genom Düzenleme<em&gt; Astyanax mexicanustan</emKullanma&gt; Transkripsiyon Aktivatör benzeri Efektör Nükleazlar (Talens)

Özet

Gen hedefleme mutajenez genom düzenleme teknikleri kullanılarak organizmaların geniş bir mümkündür. Burada, Astyanax mexicanus, yüzey balık ve cavefish içeren balık türlerinin efektör nükleazlar (Talens) gibi transkripsiyon aktivatörü kullanılarak hedeflenen gen mutasyon için bir protokol göstermektedir.

Özet

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Giriş

Sürekli evrim genetik temelini anlamak evrimci biyologların kritik bir araştırma hedeftir. Önemli ilerleme özelliklerin evrimini altında yatan lokusların belirlenmesi ve (örneğin ^1-3) bu loci içinde aday genlerin saptayarak yapılmamıştır. Ancak, fonksiyonel bu genlerin rolü özelliklerin evrimini incelemek için kullanılan birçok organizmaları zorlu kaldı etmiştir test şu anda genetik uysal değildir. Genom düzenleme teknolojileri çıkması büyük ölçüde organizmaların geniş bir genetik uygulanabılirliği artmıştır. Transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlar (TALENS) ve kümelenmiş düzenli aralıklarla yerleştirilmişlerdir kısa yineleyen tekrarlar (CRISPRs) (Örnek ^4-11 için) organizmadan genler hedefli mutasyon üretmek için kullanılmıştır. Bir evrimsel ilgili sisteme uygulanan bu araçları, evrimsel biyologlar evrimin genetik temeli çalışma yol devrim potansiyeline sahip.

Astyanax mexicanustan iki şekilde bulunur balık türüdür. Bir nehir yaşayan yüzey formu (yüzey balık) ve çoklu mağaralarda yaşayan formları (cavefish) A. mexicanustan cavefish ⁽¹² gözden) yüzey balık atalarından evrimleştiği. Cavefish popülasyonu gibi okullaşma davranışının kaybı, artan saldırganlık, duruş ve hiperfajya ¹³ beslenme değişiklikleri gibi davranış damak tadınızı ve kafatası neuromasts ve değişikliklerin sayısında artış, azalma ya da pigmentasyon kaybı, gözlerde kaybı da dahil olmak üzere özellikleri bir dizi geliştiğini ^-19. Cavefish ve yüzey balıkları interfertile, ve genetik haritalama deneyleri mağara özellikleri ^1,20-26 için lokus ve aday genleri tanımlamak için yapılmıştır. Bazı aday genler diğer türlerin ²¹ model organizmalarda veya aşırı ifadesinin ²⁷ veya geçici demonte u tarafından, hücre kültürü ^1,19 mağara özellikleri katkıda işlevsel rolü için test edilmiştirA. morpholinos ²⁸ şarkı mexicanustan. Bununla birlikte, bu yöntemlerin her biri, bir sınırlama vardır. A. Bu genlerin mutant alelleri oluşturma yeteneği mexicanustan cavefish evriminde işlevini anlamak için kritik önem taşır. Bu nedenle, A. mexicanustan genom düzenleme teknolojileri uygulanması için ideal bir aday organizmadır.

Burada A. genom düzenleme için bir yöntem özetlemektedir mexicanustan Talens kullanılmıştır. Bu yöntem, fenotip ve ilgi ²⁹ genlerin kararlı mutasyonları ile balık hatları izole etmek için mozaik enjekte kurucu balık değerlendirmek için de kullanılabilir.

Protokol

Bütün hayvan prosedürleri Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzlarına uygun olarak ve Iowa Eyalet Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi ve Maryland Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. TALEN Tasarım

1. Bir TALEN tasarım web sitesine giriş istenen hedef dizisi. (Örneğin https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ). Giriş boşluk / tekrar dizi uzunlukları seçildi.
   1. "Dizi" etiketli kutunun içine genomik dizisi kopyalayın.
   2. "Özel Spacer / RVD Uzunlukları sağlayın" sekme içinde boşluk uzunluğu ve dizi uzunluğunu seçin.
      Not: 15 baz çiftlerinin Spacer uzunlukları ve iyi 15-17 iş dizi uzunlukları tekrarlamak ve montaj az karmaşık hale getirmektedir.
2. Bir TALEN çiftini seçin. benzersiz sınırlama enzimi noktasının etrafında tasarlanmış TALEN çiftleri kısıtlama enzimi tarafından genotipleme sindirilmesi izinBir PCR ürünü,.
3. Tasarım primerler gibi Primer3 ^30-32 gibi web sitesini kullanarak TALEN hedef alanını çevreleyen genomik bölgeyi yükseltmek için. bir kısıtlama enzimiyle genotipleme olduğunda, astar tasarımı bir kere kısıtlayıcı enzim merkezi ihtiva eden bir bölümünün yükseltilmesi için. Bölgenin büyütülmüş ve A içinde mevcut olan herhangi polimorfizmlerini tespit etmek TALEN yapı önce dizilenmiştir önerilir mexicanustan laboratuar popülasyon mikro enjeksiyon için kullanılmak üzere.

(TALEN Kit Protokolü Modifiye) 2. TALEN Meclisi ^33,34

Ek ayrıntılar ve sorun giderme için protokol ³⁴ bkz.

1. Hazırlayın ve üreticinin talimatlarına göre TALEN kiti gerekli plazmidler sırası.
2. reaksiyonlar A ve B için 1 reaksiyonlar tekrar değişkenli diresidues (RVDs) 1-10 ve Reaksiyon A. hedef vektör pFUS_A RVDs dahil 11- dahil # (N-1) ve th kurmakN talen bölgesindeki RVDs sayısı e hedef vektör pFUS_B Reaksiyon B (n-1).
   1. Her reaksiyon ekleyin: Her RVD (100 ng / | il), hedef vektör (100 ng / | il), 1 ul Bsa I kısıtlayıcı enzim, 1 ul Sığır Serum Albumin (BSA) (2 mg / ml ihtiva eden her bir plazmid, 1 ul ), 1 ul ligazı, 20 ul toplam hacim su ul 10x ligaz tamponu ve x 2 ul. Örneğin, bakınız Tablo 1.
      Not: yarım reaksiyonları da kullanılabilir.
   2. Bir PCR reaksiyonları yerleştirin ve döngüyü çalıştırın: 10x (37 ° C / 5 dk + 16 ° C / 10 dk) + 50 ° C / 5 dk + 80 ° C / 5 dk.
3. nükleazı ile reaksiyonları inkübe edin. Her reaksiyon için 1 ul 25 mM ATP ve 1 ul nükleaz ekleyin. 1 saat süre ile 37 ° C 'de reaksiyonlar inkübe edin.
4. Tepkiler Transform.
   1. Kimyasal olarak 25 ul yetkin hücreleri her bir reaksiyonun 2.5 ul dönüşümü.
      Not: Ev yapımı yetkili carşın kullanılabilir. Bununla birlikte, düşük yetkinlik hücreler koloni eksikliği ile sonuçlanabilir.
      1. kimyasal olarak yetkin hücre 25 ul reaksiyon 2.5 ul karıştırın. Beş dakika süre ile buz üzerinde inkübe edin. 42 ° C'de 30 saniye boyunca inkübe hücreleri.
      2. 2 dakika boyunca buz üzerinde tüpler yerleştirin. Katabolik baskı (SOC) ile Süper Optimal suyu 125 ul ekleyin. 1 saat boyunca 37 ° C'de tüpler çalkalayın.
   2. Plaka spektinomisin (50 ug / ml) LB plakaları üzerine dönüştürülmüş hücreler, 100 ul, X-gal ve izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG). 37 ° C sıcaklıkta O / N büyütün.
5. Her reaksiyon için 2-3 Beyaz koloniler ve primerlerin pCR8_F1 ve pCR8_R1 (Tablo 2) kullanılarak koloni PCR ile kontrol edin.
   1. reaktiflerin bir ana karışımı olun. Örneğin, bakınız Tablo 3.
   2. Bir koloni seçin ve bir PCR tüp dibine onu yayma ve daha sonra spektinomisin ile 2 ml LB içine koloninin kalıntılarını koymak(50 ug / ml). koloniye ile tüpe ana karışımı 15 ul yerleştirin.
   3. Aşağıdaki PCR programını çalıştırın (Tablo 4)
   4. elektroforez ile% 1.5 agaroz jel üzerinde PCR (tüm birimi çalıştırın) kontrol edin. Doğru klonlar, beklenen boyutta bir bant gibi bir yayma ve bantların bir merdiven olacaktır. Uygun smear örneği için ^34,33 bkz.
   5. bir çalkalama inkübatöründe 37 ° C'de LB ortamı O / N doğru klon 2 mi kültür büyütün.
6. üreticinin talimatlarına uygun olarak plazmidler miniprep.
7. Sıra pCR8_F1 ve pCR8_R1 ile TALEN dizisini kontrol etmek için. Daha önce tarif edilen metotlar ³⁵ izleyin.
8. dizisi ile doğrulandı doğru klonlar kullanarak, hedef vektörü içine A ve B vektörleri ve son RVD gelen RVDs yerleştirir reaksiyon 2. (TALEN kiti) kurmuştur.
   1. Reaksiyonun 2 (Tablo 5) karışımı hazırlayın.
      Not: HaEğer reaksiyonları kullanılabilir.
   2. Bir PCR reaksiyonları yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın: 37 ° C / 10 dk + 16 ° C / 15 dk + 37 ° C / 15 dk + 80 ° C / 5 dk.
9. Tepkiler Transform.
   1. Kimyasal olarak 25 ul yetkin hücreleri her bir reaksiyonun 2.5 ul dönüşümü.
      1. kimyasal olarak yetkin hücre 25 ul reaksiyon 2.5 ul karıştırın. 5 dakika buz üzerinde inkübe edin. Isıtma 42 ° C'de 30 saniye boyunca hücrelerin şok.
      2. buz üzerinde tüpler yerleştirin. SOC 125 ul ekleyin. 1 saat süre ile 37 ° C 'de çalkalayıcı bir inkübatör içinde tüpler yerleştirin.
   2. Plaka ampisilin (100 ug / ml), X-gal ve IPTG ile LB levhaları üzerine dönüştürülmüş hücreler 100 ul. 37 ° C sıcaklıkta O / N büyütün
10. Her reaksiyon için 1-3 Beyaz koloniler ve koloni PCR ile primerler TAL_F1 kullanarak TAL_R2 (Tablo 2) ile kontrol edin.
    1. polimeraz master, su ve primer olarak bir çözeltisini yapmakTablo 3'te tarif edilmiştir. Bir koloni almak ve bir PCR tüpünün dibine smear ve ampisilin (100 ug / ml) ile 2 ml LB içinde koloninin kalıntılarını koydu. koloni tüpe çözeltisi 15 ul koyun.
    2. PCR programı (Tablo 6) çalıştırın.
    3. elektroforez ile% 1.5 agaroz jeli üzerinde PCR edin. Doğru klonlar bulaşmasını ve bantların bir merdiven olacak. Uygun smear örneği için ^34,33 bkz.
    4. bir çalkalama inkübatöründe 37 ° C'de LB ortamı O / N doğru klon 2 mi kültür büyütün.
11. üreticinin talimatlarına uygun olarak plazmidler miniprep.
12. Dizi TAL_F1 ve TAL_R2 daha önce tarif edilen metotlar ³⁵ aşağıdaki TALEN sekansını kontrol etmek için.

Talens 3. mRNA transkripsiyonunu

1. 37 ° C'de 2 saat boyunca 2 ul Sac I ile dizi-belirlenmiş şablon 4 ug Digest.
2. Elektroforez ile% 1.5 agaroz jeli üzerinde Sac I ile sindirilmiş plasmid 2 ul çalıştırın. Doğru sindirilir Plazmidler tek bant gösterecektir.
3. PCR saflaştırma kiti protokolü sonra, kalan Sac I ile sindirilmiş plasmid saflaştırılır. Elüsyon önce yıkama çözeltisi ile iki kez yıkanır. nükleaz içermeyen su 30 ul içinde yıkayın.
4. T3 mRNA üretimi için standart bir protokol izleyin.
   1. Lineerleştirilmiş şablonun 0.5 mikrogram ile yarım reaksiyonları kurmak (yukarıda hazırlanan). 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   2. DNase (kiti içinde bulunur), 0.5 ul ilave edin ve 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
5. Üreticinin talimatlarını izleyerek mRNA arındırın. 30 ul nükleaz içermeyen su içine Zehir.
6. mRNA kontrol etmek için elektroforez ile% 1.5 agaroz jel çalıştırın.
   1. RNaz kontaminasyonu ortadan kaldırmak ve% 1.2 jel hazırlamak için bir ürün ile jel aparat temizleyin.
   2. Karışım 1 ul mRNA + 4-# 181; l nükleaz içermeyen su + 5 ul glioksil yükleme boyası. 30 dakika boyunca 50 ° C'de inkübe edin. jel çalıştırmadan önce buz üzerinde santrifüj tüplerine kısaca ve yer.
7. nükleik asit konsantrasyonlarının ölçülmesi için bir yöntem kullanarak yoğunlaştırma kontrol edin ve -80 ° C'de parçalar halinde saklayın RNA. RNA / dondurulmuş birden fazla çözülmüş değildir, öyle ki, bir kısım boyutu seçin.
   Not: 500-1000 ng konsantrasyonlar / nl genellikle elde edilir. RNA bütünlüğü korunur (a bant yerine jel üzerinde yayma tarafından değerlendirilir) daha düşük bir konsantrasyonda RNA sürece kullanılabilir.

TALEN mRNA ile 4. enjekte Astyanax mexicanustan Embriyolar

1. Enjeksiyon için Araçlar hazırlayın.
   1. bir petri içine balık su (sodyum bikarbonat ve deniz tuzu pH 7.4 ve iletkenlik 700 mS ile şartlandırılmış su)% 1.2 agaroz dökerek enjeksiyon plakaları dökün. balık kuyu olmak için çıkıntılar olan bir kalıbın (plastik parça yerleştirinçanak içinde yumurta). 4 ° C'de agaroz sertleşmiş kalıp ve mağaza çıkarın. Kalıpta ayrıntılar ³⁶ için bkz.
   2. üreticinin talimatlarına göre bir iğne çektirmenin kullanarak enjeksiyon için iğne çekin.
      Not: Uygun iğne uzunluğu enjeksiyonlar için önemlidir. çok uzun olan iğneler enjeksiyonlar için çok esnek olacaktır. çekerek iğne protokol iğneler çekmek için kullanılan ekipman ile değişecektir. Uygun bir iğne bir örnek bizim ekipman için, uzunluğu 5-6 cm iğne çekin. Şekil 1'de gösterildiği ve kırıldığı zaman yaklaşık 0.011 mm ucunda bir dış çapa sahip olduğu. Ancak, iğneler açılış genişliğini belirlemek için (adım 4.3.4) kalibre edilmelidir. Iğneler çekmek için bir örnek program Tablo 7'de bulunabilir.
   3. bir yumurta geçmesine açılış yeterince büyük ve böylece pipet kırarak embriyo transferi için cam pipetler hazırlayın. kırık ucu kadar Alevartık keskindir.
      Not: A. ile çalışırken cam pipetler ve cam kase kullanmak önemlidir mexicanustan yumurta ve embriyo onlar yapışkan ve plastik uyacaktır olarak.
2. 1-hücreli Sahne Yumurta toplayın.
   1. Irk A. mexicanustan standart protokoller ³⁷ Aşağıdaki.
      Not: Örneğin, balık 14 ışık tutulur eğer: 10 karanlık döngüsü ve ışıklar kapalı olarak ve ZT14 ışıkları olarak ZT0 ile Zeitgerber zaman (ZT) kullanılarak, ZT15 ve ZT19 tarihleri ​​arasında yüzey balık yumurtlamak. Tam yumurtlama zamanı her laboratuar için tespit edilmelidir.
   2. çiftleşme öncesi 3-4 gün balık fazla besleme ve taze suya balık koyarak yumurtlama neden olur. Sıcaklık 2 ° F kaldırın. Not: Bizim ilk su sıcaklığı yaklaşık 74 ° F.
   3. 1 hücre aşamada yumurta elde etmek için her 15 dakikada kontrol karanlıkta yüzey balık yumurta toplamak. yumurta yüz yüzeyi balık tek bir çift elde edilebilir.
   4. Toplamakcam kase yumurta plastik yüzeylere yapışmasını önler ve sıralama mikroskop altında yumurta gözlemleyerek ve tek bir hücre olan yumurta toplama yoluyla enjeksiyondan önce 1 hücre aşamasında embriyoların izole etmek. (PH ve iletkenlik için işlem görmüş yetişkin balıklar yer aldığı bir hazne suyu,), taze sistem suda yumurta tutun.
3. TALEN mRNA enjekte.
   1. toksisite ve etkinlik TALEN çift değişir gibi enjeksiyon için uygun konsantrasyonu belirlemek için toplam mRNA (çiftteki her talen eşit miktarlarda) farklı miktarlarda enjekte edilir. 400-800 pg olan toplam mRNA konsantrasyonlarını enjekte ederek başlayın. Seyreltilir ve 1.5 NL enjekte edilmesi için istenen konsantrasyonlara mRNA birleştirir.
   2. Yük iğnenin arkasına mRNA seyreltilmiş ve bir mikro-enjektöre iğneyi takın.
   3. forseps kullanarak iğne kırın.
   4. iğne kalibre edin. Örneğin, 10 kez çıkarma ve bir mikro kapiller gerilemesi toplar. 10 x 100 atılabilir 1.081 l, 32 mm mikro kılcal, damla 1.5 nl / 1 enjeksiyon için 0.5 mm mikro kılcal doldurmalıdır. Gerektiğinde enjeksiyon zamanı ve basıncını ayarlayın.
   5. tek hücre içine iğne takın ve mRNA enjekte edin. değil sarısı içine, hücre içine doğrudan mRNA enjekte edilir.
   6. cam kase enjekte embriyolar toplayın. 23-25 ​​° C embriyolar tutun. ölü embriyolar düzenli enjeksiyonu takiben ilk birkaç gün için (bulutlu ve düzensiz şekilli hale embriyolar) çıkarın. kontrol (uninjected) ve enjekte edilen levhalardan ölü ve deforme embriyoların rekor numaraları.
      Not: Artan mRNA konsantrasyonu artmış toksisite ve embriyo deformite / ölüme yol açabilir. Bu nedenle, randıman karşı toksisiteyi enjekte mRNA iyi konsantrasyonunu belirlemek için dengelenmelidir.

5. Fenotip Kurucu Balık ve TALEN Verimliliği değerlendirin

1. kurumsal hayvan protokole göre embriyolar Kurban.
   Not: euthanizeHızlı tarafından embriyolar buz üzerinde ürpertici.
2. Bir transfer pipet kullanarak 0,8 ul PCR şerit tüpler içine embriyolar toplayın.
   Not: Genotiplendirme bireysel embriyolar veya embriyoların havuzları üzerinde gerçekleştirilebilir.
3. DNA ayıklayın.
   1. 100 ul 50 mM sodyum hidroksit (NaOH) içine yerleştirin embriyolar 4 ° C'ye soğutun, 30 dakika boyunca 95 ° C'de inkübe edin.
   2. 1 M Tris-HCI pH 8 ^1/10 hacmi (10 ul) eklenir.
4. Adım 1.3 tasarlanan primerler (örnek protokoller için masalar 8 ve 9 bakınız) kullanarak bölgede bir PCR gerçekleştirin. Bireysel embriyolar için DNA 1 ul PCR reaksiyonu için yeterlidir.
5. uygun kısıtlama enzimi ile elde edilen PCR ürünü sindirimi ve elektroforez ile% 1.5 agaroz jel üzerinde çalıştırıldı.
   1. Örneğin, enjekte edilen embriyolar okülokütanöz albinizm 2 (OCA2) odağı genotipleme için 0 ekleyerek kısıtlama enzimi Bsr kullanıyorum PCR ürünü sindirmek2 saat boyunca 65 ° C'de inkübe tamamlanmış PCR reaksiyonunun 12.5 ul e BSR doğrudan I .5 ul. sindirilmemiş ve bir jel üzerinde sindirilmiş ürünü çalıştırın. Kısıtlama enzimi dayanıklı grupları (yani, sindirimi olmayan bantları) TALEN kaynaklı mutasyon mevcut olan (Şekil 2) olduğunu göstermektedir.
6. (İsteğe bağlı), daha önce tarif edildiği gibi ²⁹ Her bir bandın şiddeti değerini hesaplamak için jel analizi alet Fiji ³⁸ jel görüntüleri analiz ederek kesilmemiş ürünün yüzdesi belirlenerek yüzde mutasyon oranını hesaplar.
7. Ta jel ile saflaştırılmıştır sınırlama enzimi dirençli mutant bandını klonlamak ve klonlar, dizileme ile mutant alleli dizisini belirlemek.
   1. Jel kısıtlama üreticinin talimatlarına aşağıdaki dirençli mutant bant enzim arındırmak. TA üreticinin talimatlarına aşağıdaki bant klonlamak. koloniler ve çalkalama 37 ° C'de 1.5 ml LB O / N büyümekinkübatör.
   2. Üreticinin talimatları izleyerek Miniprep kültürleri. sıralaması için DNA gönder.
   3. Böyle maymun gibi bir program kullanarak, vahşi tip dizisine mutant dizileri aynı hizaya getirin.
      1. Kopyala ve APE dosyaları içine de dizileri yapıştırın. "Araçlar" menüsünden "Align İki Diziler" aracını seçin.
      2. Açılır menüleri kullanarak iki DNA dizilerini belirtin.
         Not: klonlanmış dizinin ters tamamlayıcı PCR klonlama vektörü içine çıktı yönüne bağlı olarak kullanılabilir gerekebilir. dizileri hizalamak yoksa, "Align DNA" kutusuna "Rev-Com" kutusunu işaretleyerek adımları tekrarlayın.
8. Uygun aşamada fenotipleri ve beklenen fenotip ²⁹ için uygun yöntemler (Örneğin, Şekil 3) kullanarak kurucu balık değerlendirin. fenotipleme yöntemleri protoc kullanılarak araştırmacı tarafından hedeflenen gen için beklenen fenotipin dayanacaktırol.

Germline İletimi için 6. Ekran

Not: A. mexicanustan 4-8 ayda cinsel olgunluğa erişirler.

1. vahşi tip balık cinsel olgunluğa kurucu balık çapraz.
2. Ekran embriyolar veya adımlar 5,1-5,7 yöntemleri kullanarak yetişkin balık (Şekil 4). Yetişkin balıklar için, kuyruk parçası anesthetization aşağıdaki kesilebilir.
   1. fin kırpma sırasında baskıyı azaltmak için tricaine (3-aminobenzoik asit etil ester) içindeki bir çözeltisi içinde balık daldırarak balık anestezisi. fin kırpma ardından, balık taze suya kurtarmak için izin verir. Balık hızla kurtarmak; onlar (normalde yüzme) iyileşene kadar gözleyin.

Sonuçlar

TALEN çifti enjeksiyonlar (NHEJ) birleştiren homolog olmayan uç boyunca tamir edilebilir iki iplikçikli sonları ³⁹ ile sonuçlanan, dolayısıyla Foki etki dimerizasyonunu spesifik DNA nükleotidini RVDs bağlanması ve sonuçlanır. NHEJ sık sık ekleme veya çıkarma (indeller) neden hataları tanıttı. Indeller TALEN hedef bölgesini çevreleyen bölgenin amplifiye edilmesi ve TALEN aralayıcı bölge içinde kesen bir sınırlama enzimi ile elde edilen ampl...

Tartışmalar

Büyük adımlar özelliklerin evrim genetik temelini anlamaya yönelik son yıllarda yapılmıştır. Özellikleri, bir dizi evrimi yatan aday gen belirlenmişse de, bunun nedeni en evrimsel ilginç türlerinin genetik tractability eksikliği, in vivo olarak, bu genlerin test etmek zor kalmıştır. Burada A. genom düzenleme için bir yöntem raporu mexicanustan, bir tür mağara hayvanların evrimi incelemek için kullandı. Genetik haritalama ^1,21,23 çalışmaları ve aday gen ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Thermocycler
Injection station
Gel apparatus
Needle puller
Nanodrop
Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies
Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated
Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0	Addgene	Kit #1000000024
Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated)	Fisher	BP9724-500
Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller	Fisher	BP1426-500
Teknova TET-15 in 50% EtOH	Teknova (ordered through Fisher)	50-843-314
Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents	Fisher	BP2957-1
Super Ampicillin (1,000x solution)	DNA Technologies	6060-1
ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use	Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)	FERR0941
IPTG, Fisher BioReagents	Fisher	BP1620-1
Petri dishes	Fisher	08-757-13
BsaI	New England Biolabs (ordered through Fisher)	50-812-203	Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)
BSA	New England Biolabs	provided with restriction enzymes
10x T4 ligase buffer	Promega (ordered through Fisher)	PR-C1263
GoTaq Green Master mix	Promega (ordered through Fisher)	PRM7123	Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly
Quick ligation kit	New England Biolabs (ordered through Fisher)	50-811-728	We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions
One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli	Invitrogen	C4040-06	Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used
Esp 3I	Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)	FERER0451
Plasmid-Safe ATP-dependent DNase	Epicentre (Ordered through Fisher)	NC9046399
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106	The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104
GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose	BioExpress	E-3119-125
Sac I	Promega (Ordered through Fisher)	PR-R6061
mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kit	Ambion	AM1348M
Rneasy MinElute Cleanup Kit	Qiagen	74204
NorthernMax-Gly Sample Loading Dye	Ambion (ordered through Fisher)	AM8551
Eliminase	Decon (ordered through Fisher)	04-355-32
Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur Pipets	Fisher	13-678-6B
Standard Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100-4
Microcaps	Drummond Scientific Company	1-000-0010
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector	Eppendorf (ordered through Fisher)	E5242956003
Sodium hydroxide	Fisher	S318-500
Tris base	Fisher	BP152-1