فحوصات لتدهور تتجمع البروتينات في الخلايا

Summary

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

Abstract

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

Introduction

البروتينات هي الجزيئات الأكثر وفرة في الخلايا، وأنها تلعب دورا أساسيا في جميع العمليات الحيوية تقريبا. النشاط البيولوجي لمعظم البروتينات يتطلب قابلة للطي وبياناتهم إلى والمحافظة عليها، والأم هياكل ثلاثية الأبعاد. البروتينات مع التشكل الشاذة ليس فقط على فقدان وظائفهم العادية، ولكن أيضا في كثير من الأحيان تشكل الأنواع بلازميدة قليلة القسيمات القابلة للذوبان أو المجاميع التي تعوق وظائف بروتينات أخرى، وهي مواد سامة للخلايا ^1،2. لمواجهة misfolding البروتين وخلايا توظف كل من المحرمين الجزيئية، التي تساعد البروتينية المطوية أو مطوية جزئيا للوصول إلى التشكل وطنهم، ومسارات التحلل، والتي تزيل البروتينات تتجمع ^3. نظرا لتعقيد وطبيعة العشوائية لعملية قابلة للطي، والبروتين misfolding أمر لا مفر منه، وأنه قد لا يكون عكس في حالة من الطفرات، وأخطاء السكروز، والأضرار بعد متعدية ^1. وبالتالي، فإن الخلايا تعتمد في نهاية المطاف على degradatمسارات أيون للحفاظ على نوعية البروتين.

وشدد على أهمية مراقبة الجودة البروتين الخلوي (PQC) نظم من قبل انتشار الأمراض misfolding البروتين، بما في ذلك السرطان والسكري والعديد من الأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون، التصلب الجانبي الضموري، مرض هنتنغتون (HD)، و الرنح النخاعي المخيخي (SCA) ^4،5. على سبيل المثال، والطفرات في البروتين p53 الكابتة للورم هي الآفة الأكثر الوراثية في كثير من الأحيان واحدة في الأورام، ويرتبط مع ~ 50-70٪ من جميع حالات ^6. وجزء كبير من الطفرات البروتين p53 والطفرات مغلطة التي تغير التشكل من البروتين p53، مما يؤدي إلى تشكيل المجاميع ^7. علاوة على ذلك، وراثيا ومرضي البروتينات المرتبطة مع مساحات polyQ موسع مع HD وهيئة السلع التموينية. هذه الأمراض التقدمية وغالبا مميتة واضح عندما يتجاوز طول امتداد polyQ في البروتينات المتضررة معينة thresعقد، وتصبح شديدة على نحو متزايد على طول امتداد polyQ يطيل ^8.

مقاربة جذابة لعلاج هذه الأمراض هو تعزيز علاجيا أنظمة PQC الخلوية، وخصوصا مسارات التحلل. ومع ذلك، فإن الممرات المشتركة في تدهور البروتينات التالفة، ولا سيما في خلايا الثدييات، لا تزال غير مفهومة. وعلى الرغم من الاعتراف بأن proteasome ومهم للغاية لتحلل البروتينات تتجمع، تبقى مسألة حيوية غير محددة: كيف البروتينات تتجمع معترف بها على وجه التحديد والمستهدفة للتدهور. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن أنظمة PQC تم تحديدها في مقصورات الخلوية بما في ذلك السيتوبلازم، الشبكة الإندوبلازمية، والحبيبات الخيطية، لا تزال أنظمة PQC في نواة واضحة ^2.

وقد حددت الدراسات الأخيرة التي مختبرنا نظام يعترف ويحط مجموعة متنوعة من البروتينات تتجمع في النواةخلايا الثدييات من ^9. ويتألف هذا النظام من البروتين البرولمفوسيت (الرابطة الاسلامية الباكستانية)، وهو بروتين النووي وعضوا في أسرة البروتين الثلاثية التي تحتوي على عزر (TRIM)، وRNF4، حلقة المجال تحتوي على البروتين. حزب الرابطة الاسلامية، والعديد من البروتينات TRIM أخرى، تمتلك سومو (صغير مثل اليوبيكويتين معدل) E3 النشاط يغاز، مما يسهل خصوصية وكفاءة البروتين SUMOylation ^10. RNF4 ينتمي إلى مجموعة صغيرة من ligases اليوبيكويتين المستهدفة سومو (STUbL)، التي تحتوي على واحد أو أكثر من الزخارف-التفاعل السومو (بالمشترك) بالإضافة إلى المجال RING التي تتيح لهم النشاط يغاز اليوبيكويتين ^11. وجدنا أن حزب الرابطة الاسلامية تعترف تحديدا البروتينات تتجمع من خلال مواقع التعرف على الركيزة المنفصلة التي يمكن أن نتبين سمات مميزة على البروتينات تتجمع. على الربط، والعلامات حزب الرابطة الاسلامية تتجمع البروتينات مع بولي سلاسل من SUMO2 / 3، اثنين من البروتينات SUMO الثدييات متطابقة تقريبا التي يمكن أن تشكل بولي سلاسل بسبب وجود موقع SUMOylation الداخلي. Sثم يتم التعرف على البروتينات تتجمع UMOylated التي كتبها RNF4، الأمر الذي يؤدي إلى ubiquitination وproteasomal تدهورها. أثبتنا أيضا أن نظام حزب الرابطة الاسلامية-RNF4 مهم للحماية من التنكس العصبي، ونقص في حزب الرابطة الاسلامية يفاقم من العيوب السلوكية وعصبية مرضية من نموذج الفأر من نوع SCA 1 (SCA1) ^9.

للتمييز تدهور البروتين من الآليات الخلوية الأخرى التي يمكن أن تنظم مستويات البروتين، تم قياس معدلات دوران البروتين ^9. من بين الأساليب الأكثر استخداما لتحديد دوران البروتين هي مطاردة النبض وسيكلوهيكسيميد (فروج) مطاردة. هاتين الطريقتين تدرس على مر الزمن، على التوالي، والبروتينات وصفت النظائر المشعة من الاهتمام في خلايا الترجمة يتقن ومجموع البروتينات الموجودة مسبقا من الفائدة في الخلايا تحول دون ترجمة. ومع ذلك، تحديا كبيرا لدراسة البروتينات المسببة للأمراض وعرضة للmisfolding هو أن عمر النصف لهذه البروتينات يمكن أن يكون لو للغايةنانوغرام. على سبيل المثال، Ataxin-1، Ataxin-7، هنتنغتين، ألفا-synuclein، وTDP-43 جميعا حياة نصف من أكثر من 12 إلى 24 ساعة ^9،12-16. معدلات دوران بطيئة من هذه البروتينات تمنع استخدام تحليل فروج مطاردة لأن الخلايا إيواء هذه البروتينات قد لا البقاء على قيد الحياة لفترة طويلة تثبيط الترجمة، خصوصا لأن البروتينات تتجمع أنفسهم يمكن أن تكون شديدة السمية للخلايا. تحليل نبض مطاردة مع وضع العلامات النظائر قد يكون أيضا تحديا للبروتينات التي تكون عرضة تجميع-للغاية. معظم فحوصات نبض مطاردة تعتمد على مناعي لفصل البروتين من الاهتمام من جميع البروتينات الأخرى التي هي أيضا المسمى بالإشعاع. ويشمل هذا الإجراء عادة مناعي وغسل الإجراءات المطولة خلالها المجاميع SDS-غير قابلة للذوبان يمكن أن تشكل، مما يجعل تحليل مع SDS-PAGE الكهربائي غير دقيقة.

هنا بروتوكول لتحليل البروتينات تتجمع النووية مع يوصف معدل دوران بطيء ⁹. ويستخدم شكلهما من Ataxin-1 (Atxn1) الذي يحتوي على امتداد 82 glutamines (Atxn1 82Q) لهذا الغرض ^(8). عندما أعرب في الخلايا، وتعزيز الخضراء بروتين فلوري (GFP) انصهار أشكال Atxn1 82Q مجهريا شوائب مرئية في نواة (الشكل 1A). ويكشف تحليل نبض مطاردة أن نصف عمر Ataxn1 82Q هي أكثر من 18 ساعة ^9. يتكون Atxn1 82Q الأنواع مع التشكل تتجمع من خصائص مختلفة، فضلا عن الأنواع مع التشكل الأصلي. ومن المرجح أن هذه الأنواع تدهور بمعدلات مختلفة، وبالتالي يجب أن يتم تحليلها بشكل منفصل. لست] من Atxn1 82Q، معربا عن GFP ومجزأة الخلايا في NP-40 للذوبان (قابل للذوبان أو NS، من المرجح أن تمثل البروتينات الأم أو البروتينات أحادى / بلازميدة قليلة القسيمات تتجمع) و (NI، مجمعة / تتجمع) أجزاء NP-40-غير قابلة للذوبان. هذا الأخير يمكن تقسيمها الى مزيد من SDS للذوبان (SS، ومن المحتمل المجاميع المختلين) أو SDS مقاومة (SR، الألياف اميلويد المرجح) كسور (الشكل 1B). ويمكن تحليل NS و SS الكسور SDS-PAGE تليها النشاف الغربي، في حين يمكن أن يتم الكشف عن جزء ريال عن طريق فحوصات مرشح التخلف تليها immunoblotting. يتم الجمع بين فروج مطاردة مع أسلوب تجزئة المنظفات، واكتشفوا أن نصف عمر SS Atxn1 82Q أقصر بكثير من NS Atxn1 82Q ومجموعه Atxn1 82Q (الشكل 2A)، مشيرا إلى أن جزء SS يمكن التعرف بسهولة وتتحلل في الخلايا ^9. وهكذا، وهذه الطريقة توفر أداة قوية لدراسة ديناميات البروتينات تتجمع ومقارنة نمط تدهورها.

وصفنا أيضا الأسلوب الذي هو مناسبة لفحص إنتاجية عالية لتحديد الجزيئات أو المركبات الصغيرة التي يمكن أن تعدل تدهور البروتينات تتجمع. ويستند هذا الأسلوب على متحولة مزعزع conformationally من وسيفيراز يراعة (LucDM) ^17، ركيزة نموذج كوصي. لدينا الصماماتد LucDM إلى إشارة توطين النووية (NLS) للتحقيق في أنظمة PQC في هذا الحيز الخلوية، وGFP (NLS-LucDM-GFP) لتسهيل الكشف. أشكال NLS-LucDM-GFP مجهريا المجاميع النووية واضحة في نسبة صغيرة من الخلايا (الشكل 3A). على غرار Atxn1 82Q، NLS-LucDM-GFP، ولكن ليس في البرية من نوع نظيره NLS-LucWT-GFP-يتم تعديل من قبل SUMO2 / 3 والتي تخضع لرقابة مسار حزب الرابطة الاسلامية-RNF4 ^9. كما يشكل NLS-LucDM-GFP SS والأنواع ريال، على الرغم من أن كميات النسبية لقوات الأمن الخاصة والأنواع ريال ضئيلة مقارنة NS، وذلك باستخدام الشروط الواردة في بروتوكول 3 أدناه. لتبسيط الفحص، نقوم بتحليل فقط SDS LucDM للذوبان (بما في ذلك كل من NS وكسور SS) بواسطة SDS-PAGE وصمة عار الغربية. الأهم من ذلك، أظهر فروج مطاردة الفحص أن نصف عمر SDS للذوبان NLS-LucDM-GFP أقصر بكثير من أن لها من النوع البري نظيره (الشكل 3B)، مما يوحي بأن LucDM هو الركيزة محددة للنظام يقر ويحطالبروتينات تتجمع.

تدهور LucDM-GFP يؤدي إلى انخفاض كبير في إشارة مضان الشاملة. لذلك، وقد وضعنا أيضا على بروتوكول للكشف في الوقت الحقيقي الخلوية LucDM-GFP باستخدام فحص أساس مضان صفيحة. يتم تطوير العديد من الأنظمة شاشة عالية الإنتاجية (HTS) للعقاقير أو الجينات تعديل المجاميع الخلوية والجدوى الخلوية التي تسببها البروتينات الشاذة ^18-20. ومع ذلك، فقد تم تصميم عدد قليل جدا HTSs خصيصا لاستهداف التدهور في خلايا الثدييات. يخدم هذا البروتوكول على أنه نظام قوي للتحليل واسع النطاق السريع ومن آثار تعبير البروتين، ضربة قاضية، والعلاج من تعاطي المخدرات على الخلوي تدهور البروتين تتجمع. باستخدام خلايا هيلا كمثال أدناه ونحن تصف بروتوكولات لتحليل هذه البروتينات تتجمع اثنين. يمكن أن تطبق أيضا على فحوصات للخطوط الخلايا الأخرى، على الرغم من الظروف ترنسفكأيشن وبالطبع الوقت قد يحتاج إلى أن يكون الأمثل لخطوط الخلايا الفردية.

Protocol

1. إعداد الكاشف

1. إعداد عازلة خلية تحلل (50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.8، 100 مم كلوريد الصوديوم، و 5 ملي MgCl _2، 0.5٪ NP-40). الملحق 2 ملي DTT، 1X كامل كوكتيل البروتيني، و 250 وحدة دولية / مل benzonase قبل الاستخدام.
2. إعداد عازلة بيليه (20 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0، 15 ملي MgCl _2). الملحق 2 ملي DTT، 1X كامل كوكتيل البروتيني و 250 وحدة دولية / مل benzonase قبل الاستخدام.
3. إعداد عازلة الغليان بقوة 3x (6٪ SDS، 20 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0). تكملة 150 ملي DTT قبل الاستخدام.
4. إعداد ومضان منخفض المتوسطة DMEM لفحوصات باستخدام قارئ صفيحة مضان. مزيج 25 ملي الجلوكوز، 0.4 ملي الجلايسين، 0.4 ملي أرجينين، 0.2 ملي السيستين، 4.0 مم الجلوتامين، 0.2 ملي الحامض الاميني، 0.8 ملي آيسولوسين، 0.8 ملم ليسين، 0.8 ملم ليسين، 0.2 ملي ميثيونين، 0.4 ملي الفنيل الأنين، 0.4 ملي سيرين، 0.8 ملي ثريونين، 0.078 ملي التربتوفان، 0.4 ملم التيروزين، 0.8 ملي حمض أميني أساسي، 1.8 ملي CaCl _2، 0.81 ملي MgSO ₄ و 5.33 ملي بوكل، 44.0 ملم NaHCO _3، 110 مم كلوريد الصوديوم، 0.9 مليناه ₂ ص _4. ضبط درجة الحموضة من الحل باستخدام حمض الهيدروكلوريك أو هيدروكسيد الصوديوم لدرجة الحموضة 7.4. تعقيم المتوسطة من خلال الترشيح.
   ملاحظة: هذه الوسيلة يحتوي على مكونات المتوسطة DMEM القياسية مع ارتفاع نسبة الجلوكوز إلا أن الحديد (NO _{3) 3،} ويتم حذف الفيتامينات والفينولات الأحمر. الفينول الأحمر والريبوفلافين وبيريدكسال في مستنبت DMEM منتظمة تتداخل بشكل كبير مع الكشف عن إشارة مضان ^21. الثقافة وسيط وبدون هذه المكونات هو أمر حاسم لنجاح يعيش التصوير الخلية GFP. المتوسط ​​مستقرة لمدة 12 شهرا عند تخزينها في مكان بارد.

الفحص 2. تدهور Atxn1 82Q GFP

1. لوحة حوالي 3 × 10 ⁵ خلايا هيلا إلى 35 ملم لوحات مع DMEM المتوسطة تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، وذلك بعد نمو O / N خلايا زراعة لالتقاء مجموعة من 40-60٪ في وقت ترنسفكأيشن.
   ملاحظة: يقوم عدد من لوحات اللازمة على عدد من النقاط الزمنية والعلاجات دescribed أدناه.
2. خلايا Transfect هيلا مع 0.3 ميكروغرام من Atxn1 82Q-GFP / pRK5 البلازميد في كل بئر باستخدام كاشف ترنسفكأيشن وفقا لتعليمات الشركة الصانعة ^9. جعل مزيج ترنسفكأيشن رئيسية تحتوي على الحمض النووي وكاشف ترنسفكأيشن وقسامة أنه لكل بئر.
3. 4-5 ساعة بعد ترنسفكأيشن، ودراسة الخلايا الحية تحت المجهر الفلورسنت المقلوب للتعبير GFP مع الطول الموجي الإثارة 450-490 نانومتر. عودة الخلايا إلى حاضنة بعد التصوير.
   ملاحظة: لاحظ كل من الإشارات GFP تنتشر وبقع صغيرة من إشارات GFP في نواة في هذا الوقت.
4. إزالة المتوسط ​​عن طريق الشفط وإضافة 2 مل DMEM الطازجة التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل فروج. علاج الخلايا لل0، 4، 8، 12 و 16 ساعة مع فروج قبل الحصاد. لدراسة تدهور proteasomal، وتشمل proteasome والمانع MG132 (10 ميكرومتر) في لوحة واحدة المعالجة لمدة 16 ساعة كمجموعة تحكم.
5. حصاد لوحة واحدة من الخلايا في كل نقطة زمنية. إزالة المتوسط ​​عن طريق الشفط لد تغسل الصحون مرتين مع 3 مل الجليد الباردة 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). الأداة الإضافية تجميد لوحة على الثلج الجاف.
6. بعد آخر نقطة زمنية (16 ساعة)، كشط الخلايا المجمدة (من جميع نقاط الوقت) إلى 150 ميكرولتر من العازلة خلية تحلل الجليد الباردة وحضنت على الجليد لمدة 30 دقيقة.
7. أجهزة الطرد المركزي في الخلية لست] في جهاز للطرد المركزي الفوق في 17000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
8. نقل طاف، التي تحتوي على NP-40-القابلة للذوبان (NS) البروتينات، إلى أنبوب آخر باستخدام ماصة.
   ملاحظة: استخدم supernatants لقياس تركيزات البروتين برادفورد فحص إذا لزم الأمر.
9. شطف الكريات بإضافة بلطف حوالي 200 1X ميكرولتر PBS للأنابيب من دون إزعاج الكريات. إزالة بعناية برنامج تلفزيوني عن طريق الشفط أو ماصة. إعادة تعليق عليها في 150 العازلة خلية بيليه الجليد الباردة ميكرولتر، تليها 15-30 دقيقة حضانة على الجليد.
   ملاحظة: بيليه جزء معلق يحتوي NP-40 غير قابلة للذوبان (NI) البروتينات. انظر الشكل 1B لدياجكبش تجزئة المنظفات.
10. إضافة 75 ميكرولتر من 3X عازلة المغلي إلى كسور NS و 40 NP الكسور غير القابلة للذوبان (NI) معلق من الكريات. تسخين العينات عند 95 درجة مئوية في كتلة الحرارة لمدة 5 دقائق.
    تذوب كتل في NP-40 الكسور غير القابلة للذوبان بعد التسخين وسوف عينات أصبح واضحا: ملاحظة.
11. إضافة العازلة تحميل SDS-جل لقسامة من NS المغلي وNI. تحميل حجم مساو من العينات التي تم جمعها من جميع نقاط الوقت لهلام SDS-PAGE. حجم تحميل يتوافق مع ما يقرب من 20 ميكروغرام من NS من عينة تم جمعها في وقت 0. ملاحظة: م، وكذلك SDS للذوبان (SS) البروتين من فصيل NI، يمكن حلها بواسطة SDS فصل هلام. في المقابل، عالقون SDS مقاومة لل(SR) مجاميع من NI جزء في الآبار هلام تحميل (الشكل 1B). لتحسين الكشف عن وصمة عار الغربي، يمكن تحميل حجم مزدوج من NI.
12. كشف NS و SS Atxn1 82Q-GFP بواسطة طخة غربية باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة GFP وتعزيز لمعان كيميائي (ECL).
    ملاحظة: Atxn1 82Q في جزء SS عموما أقل مقارنة إلى جزء NS عند استخدام هذا البروتوكول. وهناك حاجة أطول التعرض أطلق بيت التمويل الخليجي لإشارات الأمثل.
13. فحص ريال Atxn1 82Q من جزء بيليه بواسطة فحوصات التخلف تصفية باستخدام جهاز نقطة وصمة عار (الشكل 1B). لفترة وجيزة، وإنشاء جهاز نقطة وصمة عار عقد غشاء خلات 0.2 ميكرومتر السليلوز. تحميل 80-120 ميكرولتر من NI المغلي في كل بئر من جهاز نقطة وصمة عار.
    ملاحظة: كما تتشكل كميات صغيرة فقط من المجاميع ريال في الخلايا، لطخة فحص نقطة، تحميل حجم جزء ريال أي ما يقرب من 10-15 مرة من حجم جزء NS المستخدمة في تحليل لطخة غربية.
    1. بعد تصفية العينات من خلال الغشاء فراغ، وحدات Atxn1 82Q-GFP عالقا على الغشاء يمكن الكشف عنها من قبل مكافحة GFP immunoblotting ^9،12،22.
       ملاحظة: انظر التقارير السابقة ^9،12،22 لوصف مفصل لفحص فلتر التخلف. هذه الخطوة اختياريةلأن ريال Atxn1 82Q هو الحد الأدنى بالمقارنة مع SS و NS كسور بعد ترنسفكأيشن قصيرة الموصوفة في هذا البروتوكول. وبالإضافة إلى ذلك، تبقى مستويات ريال Atxn1 82Q في حد ذاته على فروج مطاردة (الشكل 2B). ومع ذلك، فإنه لا يزال حاسما لدراسة ما إذا كانت تتأثر كميات SS Atxn1 82Q مع مرور الوقت لأي العلاج من تعاطي المخدرات أو التعبير الجيني في التجارب الأولية. البقاء أنواع البروتين SS في الآبار تحميل هلام SDS-PAGE يمكن الكشف عنها بواسطة طخة غربية. ومع ذلك، هذا الأسلوب هو أقل حساسية ويولد المزيد من النتائج متفاوتة (الشكل 1B).

3. تدهور الفحص من NLS-وسيفيراز-GFP باستخدام SDS-PAGE وصمة عار الغربية

1. لوحة حوالي 3 × 10 ⁵ خلايا هيلا إلى 35 ملم لوحات مع DMEM المتوسطة تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS). بعد O / N زراعة، تم التوصل إلى التقاء 40-60٪ في وقت ترنسفكأيشن. ويستند عدد من لوحات المطلوبة على عدد من رووصفت نقطة والعلاجات IME أدناه.
2. خلايا Transfect هيلا مع 1.0 ميكروغرام NLS-وسيفيراز-GFP / pRK5 البلازميد في كل بئر باستخدام كاشف ترنسفكأيشن وفقا لتعليمات الشركة الصانعة ^9. جعل مزيج ترنسفكأيشن رئيسية تحتوي على الحمض النووي وكاشف ترنسفكأيشن لقسامة من كل بئر.
3. بعد O / N ترنسفكأيشن (حوالي 15 ساعة)، ودراسة الخلايا الحية تحت المجهر الفلورسنت المقلوب للتعبير GFP مع الطول الموجي الإثارة 450-490 نانومتر. عودة الخلايا إلى حاضنة بعد التصوير.
   ملاحظة: منتشر إشارة GFP النووي يمكن ملاحظتها في معظم الخلايا (70٪). وهناك نسبة صغيرة (5٪) من الخلايا لديها المجاميع النووية.
4. إزالة المتوسط ​​عن طريق الشفط وإضافة 2 مل DMEM الطازجة التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل فروج. علاج الخلايا لل0، 1.5، 3، 4.5 و 6 ساعات مع فروج قبل الحصاد. لدراسة تدهور proteasomal، وتشمل إضافية MG132 proteasome والمانع (10 ميكرومتر) في لوحة واحدة للعلاج من 6 ساعات عن السيطرة.
5. حصاد لوحة واحدة من الخلايا في كل نقطة زمنية. إزالة المتوسط ​​عن طريق الشفط وتغسل الصحون مرتين مع 3 مل الجليد الباردة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). الأداة الإضافية تجميد لوحة على الثلج الجاف.
6. بعد آخر نقطة زمنية (6 ساعات) يتم الانتهاء من خلايا مجمدة في كل مرة يتم كشط نقطة إلى 150 ميكرولتر من العازلة خلية تحلل الجليد الباردة وحضنت على الجليد لمدة 30 دقيقة.
7. إضافة SDS عازلة هلام التحميل للست] خلية كاملة لتركيز النهائي من 2٪ SDS و 50 ملي DTT. احتضان العينات على كتلة الحرارة على 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
8. تحليل NLS-وسيفيراز-GFP بواسطة SDS-PAGE وصمة عار الغربية باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة GFP. تحميل حجم مساو من العينات التي تم جمعها من جميع نقاط الوقت لهلام SDS-PAGE. حجم تحميل يتوافق مع ما يقرب من 20 ميكروغرام من لست] خلية كاملة من عينة تم جمعها في وقت 0.

4. في الوقت الحقيقي تدهور الفحص من NLS-وسيفيراز-GFP عن طريق الإسفار صفيحة قارئ

1. البذور حوالي 1 × 10 ⁴خلايا هيلا في 96-جيدا لوحات زراعة الأنسجة سوداء مع أسفل شفافة. بعد O / N زراعة، تم التوصل إلى التقاء 50-70٪ في وقت ترنسفكأيشن.
   ملاحظة: هي المصنفة 60 ميكرولتر من المتوسط ​​تحتوي على خلايا هيلا توقف تماما مباشرة في كل بئر. لا تضيف إضافية متوسطة أو الصخور لوحة ذهابا وإيابا بعد الغرس، وإلا قد لا تكون موزعة بشكل غير متساو الخلايا.
2. خلايا Transfect هيلا مع ،05-،1 ميكروغرام من NLS-وسيفيراز-GFP / pRK5 البلازميد ⁹ في كل بئر باستخدام كاشف ترنسفكأيشن وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. جعل مزيج ترنسفكأيشن رئيسية تحتوي على الحمض النووي وكاشف ترنسفكأيشن وقسامة أنه لكل بئر. لا و ​​transfected ثلاث آبار مع الخلايا التي تحتوي على الحمض النووي، والتي هي بمثابة السيطرة للإشارة الخلفية مضان لكل حالة العلاج.
   ملاحظة: طريقة بديلة للحد من التفاوت ترنسفكأيشن ل transfect الخلايا قبل البذر. ومع ذلك، وجزء كبير من الخلايا transfected مع البروتين تتجمعالصورة تفشل في إرفاق أو تظهر انخفاض قابلية استخدام هذا الأسلوب. ومن المرجح أن بعض الخلايا قد لا تصمد أمام الضغوط الناجمة عن هضم التربسين عند التعبير عن البروتينات تتجمع السامة. ونتيجة لذلك، يتم خفض كبير في إشارة الفلورسنت الشاملة.
3. 20-24 ساعة بعد ترنسفكأيشن، ودراسة الخلايا الحية تحت المجهر الفلورسنت المقلوب للتعبير GFP مع الطول الموجي الإثارة 450-490 نانومتر.
4. إزالة المتوسط ​​عن طريق الشفط. إضافة ما يقرب من 200 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X إلى كل بئر ثم نضح لإزالة المبلغ المتبقي من DMEM المتوسطة.
5. إضافة 60 ميكرولتر من مضان منخفض DMEM المتوسطة مع 5٪ FBS و 50 ميكروغرام / مل فروج. لدراسة تدهور proteasomal، وتشمل إضافية MG132 proteasome والمانع (10 ميكرومتر) في مجموعة واحدة من العينات. تعيين ثلاث نسخ الآبار للكل معاملة / حالة.
   يتم تضمين العلاج MG132 والضوابط لتدهور proteasomal لأنه لا بد من استبعاد العوامل الأخرى التي يمكن أن تسبب قطرة من فلوو ملاحظة:إشارة rescence، بما في ذلك موت الخلايا وتبريد مضان.
6. قياس إشارة مضان من GFP مباشرة على قارئ لوحة الفلورسنت بعد إضافة فروج.
   ملاحظة: يتم عرض الإعدادات قياس البرمجيات في الجدول 1.
7. قراءة لوحة في كل ساعة لمدة تصل إلى 8-10 ساعة. بعد القراءة، والعودة لوحة إلى حاضنة الثقافة الخلية.
8. تصدير البيانات في ملف البيانات. استخدام القيمة الوسطية لمتعددة يقرأ في كل جانب كثافة مضان. تطبيع قيم كل نقطة البيانات إلى القيم المتوسطة من الوقت 0 في كل مجموعة على حدة. رسم كثافة مضان تطبيع مع مرور الوقت كما هو مبين في الشكل 4A و 4B، والشكل (5)، لوحات اليمين.
9. أداء التحليل الإحصائي لمعدلات التدهور بين شرطين باستخدام اتجاهين أنوفا مع التدابير المتكررة ^23.
   ملاحظة: في هذا التحليل، "كثافة مضان" هي المتغير التابع في حين أن "treatmشروط والأنف والحنجرة "و" الوقت "هي العوامل اثنين. وبدلا من مقارنة البيانات في نقطة زمنية الفردية، في اتجاهين أنوفا مع التدابير المتكررة يحلل الفرق بين مجموعات العلاج اثنين على مدار الساعة بأكمله.

النتائج

في تحليل حالة مستقرة، وحدات النووية مرئية المجهر Atxn1 82Q-GFP يمكن ملاحظتها في 30 - 50٪ من خلايا هيلا 20 ساعة بعد ترنسفكأيشن (الشكل 1A). تحليل لطخة الغربي من كسور NS و SS باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة GFP يظهر الفرقة متميزة من Atxn1 82Q-GFP بين 100 كيلو دالتون...

Discussion

الآليات التي تنظم تدهور البروتينات تتجمع ضرورية للحفاظ على توازن البروتينات الخلوية، وعلى الأرجح أنها تمثل أهدافا المخدرات قيمة لعلاج الاضطرابات العصبية وغيرها من الأمراض misfolding البروتين. هنا، يتم وصف المقايسات التي تدرس تدهور البروتينات تتجمع، وذلك باستخدام بروت...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Life Technologies	11995-092
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10082147
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019
NP-40	Sigma-Aldrich	NP40S-500ML
SDS	Sigma-Aldrich	L3771
MG132	Sigma-Aldrich	M8699
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C7698
Dithiothreitol (DTT)	Fisher Scientific	45000232
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche Boehringer Mannheim	4693159001
Bio-Dot Apparatus	Bio-Rad	1706545
Living Colors GFP Monoclonal Antibody	Clonetech	632375
Anti-Actin mAb Rabbit, IgG	Sigma-Aldrich	A45060-200UL
Amino acids	Sigma-Aldrich		Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium
Olympus IX-81  Inverted Fluorescence Microscope	Olympus	IX71/IX81
96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom	Sigma-Greiner	89135-048
Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO	TECAN	Infinite 200® PRO
Cellulose acetate membrane 0.2 µm	Sterlitech	CA023001
Prism 5	GraphPad		Statistical analysis software