Assays für den Abbau fehlgefalteter Proteine ​​in Zellen

Zusammenfassung

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

Zusammenfassung

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

Einleitung

Proteine ​​sind die am häufigsten vorkommenden Makromolekülen in Zellen, und sie spielen eine wesentliche Rolle in praktisch allen biologischen Prozessen. Die biologische Aktivität der meisten Proteine ​​erfordert deren Faltung in und Wartung, die nativen dreidimensionalen Strukturen. Proteine ​​mit aberranter Konformationen nicht nur ihre normale Funktion verlieren, sondern auch bilden häufig lösliche oligomere Spezies oder Aggregate, die die Funktionen von anderen Proteinen beeinträchtigen und sind toxisch für Zellen ^1,2. Um dem entgegenzuwirken , falsch gefaltete Proteine, verwenden Zellen , die beide molekulare Chaperone, die entfaltete oder teilweise gefaltete Polypeptide unterstützen , um ihre native Konformation zu erreichen, und Abbauwege, die falsch gefaltete Proteine ^​​3 zu beseitigen. Angesichts der Komplexität und der stochastischen Natur des Faltvorgangs, Protein misfolding unvermeidlich, und es kann nicht in dem Fall von Mutationen, biosynthetische Fehler umgekehrt werden, und posttranslationale Schäden ^1. Daher verlassen Zellen schließlich auf degradatIonenwege, um ihre Proteinqualität aufrecht zu erhalten.

Die Bedeutung der zellulären Proteinqualitätskontrolle (PQC) -Systemen wird durch das Vorherrschen von Protein-Fehlfaltungen Krankheiten, einschließlich Krebs, Diabetes, und viele neurodegenerative Störungen wie Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose, Huntington-Krankheit (HD) unterstrichen, und spinocerebellar Ataxien (SCA) ^4,5. Beispielsweise Mutationen in dem p53 - Tumorsuppressor ist die einzige am häufigsten genetischen Läsion in Tumoren, verbunden mit ~ 50-70% aller Fälle ^6. Ein wesentlicher Anteil von p53 - Mutationen sind Missense - Mutationen , welche die Konformation von p53, was zur Bildung von Aggregaten ⁷ verändern. Darüber hinaus Proteine ​​mit erweiterter polyQ Strecken sind genetisch und pathologisch mit HD und SCA in Verbindung gebracht. Diese progressiven und oft tödlichen Krankheiten manifestieren, wenn die Länge des polyQ Strecke in den betroffenen Proteine ​​eine bestimmte THRES überschreitethalten, und wird zunehmend schwerer als die Länge des polyQ Strecke ⁸ verlängert.

Ein vielversprechender Ansatz, diese Krankheiten zu behandeln ist, um therapeutisch zellulären PQC Systeme zu stärken, insbesondere die Abbauwege. Jedoch involviert die Wege in der Degradation von fehlerhaften Proteine, insbesondere solche, in Säugerzellen, bleiben wenig verstanden. Obwohl es erkannt wurde, dass das Proteasom für den Abbau von falsch gefalteten Proteine ​​von entscheidender Bedeutung ist, ein zentrales Thema bleibt undefiniert: wie falsch gefaltete Proteine ​​sind für den Abbau spezifisch erkannt und zielgerichtet. Darüber hinaus, obwohl PQC Systeme in zellulären Kompartimenten einschließlich Zytoplasma identifiziert wurden, dem endoplasmatischen Retikulum und dem Mitochondrium, bleiben die PQC Systeme im Kern unklar ^2.

Neuere Studien von unserem Labor haben ein System identifiziert, das eine Vielzahl von falsch gefalteten Proteinen in den Zellkern erkennt und verschlechtertvon Säugerzellen ^9. Dieses System besteht aus dem promyelocytic Protein (PML), einem Kernprotein und einem Mitglied des tripartite motif enthaltenden (TRIM) Proteinfamilie und RNF4, eine RING-Domäne enthaltendes Protein. PML und mehrere andere Proteine ​​TRIM besitzen SUMO (small ubiquitin-like Modifier) ​​E3 - Ligase - Aktivität, die die Spezifität und Effizienz der Protein SUMOylierung ¹⁰ erleichtert. RNF4 gehört zu einer kleinen Gruppe von SUMO-bezogene Ubiquitinligasen (Stübl), die einen oder mehrere Sumo-interacting Motive (SIMs) zusätzlich zu der RING - Domäne , die ihnen die Ubiquitin - Ligase - Aktivität ¹¹ bietet. Wir fanden, dass PML erkennt spezifisch misfolded Proteine ​​durch einzelne Substraterkennungsstellen, die unterschiedliche Merkmale auf falsch gefaltete Proteine ​​erkennen können. Bei der Bindung, PML-Tags fehlgefaltetem Proteine ​​mit poly-Ketten von SUMO2 / 3, zwei nahezu identische Säuger SUMO Proteine, die poly-Ketten aufgrund der Existenz eines internen SUMOylierung Stelle bilden kann. SUMOylated misfolded Proteine ​​werden dann durch RNF4 erkannt, die ihre Ubiquitinierung und Abbau im Proteasom führt. Wir haben gezeigt , weiter , dass die PML-RNF4 System zum Schutz gegen Neurodegeneration wichtig, da Mangel in PML die Verhaltens- und neuropathologischen Defekte eines Mausmodells von SCA Typ 1 (SCA1) ⁹ verschärft.

Um den Proteinabbau von anderen zellulären Mechanismen unterscheiden , die Proteinspiegel regulieren kann, wurde die Rate der Proteinumsatz ⁹ gemessen. Unter den am häufigsten verwendeten Methoden Proteinumsatz sind Puls Chase und Cycloheximid (CHX) Jagd zu bestimmen. Diese beiden Methoden untersuchen, über die Zeit bzw. die Radioisotop-markierte Proteine ​​von Interesse in übersetzungs bewandert Zellen und Gesamt vorbestehenden Proteine ​​von Interesse in Translation-inhibierten Zellen. Allerdings ist eine große Herausforderung, pathogene und Fehlfaltungen neigende Proteine ​​für die Untersuchung, dass die Halbwertszeit dieser Proteine ​​extrem lo sein kannng. Beispielsweise Ataxin-1, Ataxin-7, Huntingtin, α-Synuclein und TDP-43 haben alle Halbwertszeit von mehr als 12 bis 24 h ^9,12-16. Die langsamen Umsatzraten dieser Proteine ​​schließen die Verwendung der Analyse CHX chase, weil die Zellen, die diese Proteine ​​beherbergen kann nicht längere Übersetzung Hemmung überleben, vor allem weil die misfolded Proteine ​​können selbst hochtoxisch für Zellen sein. Die Pulse-Chase-Analyse mit Isotopenmarkierung kann auch für Proteine ​​eine Herausforderung sein, die stark zur Aggregation neigen. Die meisten Pulse-Chase-Assays beruhen auf Immunpräzipitation des Proteins von Interesse von den anderen Proteinen abzutrennen, die auch radioaktiv markiert sind. Dieses Verfahren umfasst in der Regel langwierig Immunpräzipitation und Waschverfahren, bei dem SDS-unlösliche Aggregate bilden können, ungenaue die Analyse mit SDS-PAGE-Elektrophorese zu machen.

Hier ist ein Protokoll zur nuklearen misfolded Proteine ​​analysieren mit einem langsamen Umsatzrate ⁹ beschrieben wird ,. Eine pathogene Form von Ataxin-1 (ATXN1) , die eine Strecke von 82 Glutamine (ATXN1 82Q) enthält , wird zu diesem Zweck ⁸ verwendet. Wenn in Zellen exprimiert wird , eine verstärkte grün fluoreszierende Protein (GFP) Fusion von ATXN1 82Q Formen mikroskopisch sichtbare Einschlüsse im Kern (1A). Pulse - Chase - Analyse zeigt , dass die Halbwertszeit von Ataxn1 82Q ist über 18 Stunden ^9. ATXN1 82Q mit misfolded Konformationen unterschiedlicher Eigenschaften von Arten zusammengesetzt, sowie Spezies mit nativer Konformation. Es ist wahrscheinlich, dass diese Arten mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten abgebaut werden, und sollte daher separat analysiert werden. Lysate aus ATXN1 82Q-GFP-exprimierenden Zellen werden fraktioniert in NP-40-löslich (löslich oder NS, wahrscheinlich repräsentieren native Proteine ​​oder falsch gefaltete monomeren / oligomeren Proteine) und NP-40-unlöslichen (NI, aggregiert / misfolded) Portionen. Letztere kann weiter in SDS-löslichen (SS; wahrscheinlich ungeordnete Aggregate) unterteilt werden oder SDS-resistenten (SR; wahrscheinlich Amyloidfibrillen) Fraktionen (1B). NS und SS-Fraktionen können durch SDS-PAGE, gefolgt von Western-Blot, während der SR-Fraktion durch Filterverzögerungs Assays detektiert werden kann durch Immunoblotting gefolgt analysiert werden. CHX chase wird mit dem Detergens Fraktionierungsverfahren kombiniert und entdeckt , dass die Halbwertszeit von SS ATXN1 82Q ist viel kürzer als die von NS ATXN1 82Q und insgesamt ATXN1 82Q (2A), was darauf hinweist , dass die SS - Fraktion leicht erkannt und abgebaut in Zellen ^9. Somit stellt diese Methode ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Dynamik von falsch gefalteten Proteine ​​zu untersuchen und deren Abbaumuster zu vergleichen.

Wir beschreiben auch ein Verfahren, das für Hochdurchsatz-Screening zur Identifizierung von Makromolekülen oder kleinen Verbindungen geeignet ist, die den Abbau fehlgefalteter Proteine ​​modulieren können. Dieses Verfahren basiert auf einer konformationell destabilisiert Mutante von Glühwürmchen - Luciferase (LucDM) ^17, einem Modell Chaperon Substrat. Wir haben Sicherungd LucDM zu einem Kernlokalisationssignal (NLS), die PQC Systeme in diesem Zellkompartiment zu sondieren, und GFP (NLS-LucDM-GFP) zur Erleichterung der Erkennung. NLS-LucDM-GFP Formen mikroskopisch sichtbare Kern Aggregate in einem kleinen Prozentsatz der Zellen (3A). Ähnlich wie bei ATXN1 82Q, NLS-LucDM-GFP-aber nicht seine Wildtyp - Gegenstück NLS-LucWT-GFP-durch SUMO2 / 3 modifiziert und reguliert durch die PML-RNF4 Weg ^9. NLS-LucDM-GFP bildet auch SS und SR-Arten, obwohl die relativen Mengen von SS und SR Spezies minimal sind im Vergleich zu NS, unter Verwendung der in Protokoll 3 unten beschriebenen Bedingungen. Um den Assay zu vereinfachen, analysieren wir nur SDS löslich LucDM (einschließlich sowohl der NS und SS-Fraktionen) durch SDS-PAGE und Western Blot. Wichtig ist , zeigte CHX chase - Assay , dass die Halbwertszeit von SDS-löslichen NLS-LucDM-GFP ist viel kürzer als die der Wildtyp - Gegenstück (3B), was darauf hindeutet , dass LucDM ein spezifisches Substrat für das System ist , das und verschlechtert erkenntmisfolded Proteine.

Der Abbau von LucDM-GFP führt zu einem deutlichen Rückgang der Gesamtfluoreszenzsignal. Daher haben wir entwickelt auch ein Protokoll für Echtzeit-Erkennung von zellulärer LucDM-GFP Fluoreszenz basierenden Assay unter Verwendung von Mikrotiterplatten. Viele Hochdurchsatz - Screening (HTS) Systeme für Medikamente oder Gene Zellaggregaten und zelluläre Lebensfähigkeit durch anomale Proteine ^​​18-20 verursacht Modifikation entwickelt. Jedoch sind sehr wenige HTS speziell für den Abbau in Säugerzellen abzielt. Dieses Protokoll dient als robustes System für die schnelle und umfangreiche Analyse der Auswirkungen der Proteinexpression, Knockdown und medikamentöse Behandlung auf die zelluläre misfolded Proteinabbau. Verwendung von HeLa-Zellen, wie beispielsweise unterhalb wir die Protokolle für die Analyse dieser beiden misfolded Proteine ​​beschreiben. Die Assays können auch auf andere Zelllinien angewendet werden, obwohl Transfektionsbedingungen und Zeitverlauf benötigen für einzelne Zelllinien optimiert werden.

Protokoll

1. Herstellung von Reagent

1. Bereiten Zelllyse - Puffer (50 mM Tris, pH 8,8, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl _2, 0,5% NP-40). Ergänzung 2 mM DTT, 1x vollständige Protease-Cocktail, und 250 IU / ml Benzonase vor dem Gebrauch.
2. Bereiten Pelletpuffer (20 mM Tris, pH 8,0, 15 mM MgCl _2). Ergänzung 2 mM DTT, 1x vollständige Protease-Cocktail und 250 IU / ml Benzonase vor dem Gebrauch.
3. Bereiten 3x siedende Puffer (6% SDS, 20 mM Tris, pH 8,0). Supplement 150 mM DTT vor dem Gebrauch.
4. Bereiten Sie Low-Fluoreszenz DMEM-Medium für Tests unter Verwendung von Mikrotiterplatten-Fluoreszenzreader. Mischungs 25 mM Glucose, 0,4 mM Glycin, 0,4 mM Arginin, 0,2 mM Cystein, 4,0 mM Glutamin, 0,2 mM Histidin, 0,8 mM Isoleucin, 0,8 mM Leucin, 0,8 mM Lysin, 0,2 mM Methionin, 0,4 mM Phenylalanin, 0,4 mM Serin, 0,8 mM Threonin, Tryptophan 0,078 mM, 0,4 mM Tyrosin, 0,8 mM Valin, 1,8 mM CaCl _2, 0,81 mM MgSO _4, 5,33 mM KCl, 44,0 mM NaHCO _3, 110 mM NaCl, 0,9 mMNaH ₂ PO _4. Der pH-Wert der Lösung mit HCl oder NaOH auf pH 7,4. Sterilisieren des Mediums durch Filtration.
   Hinweis: Dieses Medium enthält Komponenten des Standard - DMEM - Medium mit hohem Glucosegehalt , außer dass Fe (NO _{3) 3,} Vitamine und Phenolrot weggelassen. Phenolrot, Riboflavin und Pyridoxal in regelmäßigen DMEM - Kulturmedium mit der Detektion von Fluoreszenzsignal ²¹ erheblich stören. Das Kulturmedium ohne diese Komponenten ist entscheidend für eine erfolgreiche Live-Cell-GFP-Bildgebung. Das Medium ist stabil für 12 Monate bei gekühlter Lagerung.

2. Der Abbau Assay von ATXN1 82Q GFP

1. Platte etwa 3 x 10 ⁵ HeLa - Zellen in 35 mm - Platten mit DMEM - Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt, so daß nach O / N Kultivieren von Zellen auf eine Konfluenz von 40-60% zum Zeitpunkt der Transfektion wachsen.
   HINWEIS: Die Anzahl von Platten benötigt wird, basierend auf der Anzahl von Zeitpunkten und Behandlungen dunter escribed.
2. Transfizieren HeLa - Zellen mit 0,3 & mgr; g ATXN1 82Q-GFP / pRK5 Plasmids in jede Vertiefung Reagenz Transfektion Herstelleranweisung gemäß ^9. Machen Sie einen Master-Transfektionsgemisch, die DNA und Transfektionsreagenz und Aliquotierung es für jeden gut.
3. 4-5 Stunden nach der Transfektion, untersuchen Sie die lebenden Zellen unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop für die GFP-Expression mit Anregungswellenlänge von 450 bis 490 nm. Rück Zellen zurück zu Inkubator nach der Bebilderung.
   Hinweis: Beachten Sie die beiden diffuses GFP-Signale und kleine Sprenkel von GFP-Signale in Kern zu diesem Zeitpunkt.
4. Entfernen Sie das Medium durch Absaugung und 2 ml frisches DMEM, das 50 ug / ml CHX. Behandlung von Zellen für 0, 4, 8, 12 und 16 h mit CHX vor der Ernte. Um den proteasomalen Abbau, sind Proteasom-Inhibitor MG132 (10 & mgr; M) in einer Platte behandelt für 16 Stunden als Kontrolle untersuchen.
5. Ernten Sie eine Platte von Zellen zu jedem Zeitpunkt. Entfernen Sie das Medium durch Absaugung eind die Platten zweimal mit 3 ml eiskaltem 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) waschen. Snap-gefrieren die Platte auf Trockeneis.
6. Nach dem letzten Zeitpunkt (16 Stunden), kratzen die gefrorenen Zellen (aus allen Zeitpunkten) in 150 ul eiskaltem Puffer Zelllyse und für 30 Minuten auf Eis inkubiert.
7. Zentrifugieren der Zelllysate in einer Tischzentrifuge bei 17.000 xg für 15 min bei 4 ° C.
8. Den Überstand, die NP-40-löslichen (NS) Proteine ​​enthält, in ein anderes Röhrchen mit einer Pipette.
   HINWEIS: Stände Verwendung für Proteinkonzentrationen von Bradford-Test messen, wenn nötig.
9. Spülen Sie die Pellets durch sanft Zusatz von ca. 200 ul 1x PBS auf die Rohre, ohne die Pellets zu stören. Sorgfältig PBS durch Absaugung oder Pipette entfernen. Re-suspendieren sie in 150 ul eiskaltem Zellpelletpuffer, gefolgt von 15-30 min Inkubation auf Eis.
   HINWEIS: Die resuspendierte Pellet-Fraktion enthält NP-40 unlöslich (NI) Proteine. Siehe Abbildung 1B für eine diagWidder der Waschmittel-Fraktionierung.
10. In 75 ul 3x siedendem Puffer in NS-Fraktionen und NP-40 unlöslich (NI) Fraktionen, die aus den Pellets suspendiert. Erhitzen Sie die Proben bei 95 ° C auf einem Heizblock für 5 min.
    HINWEIS: Clumps in den NP-40 unlöslichen Fraktionen werden aufgelöst nach dem Erhitzen und Proben wird deutlich werden.
11. In SDS-Gelladepuffer auf eine aliquote Menge von gekochtem NS und NI. Laden gleichen Volumen von Proben aus allen Zeitpunkten auf SDS-PAGE-Gel aufgefangen. Die Volumen geladen entspricht etwa 20 & mgr; g NS von der Probe zum Zeitpunkt 0 NOTE gesammelt: NS sowie SDS-löslichen (SS) Protein aus NI-Fraktion kann durch SDS Trenngel gelöst werden. Im Gegensatz dazu SDS-resistente (SR) Aggregate von NI Fraktion werden in den Gel - Befüllungs - Wells (1B) stecken. Zur Western-Blot-Erkennung, doppeltes Volumen von NI verbessern können geladen werden.
12. Erkennen NS und SS ATXN1 82Q-GFP durch Western-Blot unter Verwendung von anti-GFP-Antikörper und verstärkte Chemilumineszenz (ECL).
    HINWEIS: ATXN1 82Q in der SS-Fraktion wird in der Regel im Vergleich weniger auf die NS-Fraktion, wenn dieses Protokoll verwenden. Längere ECL Belichtung für optimale Signale benötigt.
13. Untersuchen SR ATXN1 82Q von der Pelletfraktion durch Filterverzögerungs Assays unter Verwendung eines Dot-Blot - Vorrichtung (1B). Kurz gesagt, stellen Sie eine 0,2 um Celluloseacetat-Membran eine Dot-Blot-Vorrichtung hält. Last 80-120 ul gekocht NI in jede Vertiefung der Dot-Blot-Apparatur.
    Hinweis: Da nur geringe Mengen an SR-Aggregate in den Zellen gebildet werden, für die Dot-Blot-Assay, laden ein Volumen des SR-Fraktion, die etwa 10-15 mal des Volumens des NS-Fraktion für Western-Blot-Analyse verwendet wird.
    1. Nach dem Filtrieren der Proben durch die Membran durch Vakuum, ATXN1 82Q-GFP - Aggregate auf der Membran stecken kann ^9,12,22 von anti-GFP - Immunoblotting nachgewiesen werden.
       HINWEIS: Siehe vorherigen Berichte ^9,12,22 für detaillierte Beschreibung der Filter Retardation - Assay. Dieser Schritt ist optionalweil SR ATXN1 82Q ist minimal im Vergleich zu SS und NS Fraktionen, die die kurze Transfektion in diesem Protokoll beschrieben folgen. Darüber hinaus bleiben die Ebenen der SR ATXN1 82Q weitgehend gleich über CHX chase (2B). Jedoch ist es immer noch von entscheidender Bedeutung zu prüfen, ob die Mengen von SS ATXN1 82Q sind im Laufe der Zeit beeinflusst für jede medikamentöse Behandlung oder Genexpression in anfänglichen Experimenten. SS Proteinspezies bleiben in SDS-PAGE-Gel Befüllungs-Wells kann durch Western-Blot nachgewiesen werden. Jedoch ist dieses Verfahren weniger empfindlich und erzeugt mehr variable Ergebnisse (1B).

3. Degradation Assay von NLS-Luciferase-GFP unter Verwendung von SDS-PAGE und Western-Blot

1. Platte etwa 3 x 10 ⁵ HeLa - Zellen in 35 mm - Platten mit DMEM - Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS). Nach O / N Kultivierung eine Konfluenz von 40-60% zum Zeitpunkt der Transfektion zu erreichen. Die Anzahl von Platten benötigt wird, von der Anzahl der t basierendime Punkte und Behandlungen im Folgenden beschrieben.
2. Transfizieren HeLa - Zellen mit 1,0 ug NLS-Luciferase-GFP / pRK5 Plasmid in jedes Well Reagenz Transfektion Herstelleranweisung gemäß ^9. Machen Sie einen Master-Transfektionsgemisch, die DNA und Transfektionsreagenz für aliquoten jeder Vertiefung.
3. Nach O / N-Transfektion (etwa 15 Stunden), die lebende Zellen unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop für die GFP-Expression mit Anregungswellenlänge von 450 bis 490 nm zu untersuchen. Rück Zellen zurück zu Inkubator nach der Bebilderung.
   HINWEIS: Diffuse Kern GFP-Signal kann in der Mehrzahl der Zellen (70%) beobachtet werden. Ein kleiner Anteil (5%) von Zellen haben Kern Aggregate.
4. Entfernen Sie das Medium durch Absaugung und 2 ml frisches DMEM, das 50 ug / ml CHX. Behandeln Sie Zellen für 0, 1,5, 3, 4,5 und 6 Stunden mit CHX vor der Ernte. Um den proteasomalen Abbau, zusätzliche Proteasom-Inhibitor MG132 (10 & mgr; M) in einer Platte behandelt 6 Stunden als Kontrolle untersuchen.
5. Ernten Sie eine Platte von Zellen zu jedem Zeitpunkt. Entfernen Sie das Medium durch Absaugung und waschen Sie die Platten zweimal mit 3 ml eiskaltem Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS). Snap-gefrieren die Platte auf Trockeneis.
6. Nach dem letzten Zeitpunkt (6 Stunden) ist abgeschlossen, bei gefrorenen Zellen Allzeitpunkte werden für 30 min in 150 ul eiskaltem Zelllysepuffer und inkubiert auf Eis gekratzt.
7. Hinzufügen SDS-Gel-Ladepuffer zu Ganzzelllysaten für eine Endkonzentration von 2% SDS und 50 mM DTT. Inkubieren Proben auf einem Heizblock bei 95 ° C für 5 min.
8. Analysieren NLS-Luciferase-GFP durch SDS-PAGE und Western-Blot unter Verwendung von Anti-GFP-Antikörper. Laden gleichen Volumen von Proben aus allen Zeitpunkten auf SDS-PAGE-Gel aufgefangen. Das Volumen entspricht etwa 20 & mgr; g Ganzzelllysaten von Probe bei der Zeit gesammelt 0 geladen.

4. Echtzeit-Abbau-Test der NLS-Luciferase-GFP mittels Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader

1. Samen etwa 1 x 10 & ^sup4 ;HeLa-Zellen in schwarz 96-Well-Gewebekulturplatten mit transparentem Boden. Nach O / N Kultivierung eine Konfluenz von 50-70% zum Zeitpunkt der Transfektion zu erreichen.
   HINWEIS: 60 ul Medium vollständig suspendiert HeLa-Zellen enthalten, werden direkt in jede Vertiefung ausgesät. Nicht zusätzliches Medium oder Steinplatte nach dem Aussäen hin und her hinzufügen, sonst können Zellen ungleichmäßig verteilt werden.
2. Transfizieren HeLa - Zellen mit 0,05-0,1 ug NLS-Luciferase-GFP / pRK5 Plasmid ⁹ in jede Vertiefung Reagenz Transfektion Herstelleranweisung entsprechend. Machen Sie einen Master-Transfektionsgemisch, die DNA und Transfektionsreagenz und Aliquotierung es für jeden gut. Drei Brunnen mit Zellen nicht mit DNA transfiziert, die für die Hintergrundfluoreszenzsignal für jede Behandlungsbedingung als Kontrolle dient.
   ANMERKUNG: Eine alternative Weise Transfektion Variation zu reduzieren ist, Zellen zu transfizieren, vor der Aussaat. Jedoch transfiziert ein großer Anteil von Zellen mit fehlgefaltetem Proteins scheitern reduzierte Lebensfähigkeit zu befestigen oder zeigen mit dieser Methode. Es ist wahrscheinlich, dass einige Zellen möglicherweise nicht die durch Trypsin Verdauung verursacht Stress stehen, wenn toxische misfolded Proteine ​​exprimieren. Als Ergebnis wird die Gesamtfluoreszenzsignal wesentlich reduziert.
3. 20-24 Stunden nach der Transfektion, untersuchen Sie die lebenden Zellen unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop für die GFP-Expression mit Anregungswellenlänge von 450 bis 490 nm.
4. Entfernen Sie das Medium durch Absaugung. Hinzufügen, etwa 200 ul 1x PBS in jede Vertiefung und dann Restmenge an DMEM-Medium zu entfernen anzusaugen.
5. Hinzuzufügen 60 ul Low-Fluoreszenz DMEM-Medium mit 5% FBS und 50 ug / ml CHX. Um den proteasomalen Abbau, zusätzliche Proteasom-Inhibitor MG132 (10 & mgr; M) in einer Reihe von Proben zu untersuchen. Stellen Sie dreifach von Vertiefungen für jede Behandlung / Zustand.
   HINWEIS: MG132 Behandlung wird als Kontrollen für den proteasomalen Abbau enthalten, da es entscheidend ist, andere Faktoren auszuschließen, die Tropfen Fluo verursachen könnenzenz Signal, einschließlich Zelltod und Fluoreszenzlöschung.
6. Messen Sie das Fluoreszenzsignal von GFP sofort auf einem Fluoreszenzplattenleser nach CHX Zugabe.
   Hinweis: Die Software Messeinstellungen sind in Tabelle 1 gezeigt.
7. Lesen Sie jede Stunde die Platte für bis zu 8-10 Stunden. Nach der Lektüre, Rückkehr zur Zellkultur-Inkubator der Platte zurück.
8. Exportieren Sie die Daten als Tabellenkalkulationsdatei. Verwenden Mittelwert von Multi liest für jede Vertiefung als Fluoreszenzintensität. Normalisieren Werte jedes Datenpunktes auf die Mittelwerte der Zeit 0 in den jeweiligen Gruppen. Plotten der normierten Fluoreszenzintensität über die Zeit , wie in 4A und 4B gezeigt ist , und Figur 5, rechte Felder.
9. Führen Sie eine statistische Analyse der Abbauraten zwischen zwei Zuständen unter Verwendung von Zwei-Wege - ANOVA mit wiederholten Messungen ^23.
   HINWEIS: In dieser Analyse "Fluoreszenzintensität" ist die abhängige Variable während "treatmbungsbedingungen "und" Zeit "sind die beiden Faktoren. Statt Daten zu einzelnen Zeitpunkten zu vergleichen, Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen den Unterschied zwischen den beiden Behandlungsgruppen über die gesamte Zeitverlauf analysiert.

Ergebnisse

50% der HeLa - Zellen 20 Stunden nach der Transfektion (1A) - in einem stationären Zustand Analyse können mikroskopisch sichtbare ATXN1 82Q-GFP Kern Aggregate in 30 beobachtet werden. Western - Blot - Analyse von NS und SS - Fraktionen unter Verwendung von Anti-GFP - Antikörper zeigt eine deutliche Bande von ATXN1 82Q-GFP zwischen 100 kDa und 150 kDa - Marker, an das Protein des Molekulargewicht entspricht (1B). ATXN1 82Q-GFP in der SR - Fraktion kann...

Diskussion

Mechanismen, die den Abbau fehlgefalteter Proteine ​​sind wesentlich für die Aufrechterhaltung der Homöostase zellulärer Proteine ​​reguliert, und sie stellen wahrscheinlich wertvolle Arzneimittelziele für neurodegenerative Erkrankungen und anderen eiweiß misfolding Behandlung von Krankheiten. Hier Assays, die den Abbau fehlgefalteter Proteine ​​untersuchen, werden beschrieben, eine pathogene ATXN1 Protein (ATXN1 82Q) und einem Kern lokalisierten Luciferase-Mutante (NLS-LucDM) als Beispiele verwendet. <...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Life Technologies	11995-092
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10082147
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019
NP-40	Sigma-Aldrich	NP40S-500ML
SDS	Sigma-Aldrich	L3771
MG132	Sigma-Aldrich	M8699
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C7698
Dithiothreitol (DTT)	Fisher Scientific	45000232
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche Boehringer Mannheim	4693159001
Bio-Dot Apparatus	Bio-Rad	1706545
Living Colors GFP Monoclonal Antibody	Clonetech	632375
Anti-Actin mAb Rabbit, IgG	Sigma-Aldrich	A45060-200UL
Amino acids	Sigma-Aldrich		Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium
Olympus IX-81  Inverted Fluorescence Microscope	Olympus	IX71/IX81
96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom	Sigma-Greiner	89135-048
Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO	TECAN	Infinite 200® PRO
Cellulose acetate membrane 0.2 µm	Sterlitech	CA023001
Prism 5	GraphPad		Statistical analysis software