Os ensaios para a degradação de proteínas em células deformadas

Resumo

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

Resumo

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

Introdução

As proteínas são as macromoléculas mais abundantes nas células, e que desempenham um papel essencial em praticamente todos os processos biológicos. A actividade biológica da maioria das proteínas requer a sua dobragem em, e manter, as estruturas tridimensionais nativas. Proteínas com conformações aberrantes não só perder as suas funções normais, mas também frequentemente formar espécies oligoméricas solúveis ou agregados que prejudicam as funções de outras proteínas e que são tóxicos para as células ^1,2. Para contrariar misfolding proteína, as células empregam ambos os chaperones moleculares, que ajudam polipeptídeos desdobradas ou parcialmente dobradas para chegar a sua conformação nativa e vias de degradação, o que elimina proteínas deformadas ^3. Dada a complexidade e natureza estocástica do processo de dobramento, proteína misfolding é inevitável, e não pode ser revertida no caso de mutações, erros biossintéticos, e danos pós-traducionais ^1. Assim, em última análise, as células dependem de degradatvias de íons para manter a sua qualidade de proteína.

A importância do controlo de qualidade de proteínas celulares (PQC) sistemas é sublinhada pela prevalência de doenças misfolding de proteínas, incluindo cancro, diabetes, e várias doenças neurodegenerativas, tais como doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, doença de Huntington (HD), e ataxias espinocerebelares (SCA) ^4,5. Por exemplo, as mutações no gene supressor tumoral p53 é a única lesão genética mais frequentemente em tumores, associada a ~ 50-70% de todos os casos ^6. Uma fração substancial das mutações de p53 são Mutações que alteram a conformação da p53, levando à formação de agregados ^7. Além disso, proteínas com trechos poliQ expandidas são geneticamente e patologicamente associado com HD e SCA. Estas doenças progressivas e muitas vezes fatais manifesta quando o comprimento do troço poliQ nas proteínas afectados excede um determinado thressegurar, e torna-se cada vez mais grave quanto o comprimento do troço poliQ prolonga ^8.

Uma abordagem atraente para o tratamento destas doenças é reforçar terapeuticamente sistemas PQC celulares, especialmente as vias de degradação. No entanto, as vias envolvidas na degradação de proteínas defeituosas, particularmente aqueles em células de mamíferos, permanecem pouco compreendidos. Apesar de ter sido reconhecido que o proteassoma é criticamente importante para a degradação de proteínas deformadas, um problema fundamental permanece indefinido: como proteínas deformadas são especificamente reconhecidos e direccionado para a degradação. Além disso, embora os sistemas de PQC foram identificados em compartimentos celulares, incluindo o citoplasma, retículo endoplasmático, e a mitocôndria, os sistemas de PQC no núcleo permanecem obscuros ^2.

Estudos recentes do nosso laboratório identificaram um sistema que reconhece e degrada a uma variedade de proteínas mal enroladas no núcleocélulas de mamíferos ^9. Este sistema é constituído por a proteína promielocítica (PML), uma proteína nuclear e um membro da família de proteínas contendo o motivo tripartida (TRIM), e RNF4, um anel-domínio contendo proteína. PML, e várias outras proteínas guarnição, possuem SUMO (pequeno modificador ubiquitina-like) atividade ligase E3, o que facilita a especificidade e eficiência de SUMOilação proteína ^10. RNF4 pertence a um pequeno grupo de ubiquitina ligases-alvo SUMO (Stubl), que contêm um ou mais motivos interactuantes de sumo (SIMs), para além do domínio RING que lhes proporciona a actividade de ubiquitina-ligase ^11. Descobrimos que PML reconhece especificamente proteínas deformadas através de sites de reconhecimento do substrato discretos que podem discernir características distintas em proteínas deformadas. Após a ligação, as etiquetas PML misfolded proteínas com poli-cadeias de SUMO2 / 3, duas proteínas de mamífero SUMO praticamente idênticos que podem formar poli-cadeias, devido à existência de um local de SUMOilação interna. Sproteínas deformadas UMOylated são depois reconhecidos por RNF4, o que leva a sua degradação e ubiquitinação proteossoma. Demonstramos ainda que o sistema de PML-RNF4 é importante para a protecção contra a neurodegeneração, como deficiência de PML exacerba os defeitos comportamentais e neuropatológicas de um modelo de rato do tipo 1 SCA (SCA1) ^9.

Para distinguir a degradação da proteína a partir de outros mecanismos celulares que podem regular os níveis de proteína, as taxas de turnover de proteína foi medida ^9. Entre os métodos mais frequentemente utilizados para determinar o volume de negócios proteínas são perseguição de pulso e cicloheximida (CHX) perseguição. Estes dois métodos examinar ao longo do tempo, respectivamente, as proteínas marcadas com radioisótopos de interesse em células-tradução eficiente e proteínas totais preexistentes de interesse em células-tradução inibido. No entanto, um grande desafio para o estudo de proteínas patogénicas e enrolamento incorrecto propensa é que a semi-vida dessas proteínas podem ser extremamente eisng. Por exemplo, Ataxina-1, Ataxina-7, Huntingtina, α-sinucleína, e TDP-43 têm meias-vidas de mais de 12 a 24 horas ^9,12-16. As taxas de rotação lenta destas proteínas impede o uso da análise CHX perseguição, porque as células que albergam estas proteínas não podem sobreviver inibição de tradução prolongada, especialmente porque as proteínas mal enroladas podem eles mesmos serem altamente tóxicas para as células. A análise pulse-chase com marcação isotópica também pode ser um desafio para as proteínas que são altamente agregação-prone. A maioria dos ensaios de pulse-chase confiar em imunoprecipitação para separar a proteína de interesse a partir de todas as outras proteínas que também são marcados radioactivamente. Este procedimento normalmente inclui imunoprecipitação e lavagem de procedimentos morosos, durante os quais os agregados SDS-insolúveis podem formar, fazer a análise com eletroforese SDS-PAGE impreciso.

Aqui um protocolo para analisar proteínas deformadas nucleares com uma taxa de rotatividade lenta é descrito ⁹. A forma patogénica da Ataxina-1 (Atxn1) que contém um trecho de 82 glutaminas (Atxn1 82Q) é usado para este propósito ^8. Quando expresso em células, uma proteína fluorescente (GFP) de fusão de verde melhorada Atxn1 82Q formas microscopicamente inclusões visíveis no núcleo (Figura 1A). Análise de pesquisa por pulso revela que a meia-vida de Ataxn1 82Q é mais de 18 horas ^9. Atxn1 82Q é composto por espécies com conformações mal dobradas de características diferentes, bem como espécies com conformação nativa. É provável que estas espécies são degradadas a velocidades diferentes e, assim, devem ser analisados ​​separadamente. Os lisados ​​de Atxn1-82Q-GFP expressando células são fraccionados em NP-40-solúvel (solúveis ou NS, provavelmente representando proteínas nativas ou proteínas monoméricas / oligomérico misfolded) e (NI, agregado / misfolded) porções de NP-40 insolúvel. Este último pode ser dividido em SDS-solúvel (SS; prováveis ​​agregados desordenadas) ou SDS-resistente (SR; fibrilas amilóides prováveisFracções) (Figura 1B). fracções NS e SS pode ser analisada por SDS-PAGE seguida por transferência de Western, enquanto que a fracção SR pode ser detectada por ensaios de retardamento do filtro, seguido de imunotransf erência. CHX perseguição é combinada com o método de fraccionamento de detergente, e descobriram que a sua meia-vida de SS Atxn1 82Q é muito mais curto do que o de NS Atxn1 82Q total e Atxn1 82Q (Figura 2A), indicando que a fracção SS pode ser facilmente reconhecido e degradado nas células ^9. Assim, este método proporciona uma poderosa ferramenta para estudar a dinâmica das proteínas deformadas e para comparar o seu padrão de degradação.

Também descrevemos um método que é adequado para o rastreio de elevado rendimento para identificar pequenas macromoléculas ou compostos que podem modular a degradação de proteínas mal enroladas. Este método baseia-se um mutante conformacionalmente desestabilizado de luciferase de pirilampo (LucDM) ^17, um substrato modelo de chaperona. Temos fusíveld LucDM para um sinal de localização nuclear (NLS) para sondar os sistemas PQC neste compartimento celular, e GFP (NLS-GFP-LucDM) para facilidade de detecção. Formas NLS-LucDM-GFP microscopicamente agregados nucleares visíveis em uma pequena porcentagem de células (Figura 3A). Semelhante a Atxn1 82Q, NLS-LucDM-GFP, mas não o seu tipo selvagem homólogo NLS-LucWT-GFP-se modificado por SUMO2 / 3 e regulamentada pela via PML-RNF4 ^9. -NLS-GFP LucDM também forma SS e SR espécies, embora as quantidades relativas de SS e SR espécies são mínimas em relação ao NS, utilizando as condições descritas no Protocolo 3 abaixo. Para simplificar o ensaio, só analisar SDS LucDM solúveis (incluindo ambas as fracções NS e SS) através de SDS-PAGE e Western blot. Importante, ensaio de perseguição CHX mostraram que a semi-vida de SDS-solúvel NLS-LucDM-GFP é muito mais curto do que o do seu tipo selvagem correspondente (Figura 3B), sugerindo que LucDM é um substrato específico para o sistema que reconhece e se degradaproteínas deformadas.

A degradação de LucDM-GFP provoca uma queda significativa em geral do sinal de fluorescência. Assim, desenvolvemos também um protocolo para a detecção em tempo real de LucDM-GFP celular utilizando um ensaio baseado em fluorescência de microplacas. Muitos sistemas de tela de alto rendimento (HTS) são desenvolvidos para drogas ou genes modificadores agregados celulares e viabilidade celular causadas por proteínas aberrantes ^18-20. No entanto, muito poucas HTSS são especificamente concebidos para direccionar a degradação em células de mamífero. Este protocolo serve como um sistema robusto para a análise de grande escala rápida e de os efeitos da expressão da proteína, knockdown, e tratamento com drogas sobre a degradação da proteína com enrolamento incorrecto celular. Usando células HeLa como exemplo, a seguir descrevem-se os protocolos para a análise das duas proteínas mal enroladas. Os ensaios também podem ser aplicados a outras linhas de células, embora as condições de transfecção e decurso de tempo pode necessitar de ser optimizado para as linhas de células individuais.

Protocolo

1. Preparação do Reagente

1. Preparar tampão de lise celular (Tris 50 mM, pH 8,8, NaCl 100 mM, MgCl ₂ 5, 0,5% de NP-40). Suplemento de DTT 2 mM, 1x cocktail de protease completo, e 250 UI / ml benzonase antes da utilização.
2. Preparar tampão de ressuspensão (Tris 20 mM, pH 8,0, 15 mM _MgCl2). Suplemento de DTT 2 mM, 1x cocktail de protease completo e 250 UI / ml benzonase antes da utilização.
3. Preparar tampão de ebulição 3x (6% de SDS, Tris a 20 mM, pH 8,0). Suplemento DTT 150 mM antes do uso.
4. Prepare meio DMEM de baixa fluorescência para ensaios utilizando leitor de microplacas de fluorescência. Misturar de glucose 25 mM, glicina 0,4 mM, arginina 0,4 mM, cisteína 0,2 mM, glutamina 4,0 mM, histidina 0,2 mM, isoleucina 0,8 mM, leucina 0,8 mM, lisina 0,8 mM, metionina a 0,2 mM, fenilalanina 0,4 mM, serina 0,4 mM, 0,8 treonina mM, 0,078 mM de triptofano, tirosina 0,4 mM, 0,8 mM de valina, 1,8 mM CaCl _2, 0,81 mM de _MgSO4, 5,33 mM de KCl, 44,0 mM de _NaHCO3, NaCl 110 mM, 0,9 mMNaH ₂ PO _4. Ajustar o pH da solução usando HCl ou NaOH para um pH de 7,4. Esterilizar o meio através de filtração.
   NOTA: Este meio contém os componentes do meio DMEM com elevado teor de glucose padrão, excepto que o Fe (NO _{3) 3,} vitaminas e Vermelho de Fenol são omitidos. Vermelho de Fenol, riboflavina e piridoxal no meio de cultura DMEM regular, interferir significativamente com a detecção do sinal de fluorescência ^21. O meio de cultura sem esses componentes é crucial para a imagem latente GFP células vivas bem sucedido. O meio é estável durante 12 meses quando armazenado refrigerado.

Ensaio 2. A degradação do Atxn1 82Q GFP

1. Placa de aproximadamente 3 x 10 ⁵ células HeLa em placas de 35 mm com meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), de modo que depois de o / n a cultura de células crescer até uma confluência de 40-60% no tempo de transfecção.
   NOTA: O número de placas é necessário com base no número de pontos de tempo e tratamentos described abaixo.
2. Transfectar células HeLa com 0,3 ug do plasmídeo Atxn1 82Q-GFP / pRK5 em cada poço utilizando o reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante ^9. Faça uma mistura mestre de transfecção contendo DNA e transfecção de reagentes e alíquota lo para cada poço.
3. 4-5 horas pós transfecção, examinar as células vivas sob um microscópio de fluorescência invertido para a expressão GFP com excitação comprimento de onda 450-490 nm. Retorno células de volta para incubadora depois de imagem.
   NOTA: Observe os sinais GFP difusos e pequenas manchas de sinais de GFP em núcleo neste momento.
4. Remover o meio por aspiração a vácuo e adicionar 2 ml de DMEM fresco contendo 50 ng / ml CHX. Tratar as células durante 0, 4, 8, 12 e 16 horas com CHX antes da colheita. Para examinar a degradação proteossómica, incluem inibidor de proteassoma MG132 (10 uM) em uma placa tratada durante 16 horas como controlo.
5. Colher uma placa de células em cada ponto de tempo. Remover o meio pelo vácuo de aspiração umad lavar as placas duas vezes com 3 ml de fosfato de 1x gelada solução salina tamponada (PBS). Snap-congelar a placa em gelo seco.
6. Após o último ponto de tempo (16 horas), raspar as células congeladas (a partir de todos os pontos de tempo) em 150 ul de tampão de lise das células em gelo e incubou-se em gelo durante 30 min.
7. Centrifugar os lisados ​​de células em uma centrífuga de bancada a 17000 xg durante 15 min a 4 ° C.
8. Transferir o sobrenadante, que contém as proteínas NP-40-solúveis (NS), para outro tubo, usando uma pipeta.
   NOTA: Use sobrenadante para medir concentrações de proteína pelo ensaio de Bradford, se necessário.
9. Lavar os sedimentos suavemente adicionando cerca de 200 ul de 1x PBS para os tubos sem perturbar os sedimentos. Remova cuidadosamente PBS por aspiração a vácuo ou pipeta. Re-suspender-los em 150 de tampão de ressuspensão de células gelada ul, seguido por 15-30 min de incubação em gelo.
   NOTA: A fração de sedimento ressuspenso contém NP-40 proteínas insolúveis (NI). Ver Figura 1B para um diagram de fracionamento detergente.
10. Adicionar 75 ul de tampão de ebulição 3x em fracções e NS-40 NP fracções insolúveis (NI) foram ressuspensas a partir dos sedimentos. Aquecer as amostras a 95 ° C num bloco de aquecimento durante 5 min.
    NOTA: Tufos nas frações insolúveis NP-40 são dissolvidos após o aquecimento e as amostras se tornará claro.
11. Adicionar tampão de carregamento de gel de SDS para uma aliquota de NS cozidos e Ni. Carga igual volume de amostras colhidas a partir de todos os pontos de tempo para gel de SDS-PAGE. O volume carregado corresponde a cerca de 20 ug de NS de amostra recolhida ao tempo 0. NOTA: NS, bem como de proteína SDS-solúvel (SS) de NI facção, podem ser resolvidas por SDS gel de separação. Em contraste, resistente SDS (SR) agregados de fração NI estão presos nos poços de carregamento de gel (Figura 1B). Para melhorar a detecção de western blot, o dobro do volume da NI pode ser carregado.
12. Detectar NS e SS Atxn1 82Q-GFP por Western blot utilizando anticorpo anti-GFP e quimioluminescência aumentada (ECL).
    NOTA: Atxn1 82Q na fração SS é geralmente menor em comparação com a fração NS ao usar este protocolo. Uma exposição mais longa de ECL é necessário para sinais ideais.
13. Examinar SR Atxn1 82Q a partir da fracção sedimento por ensaios de retardamento de filtro utilizando um aparelho de dot-blot (Figura 1B). Resumidamente, configurar um aparelho de dot-blot segurando uma membrana de acetato de celulose de 0,2 um. Carregar 80-120 ul de NI fervido em cada poço do aparelho de dot-blot.
    NOTA: Como são formados apenas pequenas quantidades de agregados SR em células, para o ensaio de dot blot, carregar um volume da fracção SR que é cerca de 10-15 vezes o volume da fracção do NS utilizado para análise de Western blot.
    1. Após filtração das amostras através da membrana por meio de vácuo, agregados Atxn1 82Q-GFP preso na membrana pode ser detectada por imunotransferência anti-GFP ^9,12,22.
       NOTA: Ver relatórios anteriores ^9,12,22 para uma descrição detalhada de ensaio retardo filtro. Este passo é opcionalporque SR Atxn1 82Q é mínima em comparação com SS e NS fracções seguintes a curto transfecção descrito neste protocolo. Além disso, os níveis de SR Atxn1 82Q manter-se o mesmo ao longo CHX perseguição (Figura 2B). No entanto, ainda é crucial para examinar se as quantidades de SS Atxn1 82Q são afetados ao longo do tempo para qualquer tratamento medicamentoso ou a expressão do gene em experiências iniciais. espécies de proteínas SS ficar em poços de carregamento de gel de SDS-PAGE podem ser detectadas através de Western blot. No entanto, este método é menos sensível e gera mais resultados variáveis ​​(Figura 1B).

3. Ensaio de Degradação-NLS-GFP da luciferase utilizando SDS-PAGE e Western Blot

1. Placa de aproximadamente 3 x 10 ⁵ células HeLa em placas de 35 mm com meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS). Depois de O / N a cultura, uma confluência de 40-60% é atingido no tempo de transfecção. O número de pratos necessários baseia-se no número de tOs pontos ime e tratamentos descritos abaixo.
2. Transfectar células HeLa com 1,0 ug-NLS-GFP de luciferase / pRK5 plasmídeo para cada poço utilizando o reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante ^9. Adicione uma mistura principal contendo a transfecção de ADN e o reagente de transfecção para aliquota de cada poço.
3. Após O transfecção / N (cerca de 15 horas), examine as células vivas sob um microscópio de fluorescência invertido para a expressão GFP com excitação comprimento de onda 450-490 nm. Retorno células de volta para incubadora depois de imagem.
   NOTA: Difusa sinal GFP nuclear pode ser observado na maioria das células (70%). Uma pequena percentagem (5%) de células têm agregados nucleares.
4. Remover o meio por aspiração a vácuo e adicionar 2 ml de DMEM fresco contendo 50 ng / ml CHX. Tratar células durante 0, 1,5, 3, 4,5 e 6 horas com CHX antes da colheita. Para examinar a degradação proteossómica, incluem inibidor de proteassoma MG132 adicional (10 uM) em uma placa tratada durante 6 horas como controlo.
5. Colher uma placa de células em cada ponto de tempo. Remover o meio por aspiração e lava-se as placas duas vezes com 3 ml de fosfato gelada solução salina tamponada (PBS). Snap-congelar a placa em gelo seco.
6. Após o último ponto de tempo (6 h) for concluída, as células congeladas a todos os tempos pontos são raspadas para 150 ul de tampão de lise celular em gelo e incubado em gelo durante 30 min.
7. Adicionar tampão de SDS-gel de carregamento para os lisados ​​de células inteiras para uma concentração final de 2% de SDS e 50 mM de DTT. Incubar as amostras em um bloco de calor a 95 ° C durante 5 min.
8. Analisar-NLS-GFP da luciferase por SDS-PAGE e transferência de Western utilizando anticorpo anti-GFP. Carga igual volume de amostras colhidas a partir de todos os pontos de tempo para gel de SDS-PAGE. O volume carregado corresponde a cerca de 20 mg de lisados ​​de células inteiras a partir de amostras coletadas no tempo 0.

4. em tempo real Degradação Ensaio de luciferase NLS-GFP por fluorescência Leitor de Microplacas

1. Semente de cerca de 1 x 10 ⁴células HeLa em preto placas de 96 poços de cultura de tecidos com fundo transparente. Depois de O / N a cultura, uma confluência de 50-70% é atingido no tempo de transfecção.
   NOTA: 60 ul de meio contendo células HeLa completamente suspensas são semeadas directamente em cada poço. Não adicione médio ou rocha adicional placa frente e para trás após a semeadura, caso contrário, as células podem ser distribuídos de forma desigual.
2. Transfectar células HeLa com 0,05-0,1 ug de NLS-GFP-luciferase / pRK5 plasmídeo ⁹ em cada poço utilizando o reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante. Faça uma mistura mestre de transfecção contendo DNA e transfecção de reagentes e alíquota lo para cada poço. Três poços com células não são transfectadas com o ADN, que serve como controlo para o sinal de fundo de fluorescência para cada condição de tratamento.
   NOTA: Um modo alternativo para reduzir a variação de transfecção é para transfectar células antes da semeadura. No entanto, uma grande parte das células transf ectadas com a proteína mal dobradas deixar de anexar ou mostrar a viabilidade reduzida utilizando este método. É provável que algumas células podem não resistir ao stress causado por digestão com tripsina, quando expressando proteínas deformadas tóxicos. Como resultado, o sinal de fluorescência total é significativamente reduzida.
3. 20-24 hr após a transfecção, examinar as células vivas sob um microscópio de fluorescência invertido para a expressão GFP com excitação comprimento de onda 450-490 nm.
4. Remover o meio por aspiração a vácuo. Adicionar aproximadamente 200 ul de 1x PBS a cada poço e depois aspirar-lo para remover quantidade residual de meio DMEM.
5. Adicionar 60 ul de meio DMEM de baixa fluorescência com 5% de FBS e 50 ng / ml CHX. Para examinar a degradação proteossómica, incluem MG132 inibidor do proteassoma adicional (10? M) em um conjunto de amostras. Definir triplicado de poços para cada tratamento / condição.
   NOTA: O tratamento MG132 é incluído como controles para a degradação proteossómica porque é crucial para descartar outros fatores que podem causar queda de fluosinal rescência, incluindo a morte celular e extinção de fluorescência.
6. Medir o sinal de fluorescência da GFP imediatamente num leitor de placas de fluorescência após a adição de CHX.
   NOTA: As configurações de medição de software são mostrados na Tabela 1.
7. Leia a placa a cada hora para um máximo de 8-10 h. Após a leitura, volte a placa de volta para incubadora de cultura de células.
8. Exportar os dados como arquivo de planilha. Use valor médio de várias leituras para cada bem como a intensidade de fluorescência. Normalizar os valores de cada ponto de dados para os valores médios do tempo 0 nos respectivos grupos. Traça-se a intensidade de fluorescência ao longo do tempo normalizado como se mostra na Figura 4A e 4B, e Figura 5, painéis direitos.
9. Realizar a análise estatística das taxas de degradação entre duas condições usando ANOVA de duas vias com medidas repetidas ^23.
   NOTA: Nesta análise, "a intensidade de fluorescência" é a variável dependente, enquanto "treatmcondições ENT "e" tempo "são os dois factores. Em vez de comparar os dados a pontos de tempo individuais, ANOVA de duas vias com medidas repetidas analisa a diferença entre os dois grupos de tratamento ao longo de todo o curso do tempo.

Resultados

Numa análise de estado estacionário, agregados nucleares microscopicamente visíveis Atxn1 82Q-GFP pode ser observado em 30-50% das células HeLa de 20 h após a transfecção (Figura 1A). A análise Western blot das fracções NS e SS utilizando anticorpo anti-GFP mostra uma banda distinta de Atxn1 82Q-GFP entre 100 kDa e 150 kDa marcadores, o que corresponde ao peso molecular da proteína (Figura 1B). Atxn1 82Q-GFP na fracção SR pode ser detectada ...

Discussão

Os mecanismos que regulam a degradação de proteínas mal dobradas são essenciais para a manutenção da homeostase de proteínas celulares, e que provavelmente representam alvos de medicamentos valiosos para o tratamento de doenças neurodegenerativas e outras doenças misfolding-proteína. Aqui, os ensaios que examinam a degradação de proteínas mal dobradas são descritos, utilizando uma proteína patogénica Atxn1 (Atxn1 82Q) e um mutante nuclear localizada luciferase (NLS-LucDM) como exemplos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Life Technologies	11995-092
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10082147
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019
NP-40	Sigma-Aldrich	NP40S-500ML
SDS	Sigma-Aldrich	L3771
MG132	Sigma-Aldrich	M8699
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C7698
Dithiothreitol (DTT)	Fisher Scientific	45000232
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche Boehringer Mannheim	4693159001
Bio-Dot Apparatus	Bio-Rad	1706545
Living Colors GFP Monoclonal Antibody	Clonetech	632375
Anti-Actin mAb Rabbit, IgG	Sigma-Aldrich	A45060-200UL
Amino acids	Sigma-Aldrich		Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium
Olympus IX-81  Inverted Fluorescence Microscope	Olympus	IX71/IX81
96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom	Sigma-Greiner	89135-048
Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO	TECAN	Infinite 200® PRO
Cellulose acetate membrane 0.2 µm	Sterlitech	CA023001
Prism 5	GraphPad		Statistical analysis software