181; l livre de nuclease de água + 5 jul glioxil carga de corante. Incubar as amostras a 50 ° C durante 30 min. Centrifugar os tubos de forma breve e colocar no gelo antes de executar o gel.
7. Verifique a concentração, utilizando um método de quantificação de concentrações de ácidos nucleicos e armazenar o ARN em alíquotas a -80 ° C. Escolha um tamanho de alíquota de tal forma que o RNA não está congelado / descongelado mais de uma vez.
   Nota: As concentrações de 500-1000 ng / nl são tipicamente obtidas. ARN com uma concentração mais baixa pode ser usado, desde que a integridade de ARN é mantida (como avaliado por uma banda em vez de um esfregaço no gel).

4. Inject Astyanax mexicanus embriões com mRNA TALEN

1. Prepare Ferramentas para injecção.
   1. Verter em placas de injecção por vazamento de 1,2% de agarose em peixes de água (água condicionada com bicarbonato de sódio e sal do mar para um pH de 7,4 e condutividade de 700 mS) numa placa de Petri. Coloque um molde (pedaço de plástico com as projeções para fazer poços para peixesovos) no interior do prato. Retirar o molde quando a agarose endureceu e armazenar a 4 ° C. Para mais detalhes sobre o molde ver ^36.
   2. Puxar agulhas para injecção, utilizando um extractor de agulha de acordo com as instruções do fabricante.
      Nota: comprimento da agulha adequada é importante para injectáveis. Agulhas que estão muito tempo vai ser muito flexível para injectáveis. O protocolo para as agulhas que puxam irá variar com o equipamento usado para puxar agulhas. Um exemplo de uma agulha apropriada é mostrado na Figura 1. Para o nosso equipamento, que puxar agulhas que são 5-6 cm de comprimento, e tem um diâmetro externo na ponta de cerca de 0,011 milímetros quando quebrado. No entanto, as agulhas devem ser calibrados (passo 4.3.4) para determinar a largura de abertura. Um programa de exemplo para puxar as agulhas podem ser encontrados na Tabela 7.
   3. Prepare pipetas de vidro para transferência de embriões por quebrar a pipeta de modo que a abertura é grande o suficiente para um ovo para passar. Inflamar o final quebrado atéele não é mais acentuado.
      Nota: É importante o uso de pipetas de vidro e taças de vidro quando se trabalha com A. mexicanus ovos embriões e como eles são pegajoso e irá aderir ao plástico.
2. Recolha 1 de células Stage ovos.
   1. Raça A. mexicanus seguindo protocolos convencionais ^37.
      Nota: Por exemplo, se os peixes são mantidos em um 14 luz: ciclo escuro 10 e usando o tempo Zeitgerber (ZT) com ZT0 como luzes acesas e ZT14 como luzes apagadas, a desova de peixes de superfície entre ZT15 e ZT19. época de reprodução exata deve ser determinada para cada laboratório individual.
   2. Induzir a desova por superalimentação de peixe por 3-4 dias antes do acasalamento e colocando peixe em água doce. Elevar a temperatura ° F 2. Nota: Nossa temperatura inicial da água é de aproximadamente 74 ° F.
   3. Recolher os ovos de peixes de superfície no escuro, verificando a cada 15 min para obter ovos na fase 1 célula. Centenas de ovos pode ser obtido a partir de um único par de peixes de superfície.
   4. coletarovos em tigelas de vidro para impedir que adere a superfícies de plástico e tipo, para isolar os embriões na fase de uma célula antes da injecção por meio da observação de ovos sob o microscópio e recolhendo ovos que são de uma única célula. Mantenha os ovos em água doce sistema (água do tanque em que os peixes adultos estão alojados, que foi tratada para pH e condutividade).
3. Injetar mRNA TALEN.
   1. Injectar diferentes quantidades de ARNm total (quantidades iguais de cada TALEN no par) para determinar a concentração óptima para a injecção como toxicidade e eficiência variar por TALEN par. Comece por injecção de concentrações de ARNm total que são 400-800 pg. Dilui-se e combinar ARNm para as concentrações desejadas para a injecção de 1,5 nl.
   2. Carga diluída ARNm na parte de trás da agulha e colocar a agulha uma micro-injector.
   3. Quebrar a agulha com a pinça.
   4. Calibrar a agulha. Por exemplo, ejectar 10 vezes e recolher a queda, resultando em um micro capilar. Para 10 100 x 1,0 descartável81; l, 32 milímetros micro capilar, a gota deve preencher o micro capilar até 0,5 mm para 1,5 nl / 1 injecção. Ajuste o tempo de injeção e pressão conforme necessário.
   5. Insira a agulha na única célula e injetar o mRNA. Injectar o ARNm directamente para dentro da célula, não na gema.
   6. Coletar embriões injetados em taças de vidro. Manter os embriões em 23-25 ​​° C. Remover embriões mortos (embriões que se tornam nublado e de forma irregular) regularmente para os primeiros dias após a injecção. Um número recorde de embriões mortos e deformados de controle (não injectada) e as placas injetado.
      Nota: O aumento da concentração de mRNA pode levar ao aumento da toxicidade e deformidade / morte de embriões. Assim, a toxicidade contra eficiência devem ser equilibradas para determinar a melhor concentração de ARNm para injectar.

5. Fenótipo Peixe Fundador e avaliar a eficiência TALEN

1. Sacrificar embriões acordo com o protocolo animais institucional.
   Nota: Nós eutanásiaembriões de arrefecimento rápido em gelo.
2. Coletar embriões em 0,8 ul de PCR tubos tira utilizando uma pipeta de transferência.
   Nota: A genotipagem pode ser realizada em embriões ou conjuntos de embriões individuais.
3. Extrair DNA.
   1. Coloque embriões em 100 ul de hidróxido de sódio 50 mM (NaOH) e incubar a 95 ° C durante 30 min, depois arrefece-se a 4 ° C.
   2. Adicionar ^1/10 volume de (10 ul) de Tris-HCl 1 M pH 8.
4. Realizar uma PCR para a região utilizando os primers desenhados no passo 1.3 (ver Tabelas 8 e 9 para os protocolos de amostra). Para os embriões individuais 1 uL de ADN é suficiente para a reacção de PCR.
5. Digerir o produto de PCR resultante, com a enzima de restrição apropriada e correr um gel de agarose a 1,5% por electroforese.
   1. Por exemplo, para a genotipagem do locus albinismo oculocutâneo 2 (OCA2) em embriões injectados digerir o produto de RCP, utilizando o enzima de restrição Bsr I por adição de 0.5 Ul de Bsr I directamente a 12,5 uL da reacção de PCR concluída, incubando a 65 ° C durante 2 h. Executar o não digerido e o produto digerido num gel. Bandas resistente a enzimas de restrição (ou seja, as bandas que não digerem) indicam que as mutações induzidas TALEN estão presentes (Figura 2).
6. (Opcional) Calcular a taxa de mutação percentagem por determinação da percentagem de produto não cortado através da análise de imagens de geles em Fiji ³⁸ usando a ferramenta de análise em gel para calcular o valor de intensidade de cada banda ^29, como descrito anteriormente.
7. Determinar a sequência de alelos mutantes de clonagem TA por a banda mutante resistente purificado em gel de enzima de restrição e sequenciação de clones.
   1. Gel purificar a enzima de restrição banda mutante resistente seguindo as instruções do fabricante. TA clonar a banda seguindo as instruções do fabricante. Escolha colónias e crescer em 1,5 ml de LB O / N a 37 ° C em uma agitaçãoincubadora.
   2. culturas Miniprep seguindo as instruções do fabricante. Envia o DNA para sequenciamento.
   3. Usando um programa como o macaco, alinhar as sequências mutantes para a sequência do tipo selvagem.
      1. Copiar e colar as duas seqüências em arquivos de macaco. Escolha a opção "Alinhar duas sequências de" ferramenta a partir do menu "Ferramentas".
      2. Especificar as duas sequências de ADN usando os menus suspensos.
         Nota: o complemento reverso da sequência clonada pode precisar de ser utilizado, dependendo do sentido da PCR foi para o vector de clonagem. Se as sequências não se alinham, repita os passos de marcar a caixa "Rev-Com" na caixa "DNA Align".
8. Avaliar peixes fundador de fenótipos na fase adequada e utilizando métodos adequados para o fenótipo esperado ²⁹ (Por exemplo, a Figura 3). Os métodos de fenotipagem será com base no fenótipo esperado para o gene alvo pelo investigador utilizando a PROTOCol.

6. Tela de transmissão germinal

Nota: A. mexicanus atingem a maturidade sexual aos 4-8 meses.

1. Cruzar um peixe fundador sexualmente maduros para o tipo de peixe selvagem.
2. Embriões de tela ou peixes adultos usando métodos em passos 5.1-5.7 (Figura 4). Para peixes adultos, um pedaço da cauda pode ser cortada seguinte anesthetization.
   1. Anestesiar peixe peixes por submersão numa solução de tricaina (éster etílico do ácido 3-aminobenzóico) para reduzir o stress durante recorte aleta. Seguindo recorte fin, permitir que os peixes para se recuperar em água doce. Peixe recuperar rapidamente; observar até que tenham recuperado (estão nadando normalmente).

Resultados

TALEN injecções par resultar na ligação dos RVDS aos nucleótidos de ADN específicas e, assim, a dimerização dos domínios FokI, resultando em quebras de cadeia dupla ^39, que podem ser reparados através da extremidade não-homóloga de união (NHEJ). NHEJ frequentemente introduz erros que resultam em inserções ou deleções (indels). Indels podem ser identificados através da amplificação da região em torno do local alvo TALEN e digestão do fragmento amp...

Discussão

Grandes avanços foram feitos nos últimos anos para a compreensão da base genética da evolução dos traços. Embora os genes candidatos subjacentes a evolução de um número de características tem sido identificado, manteve-se um desafio para testar estes genes in vivo, devido à falta de rastreabilidade genética de espécies evolutivamente mais interessantes. Aqui nós relatamos um método para edição genoma em A. mexicanus, espécie usada para estudar a evolução de animais das cavernas. Ma...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Thermocycler
Injection station
Gel apparatus
Needle puller
Nanodrop
Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies
Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated
Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0	Addgene	Kit #1000000024
Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated)	Fisher	BP9724-500
Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller	Fisher	BP1426-500
Teknova TET-15 in 50% EtOH	Teknova (ordered through Fisher)	50-843-314
Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents	Fisher	BP2957-1
Super Ampicillin (1,000x solution)	DNA Technologies	6060-1
ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use	Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)	FERR0941
IPTG, Fisher BioReagents	Fisher	BP1620-1
Petri dishes	Fisher	08-757-13
BsaI	New England Biolabs (ordered through Fisher)	50-812-203	Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)
BSA	New England Biolabs	provided with restriction enzymes
10x T4 ligase buffer	Promega (ordered through Fisher)	PR-C1263
GoTaq Green Master mix	Promega (ordered through Fisher)	PRM7123	Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly
Quick ligation kit	New England Biolabs (ordered through Fisher)	50-811-728	We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions
One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli	Invitrogen	C4040-06	Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used
Esp 3I	Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)	FERER0451
Plasmid-Safe ATP-dependent DNase	Epicentre (Ordered through Fisher)	NC9046399
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106	The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104
GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose	BioExpress	E-3119-125
Sac I	Promega (Ordered through Fisher)	PR-R6061
mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kit	Ambion	AM1348M
Rneasy MinElute Cleanup Kit	Qiagen	74204
NorthernMax-Gly Sample Loading Dye	Ambion (ordered through Fisher)	AM8551
Eliminase	Decon (ordered through Fisher)	04-355-32
Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur Pipets	Fisher	13-678-6B
Standard Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100-4
Microcaps	Drummond Scientific Company	1-000-0010
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector	Eppendorf (ordered through Fisher)	E5242956003
Sodium hydroxide	Fisher	S318-500
Tris base	Fisher	BP152-1