Saggi per la degradazione delle proteine ​​nelle cellule mal ripiegate

Riepilogo

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

Abstract

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

Introduzione

Le proteine ​​sono macromolecole più abbondanti nelle cellule, e svolgono un ruolo essenziale in quasi tutti i processi biologici. L'attività biologica della maggior parte delle proteine ​​richiede la loro piegatura in, e mantenendo, i nativi strutture tridimensionali. Proteine ​​con conformazioni aberranti non solo perdono le loro normali funzioni, ma anche spesso formano specie oligomeriche solubili o aggregati che compromettono le funzioni di altre proteine ​​e sono tossici per le cellule ^1,2. Per contrastare misfolding, le cellule utilizzano entrambe le chaperon molecolari, che assistono polipeptidi non piegati o parzialmente piegati per raggiungere la loro conformazione nativa, e vie di degradazione, che eliminano le proteine ​​mal ripiegate ^3. Data la complessità e la natura stocastica del processo di piegatura, proteine ​​misfolding è inevitabile, e non può essere invertito nel caso di mutazioni, errori biosintetici e danni post-traduzionali ^1. Quindi, in ultima analisi, le cellule si basano su degradatpercorsi di ioni per mantenere la qualità delle proteine.

L'importanza del controllo della qualità delle proteine ​​cellulari (PQC) sistemi è sottolineata dalla prevalenza di malattie proteine ​​misfolding, tra cui il cancro, il diabete, e molte malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la sclerosi laterale amiotrofica, malattia di Huntington (HD), e atassie spinocerebellari (SCA) ^4,5. Ad esempio, le mutazioni nel p53 soppressore del tumore è la singola lesione più frequentemente genetico nei tumori, associata a ~ 50-70% di tutti i casi ^6. Una frazione sostanziale di p53 mutazioni sono mutazioni missenso che alterano la conformazione di p53, che porta alla formazione di aggregati ^7. Inoltre, le proteine ​​con tratti polyQ espanse sono geneticamente e patologicamente associati con HD e SCA. Queste malattie progressive e spesso fatali manifesta quando la lunghezza del tratto polyQ nelle proteine ​​coinvolte supera un certo THREStenere, e diventa sempre più gravi come la lunghezza del tratto polyQ prolunga ^8.

Un approccio interessante per il trattamento di queste malattie è quello di rafforzare i sistemi terapeuticamente PQC cellulari, in particolare le vie di degradazione. Tuttavia, i meccanismi coinvolti nella degradazione delle proteine ​​difettose, in particolare quelli in cellule di mammifero, rimangono poco conosciuti. Anche se è stato riconosciuto che il proteasoma è di fondamentale importanza per la degradazione di proteine ​​mal ripiegate, una questione vitale rimane indefinito: come proteine ​​mal ripiegate sono specificamente riconosciuti e mirati per la degradazione. Inoltre, anche se i sistemi PQC sono stati identificati in compartimenti cellulari compreso il citoplasma, il reticolo endoplasmatico, e il mitocondrio, i sistemi PQC nel nucleo rimangono poco chiari ^2.

Recenti studi nostro laboratorio hanno identificato un sistema che riconosce e degrada una varietà di proteine ​​mal ripiegate nel nucleocellule di mammiferi ^9. Questo sistema è composto da proteine ​​promielocitica (PML), una proteina nucleare e un membro della famiglia di proteine ​​tripartita motivo contenenti (TRIM), e RNF4, un anello di dominio contenenti proteine. PML, e diverse altre proteine ​​TRIM, in possesso di SUMO (piccolo modificatore ubiquitina-simile) E3 ligasi attività, che facilita la specificità e l'efficienza delle proteine ​​SUMOylation ^10. RNF4 appartiene a un piccolo gruppo di ubiquitina ligases SUMO mirati (Stübl), che contengono uno o più motivi di sumo-interagenti (SIMS) in aggiunta al dominio anello che consente loro l'attività ubiquitina ligasi ^11. Abbiamo scoperto che PML riconosce specificamente proteine ​​mal ripiegate attraverso discrete siti di riconoscimento substrato che può discernere caratteristiche distinte sulle proteine ​​mal ripiegate. In seguito al legame, tag PML misfolded proteine ​​con poli-catene di Sumo2 / 3, due quasi identici proteine ​​SUMO mammiferi che possono formare poli-catene a causa dell'esistenza di un sito SUMOylation interna. Sproteine ​​mal ripiegate UMOylated vengono poi riconosciuti da RNF4, che conduce alla loro degradazione ubiquitination e del proteasoma. Abbiamo inoltre dimostrato che il sistema di PML-RNF4 è importante per la protezione contro la neurodegenerazione, come carenza di PML aggrava i difetti comportamentali e neuropatologici di un modello murino di tipo SCA 1 (SCA1) ^9.

Per distinguere la degradazione delle proteine ​​da altri meccanismi cellulari che possono regolare i livelli di proteine, i tassi di turnover proteico è stato misurato ^9. Tra i metodi più frequentemente utilizzati per determinare il ricambio proteico sono inseguimento del polso e cicloesimide Chase (CHX). Questi due metodi esaminano nel tempo, rispettivamente, le proteine ​​con radioisotopo di interesse in cellule di traduzione-abile e proteine ​​totali preesistenti di interesse in cellule di traduzione inibito. Tuttavia, una grande sfida per studiare proteine ​​patogeni e misfolding incline è che l'emivita di queste proteine ​​può essere estremamente long. Ad esempio, Ataxin-1, Ataxin-7, huntingtina, α-sinucleina e TDP-43 tutti hanno tempi di dimezzamento di più di 12 a 24 ore ^9,12-16. I tassi di turnover lente di queste proteine ​​precludono l'uso dell'analisi CHX chase perché le cellule che ospitano queste proteine ​​non possono sopravvivere inibizione traduzione prolungata, particolarmente perché le proteine ​​mal ripiegate stessi possono essere altamente tossici per le cellule. L'analisi pulse-chase con etichettatura isotopica può anche essere difficile per le proteine ​​che sono altamente aggregazione-prona. La maggior parte dei saggi pulse-chase basano su immunoprecipitazione per separare la proteina di interesse da tutte le altre proteine ​​che sono anche marcato radioattivamente. Questa procedura normalmente include procedure di immunoprecipitazione e di lavaggio lunghi, durante i quali gli aggregati SDS-insolubili possono formare, rendendo l'analisi con SDS-PAGE elettroforesi imprecisa.

Qui un protocollo per analizzare le proteine ​​mal ripiegate nucleari con un tasso di turnover lento è descritto ⁹. Una forma patogena di Ataxin-1 (ATXN1) che contiene un tratto di 82 glutamines (ATXN1 82Q) viene utilizzato per questo scopo ^8. Quando espresso in cellule, una maggiore green fluorescent protein (GFP) fusione di forme ATXN1 82Q microscopiche inclusioni visibili nel nucleo (Figura 1A). Analisi Pulse caccia rivela che il tempo di dimezzamento di Ataxn1 82Q è di oltre 18 ore ^9. ATXN1 82Q è composta da specie con conformazioni mal ripiegate di caratteristiche diverse, nonché specie con conformazione nativa. È probabile che queste specie sono degradati a velocità diverse, e pertanto dovrebbe essere analizzato separatamente. Lisati da ATXN1 82Q-GFP-cellule che esprimono sono frazionati in NP-40-solubili (solubile o NS, probabilmente rappresentano proteine ​​native o mal ripiegate proteine ​​monomeriche / oligomerica) e (NI, aggregati / misfolded) porzioni NP-40-insolubile. Quest'ultimo può essere ulteriormente suddiviso in SDS-solubili (SS; probabili aggregati disordinati) o SDS-resistente (SR; probabili fibrille amiloidi) Frazioni (Figura 1B). frazioni NS e SS possono essere analizzati mediante SDS-PAGE seguita da western blotting, mentre la frazione SR può essere rilevato tramite saggi filtro di ritardo seguiti da immunoblotting. CHX chase è combinato con il metodo di frazionamento del detersivo, e ha scoperto che l'emivita di SS ATXN1 82Q è molto più breve di quella di NS ATXN1 82Q e totale ATXN1 82Q (Figura 2A), indicando che la frazione SS può essere facilmente riconosciuto e degradato nelle cellule ^9. Così, questo metodo fornisce un potente strumento per studiare la dinamica di proteine ​​mal ripiegate e per confrontare il loro modello di degrado.

Noi descriviamo anche un metodo che è adatto per screening ad alta per identificare macromolecole o piccoli composti che possono modulare la degradazione delle proteine ​​mal ripiegate. Questo metodo si basa su un mutante conformazionalmente destabilizzata di lucciola luciferasi (LucDM) ^17, un substrato modello di chaperone. Abbiamo fusibiled LucDM ad un segnale di localizzazione nucleare (NLS) per sondare il sistema PQC in questo compartimento cellulare, e GFP (NLS-LucDM-GFP) per comodità di rilevamento. Forme NLS-LucDM-GFP microscopicamente aggregati nucleari visibili in una piccola percentuale di cellule (Figura 3A). Simile a ATXN1 82Q, NLS-LucDM-GFP-ma non la sua wild-type omologo NLS-LucWT-GFP-viene modificato da Sumo2 / 3 e regolamentata dalla via PML-RNF4 ^9. NLS-LucDM-GFP costituisce anche SS e le specie SR, anche se le quantità relative di SS e di specie SR sono minime rispetto a NS, utilizzando le condizioni di cui al protocollo 3. Per semplificare l'analisi, abbiamo solo analizziamo SDS LucDM solubile (compresi sia gli NS e frazioni SS) per SDS-PAGE e Western Blot. Importante, assay chase CHX mostrato che l'emivita di SDS-solubile NLS-LucDM-GFP è molto più breve di quella del suo wild-type controparte (Figura 3B), suggerendo che LucDM è un substrato specifico per il sistema che riconosce e si degradaproteine ​​mal ripiegate.

La degradazione di LucDM-GFP provoca un calo significativo segnale complessivo di fluorescenza. Pertanto, abbiamo anche sviluppato un protocollo per la rilevazione in tempo reale di cellulari LucDM-GFP mediante test a base di fluorescenza micropiastre. Molti sistemi schermo high-throughput (HTS) sono sviluppati per i farmaci o geni modificatori aggregati cellulari e vitalità cellulare causate da proteine ​​aberranti ^18-20. Tuttavia, molto pochi HTS sono specificamente progettati per il targeting degrado in cellule di mammifero. Questo protocollo serve come sistema robusto per analisi rapide e su larga scala degli effetti di espressione proteica, l'abbattimento e trattamento farmacologico sulla degradazione di proteine ​​misfolded cellulare. Utilizzando cellule HeLa come ad esempio, di seguito descriviamo i protocolli per l'analisi di queste due proteine ​​mal ripiegate. I saggi possono essere applicati anche ad altre linee cellulari, anche se può essere necessario ottimizzato per singole linee cellulari condizioni di trasfezione e decorso.

Protocollo

1. Preparazione del reagente

1. Preparare tampone di lisi cellulare (50 mM Tris, pH 8,8, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl _2, 0,5% NP-40). Supplemento 2 mM DTT, 1x completo cocktail proteasi, e 250 UI / ml benzonasi prima dell'uso.
2. Preparare tampone per sedimento (20 mM Tris, pH 8,0, 15 mM MgCl _2). Supplemento 2 mM DTT, 1x completo cocktail proteasi e 250 UI / ml benzonasi prima dell'uso.
3. Preparare tampone di ebollizione 3x (6% SDS, 20 mM Tris, pH 8,0). Supplemento 150 mM DTT prima dell'uso.
4. Preparare terreno DMEM bassa fluorescenza per i test che utilizzano lettore di micropiastre a fluorescenza. Mescolare 25 mM glucosio, 0,4 mm glicina, 0,4 mm arginina, 0,2 mM cisteina, 4,0 mm glutammina, 0,2 mM istidina, 0,8 mm isoleucina, 0,8 mm leucina, 0,8 mm lisina, 0,2 mM metionina, 0,4 mm fenilalanina, 0,4 mm serina, 0,8 mM treonina, triptofano 0,078 mM, 0,4 mm tirosina, valina 0,8 mm, 1,8 mm CaCl _2, 0,81 mM MgSO _4, 5,33 mM KCl, 44,0 mM NaHCO _3, 110 mM NaCl, 0,9 mmNaH ₂ PO _4. Regolare il pH della soluzione con HCl o NaOH a pH 7,4. Sterilizzare il medium attraverso la filtrazione.
   NOTA: Questo terreno contiene componenti del terreno standard DMEM con elevato glucosio, tranne che Fe (NO _{3) 3,} vitamine e rosso fenolo vengono omessi. Fenolo rosso, riboflavina e pyridoxal a regolare terreno di coltura DMEM significativamente interferisce con il rilevamento del segnale di fluorescenza ^21. Terreno di coltura senza quei componenti è fondamentale per il successo di imaging GFP cellule vive. Il mezzo è stabile per 12 mesi se conservato in frigorifero.

2. Il degrado del test di ATXN1 82Q GFP

1. Piastra di circa 3 x 10 ⁵ cellule HeLa in piastre da 35 mm con terreno DMEM supplementato con siero fetale bovino 10% (FBS), in modo che dopo O / N cellule di coltura crescere ad una confluenza del 40-60% al momento della transfezione.
   NOTA: Il numero di piatti necessari si basa sul numero di punti di tempo e trattamenti described sotto.
2. Cellule HeLa trasfezione con 0,3 mg di ATXN1 82Q-GFP / pRK5 plasmide in tutti i pozzetti usando il reagente di trasfezione in base alle istruzioni del produttore ^9. Fare un master mix trasfezione contenente DNA e trasfezione reagente e un'aliquota per ogni pozzetto.
3. 4-5 ore dopo la trasfezione, esaminare le cellule vive sotto un microscopio a fluorescenza invertito per l'espressione della GFP con eccitazione lunghezza d'onda di 450-490 nm. Rientro cellule torna a incubatrice dopo l'imaging.
   NOTA: Osservare entrambi i segnali GFP diffusi e piccole macchie di segnali GFP a nucleo in questo momento.
4. Rimuovere il mezzo con aspirazione a vuoto e aggiungere 2 ml di DMEM fresco contenente 50 mg / ml CHX. Trattare cellule per 0, 4, 8, 12 e 16 ore con CHX prima della raccolta. Per esaminare la degradazione proteasoma, includere proteasoma inibitore MG132 (10 mM) in una piastra trattate per 16 ore come controllo.
5. Raccolto un piatto di cellule in ogni punto. Rimuovere il supporto dal vuoto di aspirazione di und lavare le piastre due volte con 3 ml ghiacciata 1x tampone fosfato salino (PBS). Snap-congelare la piastra in ghiaccio secco.
6. Dopo l'ultimo punto di tempo (16 ore), raschiare le cellule congelate (da tutti i punti di tempo) in 150 ml di tampone di lisi cellulare ghiacciato e incubate in ghiaccio per 30 min.
7. Centrifugare i lisati cellulari in una centrifuga da banco a 17.000 xg per 15 min a 4 ° C.
8. Trasferire il surnatante, contenente NP-40-solubili proteine ​​(NS), in un'altra provetta con una pipetta.
   NOTA: Utilizzare surnatanti per misurare concentrazioni di proteine ​​da saggio Bradford, se necessario.
9. Lavare il pellet con l'aggiunta delicatamente circa 200 microlitri 1x PBS per i tubi senza disturbare il pellet. Rimuovere con attenzione PBS mediante aspirazione a vuoto o una pipetta. li Risospendere in 150 microlitri di buffer pellet cellulare ghiacciata, seguito da 15-30 min di incubazione in ghiaccio.
   NOTA: La frazione sedimento risospeso contiene NP-40 insolubili proteine ​​(NI). Si veda la Figura 1B per un diagram di detergente frazionamento.
10. Aggiungere 75 ml di 3x tampone bollente in frazioni NS e 40 NP-insolubili frazioni (NI) risospese dal pellet. Riscaldare i campioni a 95 ° C su un blocco di calore per 5 min.
    NOTA: Ciuffi nei NP-40 frazioni insolubili sono sciolti dopo il riscaldamento ed i campioni diventerà chiaro.
11. Aggiungere tampone di caricamento SDS-gel per una aliquota di NS bollite e NI. Caricare uguale volume di campioni raccolti da tutti i punti di tempo a gel SDS-PAGE. Il volume caricato corrisponda a circa 20 mg di NS dal campione prelevato al tempo 0. NOTA: NS, oltre che di proteine ​​SDS-solubili (SS) da NI fazione, possono essere risolti mediante SDS gel separazione. Al contrario, SDS-resistente (SR) aggregati da frazione NI sono bloccati nei pozzetti di gel di carico (Figura 1B). Per migliorare il rilevamento Western Blot, doppio volume di NI può essere caricato.
12. Rileva NS e SS ATXN1 82Q-GFP mediante western blot utilizzando un anticorpo anti-GFP e chemiluminescenza (ECL).
    NOTA: ATXN1 82Q nella frazione SS è generalmente inferiore rispetto alla frazione NS quando si utilizza questo protocollo. è necessaria più di esposizione per i segnali ECL ottimali.
13. Esaminare SR ATXN1 82Q dalla frazione pellet mediante saggi ritardo filtro utilizzando un apparato di dot-blot (Figura 1B). In breve, ha istituito un apparato dot-blot in possesso di una membrana di acetato di cellulosa 0,2 micron. Carico 80-120 microlitri di bollito NI in ogni pozzetto dell'apparato dot-blot.
    NOTA: Poiché solo piccole quantità di aggregati SR si formano nelle cellule, per il saggio dot blot, caricare un volume della frazione SR che è circa 10-15 volte del volume della frazione NS usato per analisi western blot.
    1. Dopo filtrazione dei campioni attraverso la membrana dal vuoto, aggregati ATXN1 82Q-GFP bloccato sulla membrana può essere rilevato da anti-GFP immunoblotting ^9,12,22.
       NOTA: Vedere precedenti relazioni ^9,12,22 per la descrizione dettagliata del test del filtro di ritardo. Questo passaggio è facoltativoperché SR ATXN1 82Q è minima rispetto a SS e NS frazioni seguenti breve trasfezione descritto in questo protocollo. Inoltre, i livelli di SR ATXN1 82Q in gran parte rimangono gli stessi nel corso CHX Chase (Figura 2B). Tuttavia, è ancora fondamentale per esaminare se le quantità di SS ATXN1 82Q sono influenzati nel tempo per qualsiasi trattamento farmacologico o espressione genica in esperimenti iniziali. Specie proteina SS rimanere in pozzetti di caricamento del gel SDS-PAGE possono essere rilevati mediante western blot. Tuttavia, questo metodo è meno sensibile e genera risultati variabili più (Figura 1B).

3. Degradazione Assay di NLS-luciferasi-GFP Utilizzando SDS-PAGE e Western Blot

1. Piastra di circa 3 x 10 ⁵ cellule HeLa in piastre da 35 mm con terreno DMEM supplementato con siero fetale bovino al 10% (FBS). Dopo O / N coltura, una confluenza del 40-60% viene raggiunta al momento della transfezione. Il numero di piatti necessari si basa sul numero di tpunti IME e trattamenti descritti di seguito.
2. Cellule HeLa trasfezione con 1,0 mcg NLS-luciferasi-GFP / pRK5 plasmide in tutti i pozzetti usando il reagente di trasfezione in base alle istruzioni del produttore ^9. Fare un master mix trasfezione contenente DNA e reagenti trasfezione per aliquota di ogni bene.
3. Dopo O / N trasfezione (circa 15 ore), esaminare le cellule vive sotto un microscopio a fluorescenza invertito per l'espressione della GFP con eccitazione lunghezza d'onda di 450-490 nm. Rientro cellule torna a incubatrice dopo l'imaging.
   NOTA: Diffusa segnale GFP nucleare può essere osservato nella maggior parte delle cellule (70%). Una piccola percentuale (5%) di cellule hanno aggregati nucleari.
4. Rimuovere il mezzo con aspirazione a vuoto e aggiungere 2 ml di DMEM fresco contenente 50 mg / ml CHX. Il trattamento di cellule per 0, 1.5, 3, 4,5 e 6 ore con CHX prima della raccolta. Per esaminare la degradazione del proteasoma, includere ulteriori MG132 inibitore del proteasoma (10 micron) in una piastra trattati per 6 ore come controllo.
5. Raccolto un piatto di cellule in ogni punto. Rimuovere il mezzo con aspirazione a vuoto e lavare due volte le piastre con 3 ml ghiacciata tampone fosfato salino (PBS). Snap-congelare la piastra in ghiaccio secco.
6. Dopo l'ultimo punto di tempo (6 ore) è terminata, cellule congelate a tutti i tempi punti vengono raschiati in 150 ml di tampone di lisi cellulare ghiacciato e incubate in ghiaccio per 30 min.
7. Aggiungere SDS tampone di gel-loading di lisati cellulari totali per una concentrazione finale del 2% SDS e 50 mM DTT. Incubare i campioni su un blocco di calore a 95 ° C per 5 min.
8. Analizzare NLS-luciferasi-GFP mediante SDS-PAGE e Western Blot utilizzando anticorpi anti-GFP. Caricare uguale volume di campioni raccolti da tutti i punti di tempo a gel SDS-PAGE. Il volume caricato corrisponde a circa 20 mg di lisati cellulari intero da campione prelevato al tempo 0.

4. in tempo reale degradazione Assay di NLS-luciferasi-GFP Usando fluorescenza lettore di micropiastre

1. Seme di circa 1 x 10 ⁴cellule HeLa in 96 pozzetti piastre di coltura di tessuto nero con fondo trasparente. Dopo O / N coltura, una confluenza del 50-70% viene raggiunta al momento della transfezione.
   NOTA: 60 ml di mezzo contenente cellule HeLa completamente in sospensione sono seminati direttamente in tutti i pozzetti. Non aggiungere ulteriore piatto di medie o rock avanti e indietro dopo la semina, in caso contrario le cellule possono essere distribuiti in modo non uniforme.
2. Cellule HeLa trasfezione con 0,05-0,1 mg di NLS-luciferasi-GFP / pRK5 plasmide ⁹ in ogni pozzetto utilizzando il reagente di trasfezione in base alle istruzioni del produttore. Fare un master mix trasfezione contenente DNA e trasfezione reagente e un'aliquota per ogni pozzetto. Tre pozzetti con cellule non sono trasfettate con DNA, che serve come controllo per il segnale fluorescenza per ogni condizione di trattamento.
   NOTA: Un modo alternativo per ridurre le variazioni transfezione è trasfezione le cellule prima della semina. Tuttavia, una grande porzione di cellule trasfettate con la proteina misfoldeds non riescono a collegare o mostrare la vitalità ridotta utilizzando questo metodo. E 'probabile che alcune cellule non possono sopportare lo stress causato dalla tripsina digestione quando esprimono le proteine ​​mal ripiegate tossici. Come risultato, il segnale fluorescente complessiva è significativamente ridotta.
3. 20-24 ore dopo la trasfezione, esaminare le cellule vive sotto un microscopio a fluorescenza invertito per l'espressione della GFP con eccitazione lunghezza d'onda di 450-490 nm.
4. Rimuovere il mezzo con aspirazione a vuoto. Aggiungere circa 200 ml PBS 1X a ciascun bene e poi aspirare per rimuovere quantità residua di terreno DMEM.
5. Aggiungere 60 ml di bassa fluorescenza media DMEM con il 5% FBS e 50 ug / ml CHX. Per esaminare la degradazione del proteasoma, includere ulteriori MG132 inibitore del proteasoma (10 micron) in una serie di campioni. Set triplicato di pozzi per ogni trattamento / condizione.
   NOTA: il trattamento MG132 è incluso come controlli per la degradazione del proteasoma, perché è fondamentale per escludere altri fattori che possono causare goccia di fluoSegnale rescence, tra cui la morte cellulare e fluorescenza tempra.
6. Misurare il segnale di fluorescenza di GFP immediatamente su un lettore di piastre a fluorescenza dopo l'aggiunta di CHX.
   NOTA: Le impostazioni di misura software sono riportate in Tabella 1.
7. Leggere la piastra ogni ora per un massimo di 8-10 ore. Dopo aver letto, riportare la piastra posteriore di coltura cellulare incubatore.
8. Esportare i dati come file di foglio di calcolo. Utilizzare valore medio di multi-letture per ciascun pozzetto come intensità di fluorescenza. Normalizzare i valori di ciascun punto di dati per i valori medi del Tempo 0 nei rispettivi gruppi. Tracciare l'intensità di fluorescenza normalizzato nel tempo, come mostrato in Figura 4A e 4B, e la figura 5, pannelli a destra.
9. Effettuare analisi statistiche delle velocità di degradazione tra due condizioni utilizzando ANOVA a due vie con misure ripetute ^23.
   NOTA: In questa analisi, "intensità di fluorescenza" è la variabile dipendente, mentre "treatmcondizioni ENT "e" tempo "sono i due fattori. Invece di confrontare dati a singoli punti di tempo, ANOVA a due vie con misure ripetute analizza la differenza tra i due gruppi di trattamento durante l'intero corso del tempo.

Risultati

In un'analisi stato stazionario, microscopicamente visibili aggregati nucleari ATXN1 82Q-GFP possono essere osservati in 30 - 50% di cellule HeLa 20 ore dopo la trasfezione (Figura 1A). Analisi Western blot delle frazioni NS e SS con anticorpo anti-GFP mostra una banda distinta ATXN1 82Q-GFP tra 100 kDa e 150 kDa marcatori, corrispondente al peso molecolare della proteina (Figura 1B). ATXN1 82Q-GFP nella frazione SR può essere rilevata mediante sagg...

Discussione

I meccanismi che regolano la degradazione delle proteine ​​misfolded sono essenziali per mantenere l'omeostasi delle proteine ​​cellulari, e che probabilmente rappresentano bersagli farmacologici preziose per trattare malattie neurodegenerative e altre malattie proteine ​​misfolding. Qui, saggi che esaminano la degradazione delle proteine ​​misfolded sono descritti, utilizzando una proteina patogena ATXN1 (ATXN1 82Q) ed un mutante nucleare localizzata luciferasi (NLS-LucDM) come esempi.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Life Technologies	11995-092
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10082147
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019
NP-40	Sigma-Aldrich	NP40S-500ML
SDS	Sigma-Aldrich	L3771
MG132	Sigma-Aldrich	M8699
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C7698
Dithiothreitol (DTT)	Fisher Scientific	45000232
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche Boehringer Mannheim	4693159001
Bio-Dot Apparatus	Bio-Rad	1706545
Living Colors GFP Monoclonal Antibody	Clonetech	632375
Anti-Actin mAb Rabbit, IgG	Sigma-Aldrich	A45060-200UL
Amino acids	Sigma-Aldrich		Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium
Olympus IX-81  Inverted Fluorescence Microscope	Olympus	IX71/IX81
96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom	Sigma-Greiner	89135-048
Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO	TECAN	Infinite 200® PRO
Cellulose acetate membrane 0.2 µm	Sterlitech	CA023001
Prism 5	GraphPad		Statistical analysis software