JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ג'ין-מיקוד mutagenesis ניתן כיום במגוון רחב של אורגניזמים באמצעות טכניקות עריכה הגנום. הנה, אנחנו מדגימים פרוטוקול mutagenesis גן ממוקד באמצעות מפעיל שעתוק כמו nucleases המפעיל (TALENs) ב Astyanax mexicanus, זן של דגים הכולל דגי שטח cavefish.

Abstract

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Introduction

הבנת הבסיס הגנטי של אבולוצית תכונה היא מטרת מחקר ביקורתית של ביולוגים אבולוציוניים. התקדמות ניכרת כבר עשתה בזיהוי לוקוסים שבבסיס האבולוציה של תכונות ואיתור גני מועמדים בתוך לוקוסים אלה (למשל 1-3). עם זאת, מבחינה תפקודית לבחינת התפקיד של הגנים הללו נותר מאתגרים כמו אורגניזמים רבים המשמשים ללימוד האבולוציה של תכונות אינן כיום גנטי צייתניות. הופעתו של טכנולוגיות עריכת הגנום גדלה מאוד manipulability הגנטי של מגוון רחב של אורגניזמים. Nucleases מפעיל מפעיל דמוי תמלול (TALENs) ומקובצים interspaced בקביעות חזרות palindromic קצר (CRISPRs) שימשו כדי ליצור מוטציות ממוקדות בגנים בכמה אורגניזמים (למשל 4-11). כלים אלה, הוחלו על מחשב רלוונטי מבחינה אבולוציונית, יש פוטנציאל לחולל מהפכה באופן שבו ביולוגים אבולוציוניים ללמוד את הבסיס הגנטי של אבולוציה.

Astyanax mexicanus הוא מין של דג כי קיים בשתי צורות:. צורת משטח שוכני נהר (דגי שטח) וצורות המערה שוכני מרובים (cavefish) א cavefish mexicanus התפתח מאבותיהם דגי משטח (הנסקרת ב 12). אוכלוסיות של cavefish התפתחו מספר תכונות לרבות אובדן העיניים, להפחית או אובדן פיגמנטציה, גדל מספרם של בלוטות הטעם ואת neuromasts גולגולתי, ושינויים בהתנהגות כגון אובדן של התנהגות לימוד, תוקפנות מוגברת, שינויים האכלה ביציבה hyperphagia 13 -19. Cavefish ודגי שטח הם interfertile, וניסויי מיפוי גנטיים בוצעו לזיהוי גני לוקוסים ומועמד עבור תכונות מערות 1,20-26. כמה גני מועמדים נבדקו עבור תפקיד פונקציונלי בתרומת תכונות במערת תרבית תאי 1,19, באורגניזמים מודל של מינים אחרים 21 או על ידי ביטוי יתר 27 או מציאה חולפת uלשיר morpholinos 28 ב א mexicanus. עם זאת, כל אחת מהשיטות הללו יש מגבלות. היכולת ליצור אללים מוטנטים של גנים אלה א mexicanus הוא קריטי להבנת תפקידם באבולוציה של cavefish. לכן, א mexicanus הוא אורגניזם מועמד אידיאלי עבור יישום של טכנולוגיות עריכת הגנום.

כאן אנו מתארים שיטה לעריכה הגנום א mexicanus באמצעות TALENs. שיטה זו יכולה לשמש כדי להעריך דגי מייסד מוזרק פסיפס עבור פנוטיפים ו לבידוד קווי דג עם מוטציות יציבות בגני עניין 29.

Protocol

הנהלים כל חיה היו בהתאם להנחיות של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב ואושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש באוניברסיטת אייווה ואוניברסיטת מרילנד.

1. עיצוב Talen

  1. הקלט הרצוי רצף היעד לאתר אינטרנט עיצוב Talen. (לדוגמא: https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ). קלט נבחר spacer / חוזר אורכי מערך.
    1. העתק את רצף הגנום לתוך התיבה שכותרתה "רצף".
    2. בכרטיסייה "ספק Spacer אישית / RVD אורכי" לבחור את אורך spacer ואורך המערך.
      הערה: אורכי spacer של 15 זוגות בסיסים וחזור אורכי מערך של 15-17 העבודה היטב ולעשות הרכבה פחות מורכבת.
  2. בחר זוג Talen. זוגות Talen תוכנן סביב אתר אנזים הגבלה ייחודי לאפשר genotyping על ידי אנזים הגבלה מעכלמוצר ה- PCR.
  3. פריימרים עיצוב כדי להגביר את האזור הגנומי המקיפה את אתר היעד Talen באמצעות אתר אינטרנט כגון Primer3 30-32. כאשר genotyping עם אנזים הגבלה, יחל עיצוב כדי להגביר אזור שמכיל אתר אנזים ההגבלה רק פעם אחת. מומלץ שהאזור הזה מוגבר רצף לקראת בניית Talen לזהות כל פולימורפיזם נוכח א אוכלוסיית מעבדת mexicanus לשמש microinjection.

2. האסיפה Talen (שונה מן הפרוטוקול קיט Talen) 33,34

לפרטים ופתרון בעיות נוספות, ראה פרוטוקול 34.

  1. כן ורצף פלסמידים הדרושים מתוך הערכת Talen פי הוראות היצרן.
  2. הגדרת # 1 תגובות לתגובות A ו- B. כלול repeat-משתנה diresidues (RVDs) 1-10 ואת pFUS_A וקטור יעד א התגובה כלול RVDs 11- (N-1) ו היעד וקטור דואר pFUS_B (N-1) בתגובה B כאשר N הוא המספר הכולל של RVDs ב Talen.
    1. הוסף כל תגובה: 1 μl של כל פלסמיד המכיל כל RVD (100 ng / μl), וקטור היעד (100 ng / μl), 1 μl Bsa אני אנזים הגבלה, 1 μl שור סרום אלבומין (BSA) (2 מ"ג / מ"ל ), אנזים μl 1, 2 μl של חיץ x 10x אנזים μl של מים בהיקף כולל של 20 μl. לדוגמה, ראה טבלה 1.
      הערה: תגובות חצי יכולות לשמש גם.
    2. מניחים תגובות ב thermocycler ולהפעיל את מחזור: 10x (37 ° C / 5 דקות + 16 ° C / 10 דק ') + 50 ° C / 5 דקות + 80 ° C / 5 דקות.
  3. דגירת התגובות עם nuclease. לתגובה כל להוסיף 1 μl 25 מ"מ ATP ו 1 nuclease μl. דגירת תגובות על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
  4. Transform תגובות.
    1. Transform 2.5 μl של כל תגובה ל -25 μl תאים מוסמכים כימי.
      הערה: ג מוסמכות תוצרת ביתניתן להשתמש אמות. עם זאת, תאים עם יכולת נמוכה יכול לגרום חוסר מושבות.
      1. מערבבי 2.5 μl של התגובה עם 25 μl של תאים מוסמכים כימי. לדגור על קרח במשך חמש דקות. דגירת התאים למשך 30 שניות על 42 מעלות צלזיוס.
      2. מניחים את הצינורות על קרח במשך 2 דקות. להוסיף 125 μl של מרק סופר אופטימל עם דיכוי Catabolite (SOC). לנער את הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
    2. פלייט 100 μl של תאים טרנספורמציה לצלחות LB עם spectinomycin (50 מיקרוגרם / מ"ל), X-gal ו איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). לגדול O / N ב 37 מעלות צלזיוס.
  5. פיק 2-3 מושבות לבנות עבור כל תגובה ולבדוק ידי מושבת PCR באמצעות פריימרים pCR8_F1 ו pCR8_R1 (טבלה 2).
    1. הכן תערובת מאסטר של חומרים כימיים. לדוגמה, ראה טבלה 3.
    2. פיק מושבה ולמרוח אותו לתוך החלק התחתון של צינור PCR, ולאחר מכן הניח את שרידי המושבה לתוך 2 מ"ל LB עם spectinomycin(50 מיקרוגרם / מ"ל). מניחים 15 μl של מיקס מאסטר לתוך הצינור עם המושבה.
    3. הפעל את תכנית ה- PCR הבאה (לוח 4)
    4. בדוק את ה- PCR (להפעיל את כל נפח) על ג'ל 1.5% agarose על ידי אלקטרופורזה. המשובטים הנכונים יהיו להקה בגודל הצפוי וכן למרוח וסולם של להקות. דוגמא המריחה המתאימה, ראה 34,33.
    5. לגדול 2 מיליליטר תרבויות של השיבוטים הנכונים O תקשורת LB / N ב 37 מעלות צלזיוס חממה רועדת.
  6. Miniprep פלסמידים פי הוראות היצרן.
  7. רצף לבדוק רצף Talen עם pCR8_F1 ו pCR8_R1. עקוב שיטות שתוארו קודם לכן 35.
  8. באמצעות השיבוטים הנכונים מאומתים על ידי רצף, להגדיר את התגובה # 2 (ערכת Talen), אשר יעמיד את RVDs מן וקטורי A ו- B ואת RVD הסופי לתוך וקטור היעד.
    1. הכן תערובת תגובה 2 (לוח 5).
      הערה: Haניתן להשתמש תגובות LF.
    2. מניחים את התגובות ב thermocycler ולהפעיל את התוכנית הבאה: 37 ° C / 10 דק '+ 16 ° C / 15 דק' + 37 ° C / 15 דק '+ 80 ° C / 5 דקות.
  9. Transform תגובות.
    1. Transform 2.5 μl של כל תגובה ל -25 μl תאים מוסמכים כימי.
      1. מערבבי 2.5 μl של התגובה עם 25 μl של תאים מוסמכים כימי. דגירה על קרח למשך 5 דקות. מחממים לזעזע את התאים למשך 30 שניות על 42 מעלות צלזיוס.
      2. מניחים את הצינורות על הקרח. להוסיף 125 μl של SOC. מניחים את הצינורות בתוך חממה רועד ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
    2. פלייט 100 μl של תאים טרנספורמציה לצלחות LB עם אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל), X-gal ו IPTG. לגדול O / N ב 37 ° C.
  10. פיק 1-3 מושבות לבנות עבור כל תגובה ולבדוק ידי מושבת PCR באמצעות פריימרים TAL_F1 ו TAL_R2 (טבלה 2).
    1. בצע פתרון של פולימראז mastermix, מים פריימרים כמוכמתואר בטבלה 3. פיק מושבה ולמרוח אותו לתוך החלק התחתון של צינור PCR, ולאחר מכן הניח את שרידי המושבה לתוך 2 מ"ל LB עם אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל). מניחים 15 μl של פתרון לתוך הצינור עם המושבה.
    2. הפעל את תוכנית ה- PCR (לוח 6).
    3. בדוק את ה- PCR על ג'ל 1.5% agarose על ידי אלקטרופורזה. המשובטים הנכונים יהיו מריחות וסולם של להקות. דוגמא המריחה המתאימה, ראה 34,33.
    4. לגדול 2 מיליליטר תרבויות של השיבוטים הנכונים O תקשורת LB / N ב 37 מעלות צלזיוס חממה רועדת.
  11. Miniprep פלסמידים פי הוראות היצרן.
  12. רצף לבדוק רצף Talen עם TAL_F1 ו TAL_R2 הבאים השיטות שתוארו קודם לכן 35.

3. mRNA תמלול של TALENs

  1. תקציר 4 מיקרוגרם של תבנית מאומת רצף עם 2 μl Sac לי עבור שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס.
  2. הפעל 2 μl של פלסמיד מתעכל לי Sac על ג'ל agarose 1.5% על ידי אלקטרופורזה. פלסמידים כי מתעכלים כראוי יציג להקה אחת.
  3. לטהר את Sac הנותרים פלסמיד I-מתעכל בעקבות פרוטוקול ערכת טיהור PCR. שטפו פעמיים עם הפתרון לשטוף לפני elution. Elute לתוך 30 μl מים nuclease חינם.
  4. בצע את הפרוטוקול הסטנדרטי לייצור mRNA T3.
    1. הגדרת תגובות במחצית באמצעות 0.5 מיקרוגרם של תבנית לינארית (מוכן לעיל). לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
    2. הוסף 0.5 μl של DNase (כלול בערכה) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  5. לטהר את ה- mRNA, בעקבות הוראות היצרן. Elute לתוך 30 מים μl nuclease חינם.
  6. הפעל ג'ל agarose 1.5% על ידי אלקטרופורזה כדי לבדוק את ה- mRNA.
    1. נקו את מנגנון ג'ל עם מוצר כדי למנוע זיהום RNase ואת להכין ג'ל 1.2%.
    2. מערבבים 1 mRNA μl + 4 &# 181; l nuclease ללא מים + 5 μl טעינת glyoxyl לצבוע. דגירת דגימות ב 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. צנטריפוגה צינורות בקצרה ומניחים על קרח לפני הפעלת הג'ל.
  7. בדוק את הריכוז באמצעות שיטה לכימות ריכוזי חומצת גרעין ולאחסן רנ"א aliquots ב -80 מעלות צלזיוס. בחר גודל aliquot כך RNA הוא לא קפוא / מופשר יותר מפעם אחת.
    הערה: ריכוזים של 500-1,000 ng / NL בדרך כלל מתקבלת. RNA עם ריכוז נמוך יותר יכול לשמש עוד בתור שלמות RNA נשמרת (כפי שהוערך על ידי להקה ולא למרוח על הג'ל).

4. להזריק Astyanax עוברים mexicanus עם Talen mRNA

  1. כן כלים להזרקה.
    1. יוצקים צלחות הזרקת ידי שפיכת agarose 1.2% במים דגים (מים ממוזגים עם סודיום ביקרבונט ומלח ים pH 7.4 ומוליכות 700 מיקרו-שניות) לתוך צלחת פטרי. מניחים תבנית (חתיכת פלסטיק עם תחזיות לעשות בארות לדגיםביצים) בתוך הצלחת. הסר את התבנית כאשר agarose קשיח ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. לפרטים על העובש לראות 36.
    2. משוך מחטים להזרקה באמצעות חולץ מחט על פי הוראות היצרן.
      הערה: אורך המחט מתאים חשוב לקבל זריקה. מחטים כי הם יותר מדי זמן תהיינה גמישות מדי זריקות. הפרוטוקול עבור מחטים משייכות ישתנה בהתאם לציוד המשמש למשוך מחטים. דוגמא מחט מתאים מוצגת באיור 1. עבור הציוד שלנו, אנחנו נוציא מחטים כי הם 5-6 סנטימטר אורך, ויש להם קוטר חיצוני בקצה של כ 0.011 מ"מ כאשר שבור. עם זאת, צריך להיות מכויל מחטים (שלב 4.3.4) כדי לקבוע רוחב הפתיחה. תוכנית לדוגמה עבור משיכת מחטים ניתן למצוא בלוח 7.
    3. כן טפטפות זכוכית עבור עוברים על ידי שבירת פיפטה כך הפתח גדול מספיק עבור ביצה לעבור. להבת הסוף נשבר עדזה כבר לא חד.
      הערה: חשוב להשתמש טפטפות זכוכית וקערות זכוכית כשעובדים עם א ביצים ועובר mexicanus כפי שהם דביקים ידבקו פלסטיק.
  2. איסוף ביצי שלב 1 תאים.
    1. בריד א mexicanus הבא פרוטוקולים סטנדרטיים 37.
      הערה: לדוגמה, אם הדגים נשמרים על 14 אור: חושך מחזור 10 ושימוש זמן Zeitgerber (ZT) עם ZT0 כמו האורות ZT14 כמו באורות כבויים, שרצים דגים השטח שלנו בין ZT15 ו ZT19. זמן השרצה מדויק צריך להיקבע עבור כל מעבדת פרט.
    2. להשרות השרצה ידי האכלת יתר דגים במשך 3-4 ימים לפני ההזדווגות והצבת דגים למים מתוקים. הרם את F ° טמפרטורה 2. הערה: טמפרטורת המים הראשונית שלנו היא כ -74 מעלות צלסיוס.
    3. איסוף ביצי דגי משטח בחושך, בדיקה כל 15 דקות כדי להשיג ביצים בשלב התא 1. מאות ביצים ניתן להשיג זוג אחד של דגים לפני השטח.
    4. לאסוףביצים בקערות זכוכית כדי למנוע הידבקות כדי משטחי פלסטיק ולמיין לבודד עוברים בשלב 1 תאים לפני ההזרקה ידי התבוננות ביצים תחת המיקרוסקופ ואיסוף ביצים שאינן תא בודד. שמור ביצים במי מערכת טריות (מכל מים שבו דגים בוגרים הם שוכנו, אשר טופלו על pH ומוליכות).
  3. להזריק Talen mRNA.
    1. להזריק כמויות שונות של mRNA הכולל (כמויות שוות של כל Talen בצמד) כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי להזרקה כמו רעילות ויעילות להשתנות לפי זוג Talen. התחל על ידי הזרקה בריכוזים של mRNA הכולל כי הם 400-800 pg. לדלל ולשלב mRNA לריכוזים רצויים להזרקת 1.5 nl.
    2. טען בדילול mRNA לחלק האחורי של המחט ולצרף את המחט אל-מזרק מיקרו.
    3. לשבור את המחט באמצעות מלקחיים.
    4. כייל את המחט. לדוגמה, להוציא 10 פעמים ולאסוף כך ירידת נימי מיקרו. במשך 10 x 100 הפנויה 1.081; l, 32 נימי מיקרו מ"מ, הירידה צריך למלא את נימי מיקרו 0.5 מ"מ עבור 1.5 הזרקת NL / 1. התאם את זמן ההזרקה ולחץ לפי צורך.
    5. הכנס את המחט לתוך התא הבודד ולהזריק את ה- mRNA. להזריק את ה- mRNA ישירות לתוך התא, לא בחלמון.
    6. איסוף עוברים מוזרק בקערות זכוכית. שמור עובר על 23-25 ​​מעלות צלזיוס. הסר עוברים מתים (עוברי כי לְהִתְעַנֵן בעל צורה בלתי מוגדרת) בקביעות בימים הראשונים לאחר ההזרקה. מספר שיא של עוברים מתים ומעוותים משליטה (uninjected) וצלחות מוזרקות.
      הערה: ריכוז mRNA מוגבר עלול להוביל רעילות מוגברת עיוות / מוות של עוברים. לכן, רעיל לעומת יעילות חייב להיות מאוזן כדי לקבוע את הריכוז הטוב ביותר של mRNA להזריק.

דגי מייסד הפנוטיפ 5. הערכה יעילה Talen

  1. להקריב עובר על פי פרוטוקול חיה מוסדי.
    הערה: אנו להרדיםהעובר על ידי מהיר מצמרר על קרח.
  2. איסוף עוברים לתוך צינורות רצועת 0.8 μl PCR בעזרת פיפטה ההעברה.
    הערה: Genotyping יכול להתבצע על עוברי אדם או ברכות של עוברים.
  3. תמצית ה- DNA.
    1. עוברים מקום לתוך 100 μl 50 הידרוקסיד מ"מ נתרן (NaOH) ו לדגור על 95 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ולאחר מכן לצנן עד 4 מעלות צלזיוס.
    2. להוסיף 1/10 נפח ה (10 μl) של 1 M טריס- HCl pH 8.
  4. בצע PCR על האזור באמצעות פריימרים המיועדים בשלב 1.3 (ראה לוחות 8 ו -9 בפרוטוקולים מדגמים). עבור עוברי בודדים 1 μl של ה- DNA הוא מספיק עבור תגובת PCR.
  5. לעכל את מוצר ה- PCR המתקבל עם אנזים ההגבלה המתאים ולהפעיל ג'ל agarose 1.5% על ידי אלקטרופורזה.
    1. לדוגמה, עבור genotyping לבקנות 2 oculocutaneous (oca2) מוקד בעוברים מוזרק לעכל את מוצר ה- PCR באמצעות אנזים הגבלה בסר לי על ידי הוספת 0.5 Μl של בסר I היישר 12.5 μl של תגובת PCR הושלמה, דוגרים על 65 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. הפעל את מעוכלים והמוצר מתעכל על ג'ל. הגבלת להקות עמידות אנזים (כלומר, להקות שאינו לעכל) עולות כי מוטציות נגרמות Talen נוכח (איור 2).
  6. (אופציונאלי) לחשב את שיעור אחוז המוטציה על ידי קביעת האחוז מהתוצר נימול על ידי ניתוח תמונות של ג'לים פיג'י 38 באמצעות כלי ניתוח ג'ל לחישוב שווי האינטנסיביות של כל להקה כפי שתואר לעיל 29.
  7. לקבוע את הרצף של אללים מוטנטים ידי ת"א שיבוט להקת המוטציה העמידה אנזים הגבלה מטוהרת ג'ל וסדר שיבוטים.
    1. ג'ל לטהר את הגבלת אנזים להקת מוטציה עמידה בעקבות הוראות היצרן. ת"א לשכפל את הלהקה בעקבות הוראות היצרן. פיק מושבות ולגדול ב 1.5 מיליליטר LB O / N ב 37 מעלות צלזיוס רועדותמַדגֵרָה.
    2. תרבויות Miniprep בעקבות הוראות היצרן. שלח את ה- DNA עבור סידור.
    3. באמצעות תוכנית כגון APE, יישר את רצפי מוטנטי על פני רצף wildtype.
      1. העתק והדבק את שני הרצפים לתוך קבצי APE. בחר באפשרות "יישור שני רצפים" מתפריט "כלים".
      2. ציין שני רצפי DNA באמצעות התפריטים הנפתחים.
        הערה: השלמה הפוכה של רצף משובטים ייתכן שיהיה צורך להשתמש בהתאם לכיוון PCR נכנס וקטור שיבוט. אם רצפים לא ליישר, חזור על שלבים סימון התיבה "Rev-Com" בתיבת "יישר DNA".
  8. מייסד דגי ערך במשך פנוטיפים בשלב מתאים ושימוש בשיטות מתאימות עבור הפנוטיפ הצפוי 29 (לדוגמא, איור 3). שיטות phenotyping יתבסס על הפנוטיפ הצפוי הגן ממוקד על ידי החוקר באמצעות protocol.

6. מסך עבור הילוכים germline

הערה: א mexicanus מגיע לבגרות מינית בגיל 4-8 חודשים.

  1. לחצות לבגרות מינית מייסד דגי דגי סוג ברים.
  2. עובר מסך או דגים בוגרים בשיטות בצעדים 5.1-5.7 (איור 4). עבור דגים בוגרים, חתיכת הזנב יכול להיות מקוטע הבאים הרדמה.
    1. להרדים דגים על ידי השריית הדג בתמיסה של tricaine (אתיל אסתר חומצה 3-aminobenzoic) כדי להפחית את הלחץ במהלך גזיר סנפיר. בעקבות גזיר סנפיר, לאפשר דגים להתאושש במים מתוקים. דגים להתאושש במהירות; להתבונן עד שהם התאוששו (שוחים בדרך כלל).

תוצאות

זריקות זוג Talen לגרום מחייב של RVDs כדי דנ"א ספציפי ובכך dimerization של תחומי FokI, וכתוצאה מכך הפסקות גדילים כפולות 39 אשר ניתן לתיקון באמצעות קצה שאינו הומולוגי שהצטרף (NHEJ). NHEJ לעתים קרובות מציג שגיאות שיוצרות תוספות או השמטות (indels). Indels ניתן לזהות...

Discussion

צעדים גדולים נעשו בשנים האחרונות כלפי בהבנת הבסיס הגנטי של האבולוציה של תכונות. בעוד גני מועמדים שבבסיס האבולוציה של מספר התכונות זוהו, היא נותרה מאתגרת לבדוק גנים אלה in vivo בשל חוסר העקיבות גנטית של מינים המעניינים ביותר מבחינה אבולוציונית. כאן אנו מדווחים על ש?...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי המחלקה לגנטיקה, פיתוח ביולוגיה של התא ו איווה סטייט ועל ידי EY024941 מענק NIH (WJ) .Dr. ג'פרי Essner ספק הערות על כתב היד.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Thermocycler
Injection station
Gel apparatus
Needle puller
Nanodrop
NameCompanyCatalog NumberComments
Supplies
Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated
Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0AddgeneKit #1000000024
Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated)FisherBP9724-500
Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, MillerFisherBP1426-500
Teknova TET-15 in 50% EtOHTeknova (ordered through Fisher)50-843-314
Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagentsFisherBP2957-1
Super Ampicillin (1,000x solution)DNA Technologies6060-1
ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-useThermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)FERR0941
IPTG, Fisher BioReagentsFisherBP1620-1
Petri dishesFisher08-757-13
BsaINew England Biolabs (ordered through Fisher)50-812-203Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)
BSANew England Biolabsprovided with restriction enzymes
10x T4 ligase bufferPromega (ordered through Fisher)PR-C1263
GoTaq Green Master mixPromega (ordered through Fisher)PRM7123Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly
Quick ligation kitNew England Biolabs (ordered through Fisher)50-811-728We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions
One Shot TOP10 Chemically Competent E.coliInvitrogenC4040-06Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used
Esp 3IThermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)FERER0451
Plasmid-Safe ATP-dependent DNaseEpicentre (Ordered through Fisher)NC9046399
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104
GeneMate LE Quick Dissolve AgaraoseBioExpressE-3119-125
Sac IPromega (Ordered through Fisher)PR-R6061
mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kitAmbionAM1348M
Rneasy MinElute Cleanup KitQiagen74204
NorthernMax-Gly Sample Loading Dye Ambion (ordered through Fisher)AM8551
EliminaseDecon (ordered through Fisher)04-355-32
Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur PipetsFisher13-678-6B
Standard Glass CapillariesWorld Precision Instruments1B100-4
MicrocapsDrummond Scientific Company1-000-0010
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet MicroinjectorEppendorf (ordered through Fisher)E5242956003
Sodium hydroxideFisherS318-500
Tris baseFisherBP152-1

References

  1. Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nat Genet. 38 (1), 107-111 (2006).
  2. Hoekstra, H. E., Hirschmann, R. J., Bundey, R. A., Insel, P. A., Crossland, J. P. A single amino acid mutation contributes to adaptive beach mouse color pattern. Science. 313 (5783), 101-104 (2006).
  3. Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
  4. Liu, J., et al. Efficient and specific modifications of the Drosophila genome by means of an easy TALEN strategy. J Genet Genomics. 39 (5), 209-215 (2012).
  5. Bannister, S., et al. TALENs mediate efficient and heritable mutation of endogenous genes in the marine annelid Platynereis dumerilii. Genetics. 197 (1), 77-89 (2014).
  6. Lei, Y., et al. Efficient targeted gene disruption in Xenopus embryos using engineered transcription activator-like effector nucleases (TALENs). Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17484-17489 (2012).
  7. Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
  8. Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
  9. Ansai, S., et al. Efficient targeted mutagenesis in medaka using custom-designed transcription activator-like effector nucleases. Genetics. 193 (3), 739-749 (2013).
  10. Zhang, X., et al. Isolation of doublesex- and mab-3-related transcription factor 6 and its involvement in spermatogenesis in tilapia. Biol Reprod. 91 (6), 136 (2014).
  11. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  12. Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evol Biol. 12, 105 (2012).
  13. Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces) - support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
  14. Teyke, T. Morphological differences in neuromasts of the blind cave fish Astyanax hubbsi and the sighted river fish Astyanax mexicanus. Brain Behav Evol. 35 (1), 23-30 (1990).
  15. Schemmel, C. Genetische Untersuchungen zur Evolution des Geschmacksapparates bei cavernicolen Fischen. Z Zool Syst Evolutionforsch. 12, 196-215 (1974).
  16. Burchards, H., Dolle, A., Parzefall, J. Aggressive behavior of an epigean population of Astyanax mexicanus (Characidae, Pisces) and some observations of three subterranean populations. Behavioral Processes. 11, 225-235 (1985).
  17. Parzefall, J., Fricke, D. Alarm reaction and schooling in population hybrids of Astyanax fasciatus (Pisces, Characidae). Memoires e Biospeologie. , 29-32 (1991).
  18. Schemmel, C. Studies on the Genetics of Feeding Behavior in the Cave Fish Astyanax mexicanus F. anoptichthys. Z. Tierpsychol. 53, 9-22 (1980).
  19. Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (31), 9668-9673 (2015).
  20. Protas, M., et al. Multi-trait evolution in a cave fish, Astyanax mexicanus. Evol Dev. 10 (2), 196-209 (2008).
  21. Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genet. 5 (1), e1000326 (2009).
  22. Yoshizawa, M., Yamamoto, Y., O'Quin, K. E., Jeffery, W. R. Evolution of an adaptive behavior and its sensory receptors promotes eye regression in blind cavefish. BMC Biol. 10, 108 (2012).
  23. Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish Astyanax mexicanus. PLoS One. 8 (2), 57281 (2013).
  24. Kowalko, J. E., et al. Convergence in feeding posture occurs through different genetic loci in independently evolved cave populations of Astyanax mexicanus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), 16933-16938 (2013).
  25. Kowalko, J. E., et al. Loss of Schooling Behavior in Cavefish through Sight-Dependent and Sight-Independent Mechanisms. Curr Biol. , (2013).
  26. Gross, J. B., Krutzler, A. J., Carlson, B. M. Complex craniofacial changes in blind cave-dwelling fish are mediated by genetically symmetric and asymmetric loci. Genetics. 196 (4), 1303-1319 (2014).
  27. Yamamoto, Y., Stock, D. W., Jeffery, W. R. Hedgehog signalling controls eye degeneration in blind cavefish. Nature. 431 (7010), 844-847 (2004).
  28. Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS One. 8 (11), e80823 (2013).
  29. Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS One. 10 (3), e0119370 (2015).
  30. Untergrasser, A., Cutcutache, I., Koressaar, T., Ye, J., Faircloth, B. C., Remm, M., Rozen, S. G. Primer3- new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), 115 (2012).
  31. Koressaar, T., Remm, M. Enhancements and modifications of primer design program Primer3. Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).
  32. Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (12), 82 (2011).
  33. . Addgene. Golden TALEN assembly Available from: https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/98/5a/985a6117-7490-4001-8f6a-24b2cf7b005b/golden_gate_talen_assembly_v7.pdf (2011)
  34. A device to hold zebrafish embryos during microinjection. ZFIN Protocol Wiki Available from: https://wiki.zfin.org/display/prot/A+Device+To+Hold+Zebrafish+Embryos+During+Microinjection (2009)
  35. Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
  36. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  37. Bitinaite, J., Wah, D. A., Aggarwal, A. K., Schildkraut, I. FokI dimerization is required for DNA cleavage. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10570-10575 (1998).
  38. Elipot, Y., et al. A mutation in the enzyme monoamine oxidase explains part of the Astyanax cavefish behavioural syndrome. Nat Commun. 5, 3647 (2014).
  39. McGaugh, S. E., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nat Commun. 5, 5307 (2014).
  40. Yoshizawa, M., Goricki, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Curr Biol. 20 (18), 1631-1636 (2010).
  41. Blackburn, P. R., Campbell, J. M., Clark, K. J., Ekker, S. C. The CRISPR system--keeping zebrafish gene targeting fresh. Zebrafish. 10 (1), 116-118 (2013).
  42. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  43. Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
  44. Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Dev Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
  45. Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. Central role for the lens in cave fish eye degeneration. Science. 289 (5479), 631-633 (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

112Astyanax mexicanusAstyanaxCavefishTALENsTalen

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved