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Method Article
Gene-Targeting-Mutagenese ist nun möglich, in einem breiten Spektrum von Organismen unter Verwendung von Genom Bearbeitungstechniken. Hier zeigen wir ein Protokoll für eine gezielte Genmutagenese mit Talens (Talens) in Astyanax mexicanus, Fischarten , die Oberflächenfische und cavefish enthält.
Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.
die genetische Basis der Trait Evolution zu verstehen, ist ein kritischer Forschungsziel von Evolutionsbiologen. Es wurden beträchtliche Fortschritte bei der Identifizierung von Loci zugrunde liegenden , die Entwicklung von Merkmalen und Ortung Kandidatengene innerhalb dieser Loci (zB 1-3) hergestellt. Allerdings Funktionsprüfung die Rolle dieser Gene so viele Organismen, die für die Untersuchung der Evolution von Merkmalen verwendet geblieben ist herausfordernd sind derzeit nicht genetisch manipulierbaren. Das Aufkommen der Genome Editing-Technologien hat sich stark genetische Manipulierbarkeit von einem breiten Spektrum von Organismen erhöht. Transkriptionsaktivator-like Effektor Nukleasen (TALENS) und gruppierten regelmäßig kurzen palindromischen Repeats (CRISPRs) voneinander beabstandete haben gezielte Mutationen in Gene in einer Anzahl von Organismen zu erzeugen , verwendet (beispielsweise 4-11). Diese Werkzeuge, angewandt auf eine evolutionär relevante System, haben das Potenzial, die Art und Weise Evolutionsbiologen die genetische Grundlage der Evolution studieren, um zu revolutionieren.
Astyanax mexicanus ist eine Art der Fische, die in zwei Formen existiert: A. ein Fluss lebende Oberflächenform (surface Fisch) und mehrere höhlenbewohnenden Formen (cavefish). mexicanus cavefish von Oberflächenfische Vorfahren ( zusammengefasst in 12) entwickelt. Populationen von cavefish haben eine Reihe von Merkmalen , einschließlich Verlust von Augen, verringern oder Verlust der Pigmentierung entwickelt hat , eine erhöhte Anzahl von Geschmacksknospen und Schädelneuromasten und Veränderungen im Verhalten wie Verlust des Ausbildungsverhalten, erhöhte Aggression, Veränderungen in der Fütterung Haltung und hyperphagia 13 -19. Cavefish und Oberflächenfische sind interfertile und genetische Kartierung Experimente durchgeführt wurden Loci und Kandidatengene für Höhlen Züge 1,20-26 zu identifizieren. Einige Kandidatengene wurden für eine funktionelle Rolle in einen Beitrag zur Höhle Züge in der Zellkultur 1,19, in Modellorganismen anderer Arten 21 oder durch die Überexpression 27 oder transiente Knockdown u getestetMorpholinos 28 in A. singen mexicanus. Jedoch hat jedes dieser Verfahren Grenzen. Die Fähigkeit mutanten Allele dieser Gene in A. zu erzeugen mexicanus ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis ihrer Funktion in der Entwicklung der cavefish. Somit A. mexicanus ist ein idealer Kandidat Organismus für die Anwendung der Genombearbeitungstechnologien.
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Genom Bearbeitung in A. mexicanus mit Talens. Dieses Verfahren kann verwendet werden mosaic injizierten Gründer Fisch für Phänotypen zu bewerten und für Linien von Fischen mit stabilen Mutationen in Genen von Interesse 29 zu isolieren.
Alle Tier Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Iowa State University und der University of Maryland genehmigt.
1. TALEN Entwurf
2. TALEN Assembly (Geändert vom TALEN Kit Protocol) 33,34
Weitere Details und Fehlerbehebung finden Sie das Protokoll 34.
3. mRNA Transkription von Talens
4. Inject Astyanax mexicanus Embry mit TALEN mRNA
5. Phänotyps Gründer Fisch und TALEN Effizienz auswerten
6. Bildschirm Germline Transmission
Anmerkung: A. mexicanus Geschlechtsreife bei 4-8 Monaten erreichen.
TALEN Paar Injektionen Ergebnis der RVDS an spezifische DNA - Nukleotide in der Bindung und damit die Dimerisierung von FokI - Domänen, in Doppelstrangbrüche 39 führt , die durch nicht-homologe Ende repariert werden kann Beitritt (NHEJ). NHEJ führt häufig Fehler, die in Insertionen oder Deletionen (indels) zur Folge haben. Indels kann durch Amplifizieren der Region um die Website TALEN Ziel identifiziert werden, und das resultierende Amplikon mit einem Restriktio...
Große Fortschritte wurden in den letzten Jahren zum Verständnis der genetischen Grundlage der Entwicklung der Merkmale vorgenommen. Während Kandidatengene die Entwicklung einer Reihe von Merkmalen zugrundeliegenden identifiziert wurden, ist es schwierig geblieben , diese Gene in vivo zu testen , aufgrund des Fehlens von genetischen Lenkbarkeit der meisten evolutionarily interessante Arten. Hier berichten wir über ein Verfahren zur Genom Bearbeitung in A. mexicanus, eine Spezies verwendet , um die E...
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von der Abteilung für Genetik, Entwicklung und Zellbiologie und Iowa State University und von NIH Zuschusses EY024941 (WJ) .Dr finanziert. Jeffrey Essner Bemerkungen zu dem Manuskript.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Thermocycler | |||
Injection station | |||
Gel apparatus | |||
Needle puller | |||
Nanodrop | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Supplies | |||
Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated | |||
Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0 | Addgene | Kit #1000000024 | |
Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated) | Fisher | BP9724-500 | |
Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
Teknova TET-15 in 50% EtOH | Teknova (ordered through Fisher) | 50-843-314 | |
Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents | Fisher | BP2957-1 | |
Super Ampicillin (1,000x solution) | DNA Technologies | 6060-1 | |
ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use | Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) | FERR0941 | |
IPTG, Fisher BioReagents | Fisher | BP1620-1 | |
Petri dishes | Fisher | 08-757-13 | |
BsaI | New England Biolabs (ordered through Fisher) | 50-812-203 | Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol) |
BSA | New England Biolabs | provided with restriction enzymes | |
10x T4 ligase buffer | Promega (ordered through Fisher) | PR-C1263 | |
GoTaq Green Master mix | Promega (ordered through Fisher) | PRM7123 | Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly |
Quick ligation kit | New England Biolabs (ordered through Fisher) | 50-811-728 | We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions |
One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Invitrogen | C4040-06 | Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used |
Esp 3I | Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) | FERER0451 | |
Plasmid-Safe ATP-dependent DNase | Epicentre (Ordered through Fisher) | NC9046399 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol) |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose | BioExpress | E-3119-125 | |
Sac I | Promega (Ordered through Fisher) | PR-R6061 | |
mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kit | Ambion | AM1348M | |
Rneasy MinElute Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
NorthernMax-Gly Sample Loading Dye | Ambion (ordered through Fisher) | AM8551 | |
Eliminase | Decon (ordered through Fisher) | 04-355-32 | |
Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-6B | |
Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
Microcaps | Drummond Scientific Company | 1-000-0010 | |
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector | Eppendorf (ordered through Fisher) | E5242956003 | |
Sodium hydroxide | Fisher | S318-500 | |
Tris base | Fisher | BP152-1 |
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