Hücreler yanlış katlanmış proteinlerle degradasyonundan Tahliller

Özet

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

Özet

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

Giriş

Proteinler hücrelerde en fazla yer alan makromoleküllerdir ve bunlar hemen hemen tüm biyolojik süreçlerde önemli bir rol oynamaktadır. çoğu proteinin biyolojik aktivitesi içine katlama gerektirmemekte ve doğal üç boyutlu yapılara muhafaza. Anormal yerleşimleriyle Proteinler sadece normal işlevlerini kaybeder, ama aynı zamanda sık sık diğer proteinlerin fonksiyonlarını bozar ve hücrelerin ^1,2 toksik olan çözünebilir oligomerik türler veya agrega oluşturmaz. Protein yanlış katlanmasına karşı için hücreler yanlış katlanmış proteinleri ³ ortadan hem moleküler, kendi doğal şekillerinde ulaşmak için katlanmamış veya kısmen katlanmış polipeptidleri yardımcı şaperonlar ve degradasyon yollarını, kullanır. Karmaşıklığı ve katlama sürecinin stokastik doğası göz önüne alındığında, protein yanlış katlanması kaçınılmaz olduğunu ve mutasyonlar, biyosentetik hatalar, ve post-translasyonel zararların ¹ durumunda ters olmayabilir. Bu nedenle, hücreleri sonuçta degradat itimatiyon yollar protein kalitesini korumak için.

hücresel protein kalite kontrol önemi (PQC) sistemleri, kanser, diyabet ve Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, amyotrofik lateral skleroz, Huntington hastalığı (HD) gibi birçok nörodejeneratif rahatsızlıklar dahil olmak üzere protein yanlış katlayan hastalıklarının sıklığı altını, ve spinoserebellar ataksi (SCA) ^4,5. Örneğin, tümör baskılayıcı p53'ün mutasyonlar her durumda ^6% 50-70 ~ ilişkili tümörlerde, tek en sık genetik lezyondur. P53 mutasyonlarının önemli bir bölümüyle agrega ⁷ oluşumuna yol p53 yapısını değiştirmek yanlış anlamlı mutasyonlar vardır. Ayrıca, genişletilmiş polyQ uzanıyor sahip proteinler genetik ve patolojik HD ve SCA ile ilişkilidir. Etkilenen proteinlerde polyQ streç uzunluğu belli bir eşik dönemi aştığında bu ilerici ve genellikle ölümcül hastalıklar tezahürtutun ve polyQ streç uzunluğu ⁸ uzatır olarak giderek daha şiddetli hale gelir.

Bu hastalıkların tedavisi için çekici bir yaklaşım, terapötik olarak hücresel PQC sistemleri, özellikle de degradasyon yollarını yastığı sağlamaktır. Ancak bozuk proteinlerin memeli hücrelerinde özellikle parçalanması ile ilgili yollar, yeterince anlaşılamamıştır. o proteazom katlanan proteinlerin bozulması için kritik öneme olduğu kabul edilmiştir rağmen, hayati bir mesele tanımlanmamış kalır: Özellikle tanınan ve yıkım için hedeflenmiş nasıl katlanan proteinler. PQC sistemleri sitoplazma, endoplazmik retikulum ve mitokondri gibi hücresel bölümlerinde tespit edilmiştir, ancak ayrıca, çekirdekte PQC sistemleri ² tam olarak bilinmemektedir.

laboratuarımızda tarafından yapılan son çalışmalar çekirdekte yanlış katlanmış proteinler çeşitli tanır ve bozan bir sistem belirledikmemeli hücre, ^9. Bu sistem, promiyelositik protein (PML), nükleer protein ve üçlü motif ihtiva eden (TRIM) protein ailesinin bir üyesi ve RNF4, protein ihtiva eden bir halka-etki oluşur. PML ve çeşitli diğer kesme proteinler, protein SUMOylation ¹⁰ özgünlüğünü ve verimliliğini kolaylaştırır SUMO (küçük ubikitin benzeri modifiye edici) ile E3 ligaz aktivitesi, sahiptirler. RNF4 onlara ubikuitin ligaz aktivitesinin ¹¹ tanıyor HALKA etki ek olarak bir veya daha fazla sumo-etkileşim motifleri (SIMS) ihtiva SUMO hedefli ubikitin ligazlara (Stubl), küçük bir grup aittir. Biz PML özellikle yanlış katlanmış proteinlerle ilgili farklı özellikleri ayırt edebilir ayrık alt tabaka tanıma siteleri aracılığıyla katlanan proteinleri tanıdığı bulundu. bağlanma üzerine, PML etiketler dahili SUMOylation sitesinin varlığı nedeniyle poli-zincir oluşturabilirler SUMO2 / 3 poli-zincir, iki hemen hemen aynı memeli SUMO proteinlerle proteinleri yanlış katlanmış. SUMOylated katlanan proteinler daha sonra ubikuitinasyon ve proteozomal bozulmasına yol açar RNF4, tarafından tanınır. Biz daha PML yetersizlik SCA türü bir fare modelinde 1 (SCA1) ⁹ davranışsal ve nöropatolojik kusurları şiddetlendirir olarak PML-RNF4 sistemi, nörodejenerasyon karşı koruma için önemli olduğunu göstermiştir.

Protein düzeyleri düzenleyen diğer hücresel mekanizmaları protein parçalanmasını ayırt etmek için, protein ciro oranları ⁹ ölçüldü. Protein ciro belirlemek için en sık kullanılan yöntemler arasında nabız kovalamaca ve sikloheksimid (CHX) kovalamaca vardır. Bu iki yöntem zamanla incelemek, sırasıyla, çeviri-yetkin hücreleri ve çeviri-inhibe hücrelerde ilgi toplam önceden var olan proteinlerin ilgi radyoizotop işaretli proteinler. Ancak, patojen ve yanlış katlanması eğilimli proteinleri eğitim için önemli bir sorun bu proteinlerin yarı ömrü son derece lo olabilir olduğunung. Örneğin, ataksin-1, ataksin-7, Huntingtin, α-sinüklein ve TDP-43 24 saat ^9,12-16 fazla 12 yarılanma ömürleri. bu proteinleri barındıran hücreler, uzun süreli çeviri inhibisyonunu hayatta olmayabilir, özellikle yanlış katlanmış proteinlerle çünkü kendileri hücreler için oldukça zehirli olabilir çünkü bu proteinlerin yavaş devir hızları CHX kovalamaca analizi kullanımını engellemektedir. izotopik etiketleme ile darbe kovalamaca analizi aynı zamanda son derece toplama eğilimli olan proteinler için zor olabilir. En çok darbe kovalayıcı deneyler, aynı zamanda, radyoaktif etiketli tüm diğer proteinlerden ilgili proteini ayırmak için immüno kullanır. Bu işlem, normal olarak, yanlış SDS-PAGE elektroforezi ile analiz yapmak SDS çözülmeyen agrega oluşturabilen sırasında uzun immünopresipitasyon ve yıkama işlemleri içerir.

Yavaş devir hızı ⁹ açıklanan burada bir protokol nükleer katlanan proteinleri analiz etmek. 82 glutaminler (Atxn1 82Q) bir kısım içeren ataksin-1 (Atxn1) patojenik bir şekilde, bu amaçla ⁸ kullanılır. Hücre içinde sentezlendiğinde, çekirdeği (Şekil 1A) Atxn1 82Q mikroskopik formları görebilir inklüzyonlar gelişmiş yeşil floresan proteini (GFP), füzyon. Darbe kovalamaca analizi Ataxn1 82Q yarı ömrü boyunca 18 saat ⁹ olduğunu ortaya koymaktadır. Atxn1 82Q doğal yapısındaki ile yanlış katlanmış farklı özelliklere konformasyonları, hem de türler ile türlerden oluşmaktadır. Tür farklı oranlarda degrade olması muhtemeldir ve bu nedenle ayrı ayrı analiz edilmesi gerekmektedir. gelen lizatlar Atxn1 82Q-GFP ifade eden hücreler, NP-40 çözülebilir (çözünebilir veya NS, büyük olasılıkla doğal proteinleri veya yanlış katlanmış oligomerik / monomer proteinleri temsil eder) ve NP-40 çözünmeyen (Nı, toplu / yanlış katlanmış) kısımlar halinde bölünür. (Büyük ihtimalle düzensiz agregalar SS) ya da (SDS-dirençli SR, ikincisi daha SDS çözünür ayrılabilir muhtemelen amiloid fibriller) Parçalar (Şekil 1B). SR fraksiyon immunoblotting, ardından filtre geriliği deneyleri ile tespit edilebilir iken, KG ve SS fraksiyonları Western blotting ile ve ardından SDS-PAGE ile analiz edilebilir. CHX Chase deterjanla paya ayırma yöntemi ile bir araya getirilmiş ve SS Atxn1 82Q yarılanma ömrü SS fraksiyonu kolaylıkla tanınan ve bozulmuş belirten NS Atxn1 82Q toplam Atxn1 82Q (Şekil 2A) çok daha kısa olduğu ortaya çıkmıştır hücrelerin ^9. Böylece, bu yöntem yanlış katlanmış proteinlerin dinamiklerini incelemek için ve onların yıkım desen karşılaştırmak için güçlü bir araç sağlar.

Ayrıca yanlış katlanmış proteinleri bozulmasını modüle makromolekülleri veya küçük bileşiklerin belirlenmesi için yüksek miktarda madde taraması için uygun olan bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, ateşböceği lusiferaz (LucDM) ¹⁷ bir model şaperon alt-tabaka bir şekilsel olarak destabilize mutant dayanır. Biz sigorta varNükleer lokalizasyon sinyali (NLS) d LucDM algılama kolaylık olması için bu hücre bölmesine PQC sistemleri prob, ve GFP (NLS-LucDM GFP) için. Mikroskopik NLS-LucDM-GFP formları hücreleri (Şekil 3A) küçük bir yüzdesi görünür nükleer agrega. Atxn1 82Q, NLS-LucWT-GFP olduğu PML-RNF4 yolu ^9'da SUMO2 / 3 tarafından değiştirilebilir ve regüle NLS-LucDM-GFP fakat vahşi tip muadili benzer. SS ve SR türlerin nispi miktarları NS göre minimum olmasına rağmen NLS-LucDM-GFP aşağıda protokol 3'te tarif edilen koşullar kullanılarak, SS ve SR türler oluşturur. tahlil basitleştirmek için, biz sadece SDS SDS-PAGE ve western blot ile (NS ve SS fraksiyonları hem dahil) çözünebilir LucDM analiz. Önemli olarak, CHX takip deneyi SDS çözünür NLS-LucDM-GFP yarı ömrü LucDM tanır ve dalgalanmalar sistemi için belirli bir alt-tabaka olduğunu düşündüren vahşi tip muadili (Şekil 3B) çok daha kısa olduğunu göstermiştirYanlış katlanmış proteinler.

LucDM-GFP bozulması genel flüoresan sinyalinde önemli bir düşüşe neden olur. Bu nedenle, aynı zamanda mikro floresans bazlı analiz kullamlarak hücresel LucDM-GFP gerçek zamanlı saptanması için bir protokol geliştirilmiştir. Bir çok yüksek girdi boyunca araştırma (HTS) sistemleri olarak anormal protein ^18-20 neden olduğu hücre agregatları ve hücre canlılığı düzenleyici ilaçlar ya da gen için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, çok az HTSs özellikle memeli hücrelerinde bozulmasını hedefleme için tasarlanmıştır. Bu protokol, hücresel yanlış katlanmış protein parçalanması ile ilgili protein ifadesi, devirme ve ilaç tedavisinin etkileri hızlı ve büyük ölçekli analizi için sağlam bir sistem olarak hizmet vermektedir. Bu iki yanlış katlanmış proteinlerin analizi için protokoller tarif aşağıda, örnek olarak HeLa hücreleri kullanılarak. Transfeksiyon koşulları ve zaman süreci, her hücre hattı için optimize edilmesi gerekebilir, ancak deneyler ayrıca, diğer hücre çizgileri ile de uygulanabilir.

Protokol

Reaktif hazırlanması 1.

1. Hücre liziz tamponu (50 mM Tris, pH 8.8, 100 mM NaCI, 5 mM _MgCI2,% 0.5 NP-40). Ek 2 mM DTT, 1 x tam proteaz kokteyli, 250 lU / ml kadar Benzonaz ile yıkanmıştır.
2. Pelet tamponu hazırlayın (20 mM Tris, pH 8.0, 15 mM _MgCI2). Ek 2 mM DTT, kullanımdan önce 1 x tam proteaz kokteyli ve 250 IU / ml kadar Benzonaz.
3. 3x kaynama tamponu (% 6 SDS, 20 mM Tris, pH 8.0) içinde hazırlayın. Kullanmadan önce 150 mM DTT Supplement.
4. mikroplak floresan okuyucu kullanarak deneyleri için düşük floresan DMEM ortamı hazırlayın. 25 mM glükoz, 0.4 mM glisin, 0.4 mM arjinin, 0.2 mM sistein, 4.0 mM glutamin, 0.2 mM histidin, 0.8 mM izolösin, 0,8 mM lösin, 0.8 mM lizin, 0.2 mM metionin, 0.4 mM fenilalanin, 0.4 mM serin, 0.8 karıştırın mM treonin, 0.078 mM triptofan, 0.4 mM tirosin, 0.8 mM valin, 1.8 mM _CaCl2, 0.81 mM MgSO _4, 5.33 mM KCI, 44.0 mM NaHCO _3, 110 mM NaCI, 0.9 mMNaH ₂ PO _4. pH 7.4'e HCI veya NaOH kullanılarak solüsyonun pH ayarlayın. süzme yoluyla orta sterilize edin.
   NOT: Bu ortam o Fe dışında yüksek glukoz ile standart DMEM ortamı bileşenlerini içermektedir (NO _{3) 3,} vitaminler ve Fenol Kırmızısı ihmal edilir. Fenol kırmızı, riboflavin ve düzenli DMEM kültür ortamı içinde piridoksal belirgin bir floresan sinyali ²¹ tespiti engeller. Bu bileşenleri olmadan kültür ortamı, başarılı canlı hücre GFP görüntüleme için çok önemlidir. buzdolabında saklandığında orta 12 ay boyunca stabildir.

Atxn1 82Q GFP 2. Parçalanma Deneyi

1. Plaka, yaklaşık% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş DMEM aracı maddesi 35 mm tabak içine 3 x 10 ⁵ HeLa hücreleri, O / N kültür hücreleri transfeksiyon zaman% 40-60 bir ortak akışa kadar büyümeye yapılabilmesi için,.
   NOT: Gerekli plakaların sayısı zaman noktalarında ve tedavi d sayısına dayanırAşağıda escribed.
2. Üreticinin talimatlarına ^9'a göre her bir transfeksiyon reaktifi olarak Atxn1 82Q-GFP / pRK5 plazmid 0.3 ug ile transfekt HeLa hücreleri. DNA ve transfeksiyon reaktifi içeren bir ana transfeksiyon karışımı yapın ve her bir kuyu için bölmeyin.
3. 4-5 saat sonrası transfeksiyon, dalgaboyu 450-490 nm ile GFP ifade için ters bir floresan mikroskop altında canlı hücreleri incelemek. görüntüleme sonra inkübatör geri hücreleri dönün.
   NOT: Şu anda çekirdekte hem de dağınık GFP sinyalleri ve GFP sinyalleri küçük benekler gözlemleyin.
4. Vakum aspirasyonla Ortamı çıkarın ve 50 ug / ml CHX ihtiva eden 2 ml taze DMEM ekleyin. hasat öncesi CHX 0, 4, 8, 12 ve 16 saat için hücreleri tedavi. proteozomal bozulmasını incelemek için, bir kontrol olarak, 16 saat tedavi edilmemiş plaka proteazom önleyicisi MG132 (10 uM) içerir.
5. Her bir zaman noktasında hücrelerin bir plaka hasat edilir. vakum aspirasyon An tarafından orta çıkarın3 ml buz gibi soğuk 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile iki kez tabakları yıkamak d. kuru buz üzerinde plaka Yapış-dondurma.
6. Son zaman noktasında (16 saat) sonra, buz soğukluğundaki hücre parçalama tamponu 150 ul içinde (bütün zaman noktalarında gelen) Dondurulmuş hücreler kazıma ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
7. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 17,000 x g'de bir tezgah üstü santrifüj içinde hücre lizatları santrifüjleyin.
8. bir pipet kullanılarak bir tüpe, NP-40 çözülebilir (NS) proteinleri içeren süpernatant aktarın.
   Not: Gerekirse Bradford tahlili ile protein konsantrasyonlarını ölçmek için süpernatantlar kullanın.
9. nazikçe pelet bozmadan tüplere yaklaşık 200 ul 1x PBS ekleyerek pelet durulayın. Dikkatle vakum aspirasyon ya da pipetle PBS kaldırmak. Buz üzerinde 15-30 dakika inkübasyon, ardından 150 ul buz gibi soğuk tampon maddesi hücre topağı bunları yeniden askıya.
   NOT: yeniden süspanse topak parçası NP-40 çözünmeyen (NI) proteinleri içerir. Bir diag Şekil 1B'ye bakınızDeterjan fraksiyonlaşması koç.
10. peletlerden yeniden süspansiyon haline NS fraksiyonları ve NP-40 çözünmeyen (NI) fraksiyonlara 3x kaynama tamponu 75 ul ekle. 5 dakika için bir ısı blokta 95 ° C'de numune ısıtın.
    Not: NP-40 çözünmeyen fraksiyon Kümelenmeye ısıtılması ve numuneler belli olacak sonra eritilir.
11. kaynatıldı NS ve NI bir kısım SDS-jel yükleme tamponu ekleyin. SDS-PAGE jel tüm zaman noktalarında alınan örneklerin eşit miktarda yerleştirin. Zaman 0. NOT toplanan numuneden yaklaşık 20 ug NS hacim yüklenen karşılık gelir: NI hizip NS yanı sıra SDS-çözünür (SS) proteini, SDS ayıran jel ile çözülebilir. Buna karşılık, NI fraksiyondan SDS-dirençli (SR) agrega jel yükleme kuyuları (Şekil 1B) sıkışmış. Western blot algılama geliştirmek için, NI hacminin iki yüklenebilir.
12. anti-GFP antikor ve zenginleştirilmiş kimyasal aydınlatma (ECL) ile western blot ile NS SS Atxn1 82Q-GFP algılar.
    NOT: Bu protokol kullanıldığında SS fraksiyonunda Atxn1 82Q genellikle daha az NS fraksiyonu ile karşılaştırılır. Daha uzun ECL maruz uygun sinyaller için gereklidir.
13. Bir nokta leke cihazı (Şekil 1B) kullanarak filtre gerilik tahlilleri ile pelet fraksiyonu SR Atxn1 82Q inceleyin. Kısaca, bir 0.2 mikron selüloz asetat membran tutan bir nokta-benek aparatı ayarlayın. Nokta-blot cihazının her bir kuyunun içine kaynatıldı NI yük 80-120 ul.
    Not: SR agrega sadece az miktarda hücrelerinde oluşan zamanda, nokta benek analizi için, Western blot analizi için kullanılan NS fraksiyonunun hacminin yaklaşık 10-15 kat SR fraksiyonunun bir hacim yükleyin.
    1. Vakum ile membrandan örnekleri süzüldükten sonra, zar üzerinde kalmış Atxn1 82Q-GFP agrega anti-GFP immunoblotting ^9,12,22 ile tespit edilebilir.
       NOT: Filtre geriliği testinin ayrıntılı bilgi için önceki raporlarda ^9,12,22 bakın. Bu adım isteğe bağlıdırSR Atxn1 82Q bu protokolü açıklanan kısa transfeksiyon aşağıdaki SS ve NS fraksiyonları ile karşılaştırıldığında çok az olduğu için. Buna ek olarak, SR Atxn1 82Q seviyeleri büyük ölçüde CHX Chase (Şekil 2B) aynı kalır. Ancak, SS Atxn1 82Q miktarları ilk deneylerde herhangi bir ilaç tedavisi veya gen ifadesi için zamanla etkilenip etkilenmediğini incelemek için hala çok önemlidir. SS protein türleri, western blot ile tespit edilebilir, SDS-PAGE jel yükleme kuyu içinde kalmak. Bununla birlikte, bu yöntem daha az hassastır ve daha değişken sonuçları (Şekil 1B) oluşturur.

SDS-PAGE ve Western blot NLS-lusiferaz-GFP 3. Parçalanma Deneyi

1. Plaka, yaklaşık% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş DMEM aracı maddesi 35 mm tabak içine 3 x 10 ⁵ HeLa hücreleri. O / N kültürden sonra% 40-60 bir kesişme transfeksiyon zamanı ulaşılır. gerekli plakaların sayısı t sayısına dayanırime noktaları ve tedavileri aşağıda tarif.
2. Üreticinin talimatlarına ^9'a göre her bir kuyunun kullanarak transfeksiyon reaktif içine 1.0 mikrogram NLS-lusiferaz-GFP / pRK5 plazmid ile Transfect HeLa hücreleri. iyi her kısım için DNA ve transfeksiyon reaktifi içeren bir ana transfeksiyon karışımı olun.
3. O / N transfeksiyon (saat 15 civarında) sonra, emisyon dalga boyu 450-490 nm GFP tanımı için bir ters flüoresan mikroskop altında, canlı hücreleri incelemek. görüntüleme sonra inkübatör geri hücreleri dönün.
   Not: Dağınık çekirdek GFP sinyali hücreleri (% 70) büyük çoğunluğunda gözlenebilir. Hücrelerin küçük bir yüzdesi (% 5) Nükleer agrega var.
4. Vakum aspirasyonla Ortamı çıkarın ve 50 ug / ml CHX ihtiva eden 2 ml taze DMEM ekleyin. hasat öncesi CHX 0, 1.5, 3, 4.5 ve 6 saat için hücreleri tedavi. proteozomal bozulmasını incelemek için, kontrol olarak 6 saat muamele bir plaka ek proteazom önleyicisi MG132 (10 uM) içerir.
5. Her bir zaman noktasında hücrelerin bir plaka hasat edilir. Vakum aspirasyonla Ortamı çıkarın ve 3 ml buz soğukluğunda fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile iki kez plakaları yıkayın. kuru buz üzerinde plaka Yapış-dondurma.
6. Son zaman noktasında (6 saat) sonra hücreler de tüm zaman noktaları buz soğukluğunda hücre parçalama tamponu 150 ul sıyrılmış ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir dondurulmuş, tamamlandı.
7. bir son% 2 SDS konsantrasyonu ve 50 mM DTT için bütün hücre lizatları SDS jel yükleme tamponu ekleyin. 5 dakika boyunca 95 ° C'de sıcaklıkta bir blok üzerinde inkübe edin.
8. SDS-PAGE ve anti-GFP antikoru kullanılarak Western blot ile NLS-lusiferaz GFP analiz edin. SDS-PAGE jel tüm zaman noktalarında alınan örneklerin eşit miktarda yerleştirin. hacmi yaklaşık 20 ug 0 zamanında toplanan numune alınan bütün hücre lizatları içinde tekabül yüklendi.

Floresan Mikroplaka Okuyucu Kullanılarak NLS-lusiferaz-GFP 4. Gerçek zamanlı Parçalanma Testi

1. Tohum, yaklaşık 1 x 10 ⁴Şeffaf alt siyah 96 oyuklu doku kültürü plakaları halinde HeLa hücreleri. O / N kültürden sonra% 50-70 bir kesişme transfeksiyon zamanı ulaşılır.
   NOT: tamamen askıya HeLa hücreleri içeren ortam 60 ul her kuyuya doğrudan numaralı seribaşı. tohumlama sonra geri ve ileri ek orta veya kaya plakasını eklemeyin, aksi takdirde hücreler dengesiz dağıtılmış olabilir.
2. Üreticinin talimatlarına uygun olarak her bir transfeksiyon reaktifi olarak NLS-lusiferaz-GFP / pRK5 plazmid ⁹ 0.05-0.1 ug Transfect HeLa hücreleri. DNA ve transfeksiyon reaktifi içeren bir ana transfeksiyon karışımı yapın ve her bir kuyu için bölmeyin. hücrelerle üç kuyu, her işlem koşulunda için arka plan flüoresan sinyali için bir kontrol olarak hizmet DNA ile transfekte değildir.
   Not: transfeksiyon varyasyonu azaltmak için alternatif bir yol, tohumlamadan önce hücreleri transfekte etmektir. Bununla birlikte, hücrelerin büyük bir kısmı yanlış katlanmış protein ile transfektes eklemek veya bu yöntemi kullanarak azaltılmış canlılığı göstermek için başarısız. Bazı hücreler, toksik yanlış katlanmış proteinleri ifade ederken şekilde tripsin emdirme ile neden olduğu stres dayanamayıp olasıdır. Bunun bir sonucu olarak, genel olarak flüoresan sinyal önemli ölçüde azalır.
3. 20-24 saat transfeksiyondan sonra, emisyon dalga boyu 450-490 nm GFP tanımı için bir ters flüoresan mikroskop altında, canlı hücreleri incelemek.
4. vakum aspirasyon ile orta çıkarın. her oyuğa PBS 1x yaklaşık 200 ul ekleyin ve sonra DMEM ortamı artık miktarını kaldırmak için aspire.
5. % 5 FBS ve 50 ng / ml CHX, düşük floresan DMEM ortamında 60 ul ekle. proteozomal bozulmasını incelemek için, numune bir takım ek proteazom önleyicisi MG132 (10 uM) içerir. Her bir tedavi / durum için kuyu üç kopya olarak ayarlayın.
   NOT: fluo bir düşüşe neden olabilir diğer faktörleri ekarte etmek çok önemlidir, çünkü MG132 tedavisi proteozomal bozulması için kontrol olarak dahil edilmiştirhücre ölümü ve floresans içeren rescence sinyali.
6. CHX ilave edildikten sonra bir flüoresan plaka okuyucusu üzerinde hemen GFP flöresan sinyalinin ölçülmesi.
   NOT: Yazılım ölçüm ayarları Tablo 1'de gösterilmiştir.
7. kadar 8-10 saat boyunca plaka saatte okuyun. okuduktan sonra, hücre kültürü inkübatör geri plaka dönüş.
8. tablo dosyası olarak veri ihracat. floresan yoğunluğu yanı sıra her biri için çoklu okur ortalama değerini kullanın. İlgili gruplar halinde Zamanda 0 ortalama değerleri her veri noktasının değerlerini normalleştirmek. Şekil 4A ve 4B ve Şekil 5'te sağ panellerinde gösterildiği gibi, zaman içinde normalleştirilmiş floresan yoğunluğu çizilir.
9. Tekrarlı ölçümlerde ²³ ile iki yönlü ANOVA kullanılarak iki durum arasındaki bozulma oranlarının istatistiksel analiz.
   NOT: Bu analizde, "floresan yoğunluğu" "suların ise bağımlı değişkenent koşulları "ve" zaman "iki faktör vardır. Bunun yerine bireysel zaman noktalarında veri karşılaştırma, tekrarlı ölçümlerde iki yönlü ANOVA tüm zaman boyunca iki tedavi grubu arasındaki farkı analiz eder.

Sonuçlar

HeLa hücreleri% 50 transfeksiyon (Şekil 1A) sonra 20 saat - bir sabit durum analizinde, mikroskobik görünür Atxn1 82Q-GFP nükleer agrega 30 görülmektedir. Anti-GFP antikor kullanılarak ve NS SS fraksiyonların Western blot analizi, proteinin molekül ağırlığı (Şekil 1B) karşılık gelen, 100 kDa ve 150 kDa işaretleri arasında Atxn1 82Q-GFP bir tat bant göstermektedir. SR fraksiyonunda Atxn1 82Q-GFP filtresi geriliği tahlili ile, ya da...

Tartışmalar

yanlış katlanmış proteinleri bozulmasını düzenleyen mekanizmaların hücresel proteinlerin dengesini sağlamaya yönelik olarak, ve muhtemelen, nörodejeneratif bozuklukların ve diğer protein yanlış katlayan hastalıkların tedavisi için değerli bir ilaç hedeflerini temsil eder. Burada, yanlış katlanmış proteinler bozunmasını incelenmesi deneyler, patojenik Atxn1 protein (Atxn1 82Q) ve örnek olarak bir nükleer lokalize lusiferaz mutant (NLS-LucDM) ile tarif edilmektedir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Life Technologies	11995-092
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10082147
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019
NP-40	Sigma-Aldrich	NP40S-500ML
SDS	Sigma-Aldrich	L3771
MG132	Sigma-Aldrich	M8699
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C7698
Dithiothreitol (DTT)	Fisher Scientific	45000232
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche Boehringer Mannheim	4693159001
Bio-Dot Apparatus	Bio-Rad	1706545
Living Colors GFP Monoclonal Antibody	Clonetech	632375
Anti-Actin mAb Rabbit, IgG	Sigma-Aldrich	A45060-200UL
Amino acids	Sigma-Aldrich		Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium
Olympus IX-81  Inverted Fluorescence Microscope	Olympus	IX71/IX81
96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom	Sigma-Greiner	89135-048
Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO	TECAN	Infinite 200® PRO
Cellulose acetate membrane 0.2 µm	Sterlitech	CA023001
Prism 5	GraphPad		Statistical analysis software