מבחנים עבור הפירוק של חלבונים בתאים Misfolded

Summary

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

Abstract

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

Introduction

החלבונים הם מקרומולקולות הנפוצים ביותר בתאים, והם ממלאים תפקיד חיוני בכל התהליכים הביולוגיים כמעט. הפעילות הביולוגית של רוב החלבונים דורש המתקפלים שלהם לתוך, ושמירה, המבנים תלת מימדי הילידים. חלבונים עם תצורות סוטות לא רק לאבד פונקציות הרגילות שלהם, אלא גם לעתים קרובות מהווים מיני oligomeric מסיסים או אגרגטים הפוגעים פונקציות של חלבונים אחרים רעילים ^1,2 תאים. כדי לנטרל misfolding חלבון, תאים להעסיק שני מלווים מולקולריים, אשר מסייעים פוליפפטידים פרשו או חלקית מקופל להגיע קונפורמציה האם שלהם, מסלולים שפלים, המבטלים חלבוני misfolded ^3. בהתחשב במורכבות והטבע סטוכסטיים של תהליך הקיפול, misfolding חלבון הוא בלתי נמנע, זה לא יכול להיות הפוך במקרה של מוטציות, שגיאות biosynthetic, ופוסט translational נזקים ^1. לפיכך, התאים בסופו של דבר להסתמך על degradatמסלולי יון כדי לשמור על איכות החלבון שלהם.

חשיבותה של בקרת איכות חלבון הסלולר (PQC) מערכות מודגשת על ידי שכיחות המחלות misfolding-חלבון, כולל סרטן, סוכרת, הפרעות ניווניות רבות כגון מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, טרשת לרוחב amyotrophic, מחלת הנטינגטון (HD), ו ataxias spinocerebellar (SCA) ^4,5. לדוגמא, מוטציות p53 המדכאים גידולים הוא הנגע היחיד ביותר הגנטי לעתים קרובות בגידולים, הקשורים ~ 50-70% מכלל המקרה ^6. חלק ניכר של מוטציות p53 הם מוטציות missense המשנים את הקונפורמציה של p53, המוביל להיווצרות של אגרגטים ^7. יתר על כן, חלבונים עם מתיחות polyQ המתרחבות גנטית פתולוגית הקשורה HD ו SCA. מחלות פרוגרסיבי ולעתים אף קטלניות אלה מניפסט כאשר אורכו של קטע polyQ בחלבונים הפגועים עולה על thres מסויםלהחזיק, ואז הוא הופך יותר ויותר קשה ככל שהאורך של מתיחת polyQ מאריך ^8.

גישה אטרקטיבית לטיפול במחלות אלה היא לחזק טיפולי מערכות PQC הסלולר, במיוחד את המסלולים השפלים. עם זאת, את המסלולים המעורבים פירוק של חלבונים פגומים, במיוחד אלה בתאי יונקים, להישאר ממעטים להבין. למרות שזה הוכר כי הפרוטאזום יש חשיבות קריטית עבור הפירוק של חלבוני misfolded, סוגיה חיונית נשארה בלתי מוגדרת: איך misfolded חלבונים מוכרים במיוחד וממוקד שפלה. יתר על כן, למרות מערכות PQC זוהו תאים סלולריים כולל הציטופלסמה, הרטיקולום endoplasmic, ואת מיטוכונדריון, מערכות PQC בגרעין עדיין אינן ברורות ^2.

מחקרים שנעשו לאחרונה על ידי המעבדה שלנו זיהו מערכת שתופש מדרדרת מגוון של חלבונים misfolded בגרעיןשל יונקים תאים ^9. מערכת זו מורכבת של חלבון פרומיילוציטית (PML), חלבון גרעיני חבר מוטיב המכילים המשולשת (TRIM) המשפחה חלבון, RNF4, תחום-RING המכיל חלבון. PML, וכמה חלבונים TRIM אחרים, להחזיק SUMO (המשתנה 'היוביקוויטין דמוי קטן) פעילות האנזים E3, אשר הופך לפשוט את הספציפיות והיעילות של חלבון SUMOylation ^10. RNF4 שייך לקבוצה קטנה של ליגאזות היוביקוויטין SUMO במיקוד (STUbL), אשר מכילים מוטיבים סומו אינטראקציה אחד או יותר (SIMS) בנוסף תחום RING שמקנה להם את פעילות האנזים היוביקוויטין ^11. מצאנו כי PML במיוחד מזהה חלבוני misfolded דרך אתרי הכרת מצע דיסקרטיים שיכול להבחין ייחודיות על חלבוני misfolded. עם מחייב, תגי PML misfolded חלבונים עם פולי-שרשראות של SUMO2 / 3, שני חלבונים SUMO יונקים כמעט זהה כי יכול להיווצר פולי-שרשראות בשל קיומו של אתר SUMOylation פנימי. Sחלבונים misfolded UMOylated מוכרים ולאחר מכן על ידי RNF4, אשר מוביל לזילות ubiquitination ו proteasomal שלהם. בנוסף, אנו הראו כי מערכת PML-RNF4 חשוב להגנה מפני ניוון מוחיים, כמו מחסור PML מחריף הפגמים התנהגותיות נוירו של במודל של עכברים של SCA סוג 1 (SCA1) ^9.

כדי להבחין פירוק חלבונים מן המנגנונים תאיים אחרים שעשויים לווסת את רמות חלבון, ושיעור עזיבת חלבון נמדד ^9. בין השיטות הנפוצות ביותר כדי לקבוע מחזור חלבון הם מרדף דופק cycloheximide (chx) מרדף. שתי שיטות אלו בודקות לאורך זמן, בהתאמה, את החלבונים שכותרתו רדיואיזוטופיים של ריבית בתאי תרגום-בקיא וחלבונים קיימים מראש כולל של ריבית בתאים-עכבות תרגום. עם זאת, אתגר גדול ללימוד חלבונים פתוגניים misfolding נוטה הוא כי זמן מחצית החיים של חלבונים אלה יכולים להיות מאוד long. לדוגמה, Ataxin-1, Ataxin-7, huntingtin, α-synuclein, ו TDP-43 כל זמן מחצית חיים של יותר מ 12 עד 24 שעות ^9,12-16. שיעורי התחלופה האיטיים של החלבונים האלה להוציא את השימוש בניתוח מרדף chx כיוון שתא מחסה חלבונים אלה לא יכול לשרוד עיכוב תרגום ממושך, במיוחד משום שחלבוני misfolded עצמם יכולים להיות רעילים לתאים. הניתוח הדופק מרדף עם תיוג איזוטופי עשוי גם להיות מאתגר עבור חלבונים כי הם מאוד צבירה נוטה. רוב מבחני הדופק מרדף להסתמך על immunoprecipitation להפריד את החלבון של עניין מכל חלבונים אחרים אשר גם מסומנים רדיואקטיבית. הליך זה בדרך כלל כולל נהלי immunoprecipitation לשטוף ממושך, שבמהלכו SDS-מסיסי אגרגטים יכולים ליצור, מה שהופך את הניתוח עם SDS-PAGE אלקטרופורזה מדויק.

הנה פרוטוקול לנתח חלבוני misfolded גרעין עם תחלופה איטית מתוארת ⁹. צורה פתוגניים של Ataxin-1 (Atxn1) שמכיל מתיחה של 82 glutamines (Atxn1 82Q) משמש למטרה זו ^8. כאשר לידי ביטוי בתאים, חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת (GFP) היתוך של צורות Atxn1 82Q תכלילים גלוי מיקרוסקופית בגרעין (איור 1 א). ניתוח מרדף דופק מגלה כי זמן מחצית החיים של Ataxn1 82Q הוא מעל 18 שעות ^9. Atxn1 82Q מורכב מינים עם תצורות misfolded של מאפיינים שונים, כמו גם מינים עם קונפורמציה הילידים. סביר להניח כי מינים אלה מפורקים בשיעורים שונים, ובכך יש לנתח בנפרד. Lysates מ 82Q-GFP להביע תאי Atxn1 הם מופרדים לתוך NP-40-מסיס (מסיס או NS, מייצג חלבוני ילידים סביר או חלבוני monomeric misfolded / oligomeric) ו- NP-40-מסיסים (NI, מצטבר / misfolded) חלקים. השלב האחרון ניתן לחלוקה נוספת לתוך SDS-מסיסים (SS; אגרגטים סדר סביר) או SDS-עמיד (SR; סיבי עמילואיד סבירשברים) (איור 1 ב). שברי NS האס יכולים להיות מנותחים על ידי SDS-PAGE ואחריו מערבי סופג, ואילו חלק SR יכול להיות מזוהה על ידי מבחני פיגור המסנן ואחריו immunoblotting. מרדף chx בשילוב עם שיטת חלוקת חומרי הניקוי, וגילה כי זמן מחצית החיים של SS Atxn1 82Q הוא הרבה יותר קצר מזה של NS Atxn1 82Q והמוחלט Atxn1 82Q (איור 2 א), המציין כי חלק SS ניתן להכיר בקלות והשפיל בתאים ^9. לכן, שיטה זו מספקת כלי רב עוצמה כדי ללמוד את הדינמיקה של חלבונים misfolded ולהשוות דפוס השפלה שלהם.

כמו כן, אנו מתארים שיטה כי הוא מתאים להקרנת תפוקה גבוהה לזיהוי מולקולות או תרכובות קטנות שיכול להשפיע על הפירוק של חלבוני misfolded. שיטה זו מבוססת על מוטצית ערער conformationally של בלוציפראז גחלילית (LucDM) ^17, מצע מלווה מודל. יש לנו פתילד LucDM לאות לוקליזציה גרעיני (NLS), שנועד לבחון את מערכות PQC בתא הסלולרי הזה, ו- GFP (NLS-LucDM-GFP) לנוחות זיהוי. צורות NLS-LucDM-GFP אגרגטים גרעיניים גלויים מיקרוסקופי אצל אחוז קטן של תאים (איור 3 א). בדומה Atxn1 82Q, NLS-LucDM-GFP-אבל לא עמיתו wild-type שלה NLS-LucWT-GFP-הוא שונה על ידי SUMO2 / 3 ומוסדר על ידי מסלול PML-RNF4 ^9. NLS-LucDM-GFP מהווה גם SS ומינים SR, למרות הכמויות היחסיות של SS ומינים SR הן מינימליות לעומת NS, באמצעות התנאים המתוארים בפרוטוקול 3 להלן. כדי לפשט את assay, אנחנו רק לנתח SDS LucDM המסיס (כולל הוא את NS ושברי SS) על ידי SDS-PAGE ומערב כתם. חשוב לציין, assay מרדף chx הראה כי זמן מחצית החיים של SDS-מסיס NLS-LucDM-GFP הוא הרבה יותר קצר מזה של עמיתו wild-type שלה (איור 3), דבר המצביע על כך LucDM הוא מצע ספציפי עבור מערכת שתופש מדרדרתחלבוני misfolded.

השפלתו של LucDM-GFP גורמת לירידה משמעותית אותות קרינה כוללים. לכן, פיתחנו גם פרוטוקול זיהוי בזמן אמת של microplate הסלולר LucDM-GFP באמצעות assay הקרינה מבוססי. רבי מסך תפוקה גבוהה (HTS) מערכות מפותחות עבור תרופות או גני שינוי אגרגטים הסלולר ואת הכדאיות הסלולר נגרם על ידי חלבונים סוטים ^18-20. עם זאת, מעט מאוד HTSs נועד במיוחד למיקוד שפל בתאי יונקים. פרוטוקול זה משמש כמערכת חזקה לניתוח בקנה מידה הגדולה המהירה של התופעות של ביטוי חלבון, מציאה, וטיפול תרופתי על פירוק חלבונים הסלולר misfolded. שימוש בתאי הלה כמו למשל, נתאר את הפרוטוקולים לניתוח שני חלבונים misfolded אלה. המבחנים יכולים להיות מיושם גם שורות תאים אחרות, אם כי תנאי transfection ומהלכים זמן ייתכן שיהיו צורך מותאם שורות תאים בודדות.

Protocol

1. הכנת המגיב

1. הכן חיץ תמוגה התא (50 מ"מ טריס, 8.8 pH, 100 מ"מ NaCl, 5 מ"מ MgCl _2, 0.5% NP-40). מוסף 2 מ"מ DTT, קוקטייל פרוטאז השלם 1x, ו -250 IU / ml benzonase לפני השימוש.
2. הכן חיץ גלולה (20 מ"מ טריס, 8.0 pH, 15 מ"מ MgCl _2). מוסף 2 מ"מ DTT, קוקטייל פרוטאז השלם 1x ו -250 IU / ml benzonase לפני השימוש.
3. הכן חיץ רתיחה 3x (6% SDS, 20 מ"מ טריס, pH 8.0). מוסף 150 מ"מ DTT לפני השימוש.
4. כן בינוני DMEM נמוך קרינה עבור מבחנים באמצעות קורא קרינת microplate. מערבבים 25 גלוקוז מ"מ, 0.4 גליצין מ"מ, 0.4 ארגינין מ"מ, 0.2 מ"מ ציסטאין, 4.0 גלוטמין מ"מ, 0.2 היסטידין מ"מ, 0.8 isoleucine מ"מ, 0.8 מ"מ לאוצין, 0.8 מ"מ ליזין, 0.2 מ"מ מתיונין, 0.4 פנילאלנין מ"מ, 0.4 סרין מ"מ, 0.8 תראונין מ"מ, 0.078 טריפטופן מ"מ, 0.4 מ"מ טירוזין, 0.8 ולין מ"מ, 1.8 מ"מ CaCl _2, 0.81 מ"מ MgSO _4, 5.33 מ"מ KCl, 44.0 מ"מ NaHCO _3, 110 מ"מ NaCl, 0.9 מ"מלאא ₂ PO _4. התאם את ה- pH של הפתרון באמצעות HCl או NaOH ל- pH 7.4. לעקר את המדיום באמצעות סינון.
   הערה: בינוני זה מכיל רכיבים של מדיום DMEM הרגיל עם גלוקוז גבוה חוץ מזה פה (NO _{3) 3,} ויטמיני פנול אדום מושמטים. פנול אדום, ריבופלאבין ו pyridoxal במדיום תרבות קבוע DMEM להתערב באופן משמעותי עם זיהוי של אותות הקרינה ^21. בינוני תרבות ללא רכיבים אלה הוא קריטי עבור הדמיה לחיות תאים GFP מוצלח. המדיום הוא יציב במשך 12 חודשים, כאשר הם מאוחסנים בקירור.

Assay הביזוי 2. GFP Atxn1 82Q

1. פלייט כ 3 x 10 ⁵ תאים הלה לתוך 35 צלחות מ"מ עם המדיום DMEM בתוספת 10% עוברי בסרום שור (FBS), כך שלאחר O / N תאים culturing לגדול משילוב של גידול 40-60% בזמן transfection.
   הערה: מספר הצלחות הדרושות מבוסס על מספר נקודות זמן והטיפולים דescribed להלן.
2. Transfect הלה התאים עם 0.3 מיקרוגרם של Atxn1 82Q-GFP / pRK5 פלסמיד לתוך כל מגיב transfection באמצעות היטב בהתאם להוראות היצרן ^9. הכן תערובת transfection מאסטר המכיל מגיב דנ"א transfection ו aliquot זה עבור כל טוב.
3. 4-5 transfection פוסט hr, לבחון תאים חיים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה לביטוי GFP עם ננומטר גל עירור 450-490. חזרו תאים בחזרה חממה לאחר הדמיה.
   הערה: בדוק את שני אותות GFP מתפזרת כתמים קטנים של אותות ה- GFP בגרעין בשלב זה.
4. הסר בינוני על ידי שאיפה ואקום ולהוסיף 2 מ"ל DMEM טרי המכיל chx 50 מיקרוגרם / מ"ל. פנקו את התאים עבור 0, 4, 8, 12 ו -16 שעות עם chx לפני הקטיף. כדי לבחון שפלת proteasomal, כולל MG132 מעכבי פרוטאזום (10 מיקרומטר) בצלחת אחת שטופלה במשך 16 שעות כביקורת.
5. קציר צלחת אחת של תאים בכל נקודת זמן. הסר בינוני על ידי שאיפה ואקוםד לשטוף את הצלחות פעמיים עם 3 מ"ל בופר פוספט 1x קר כקרח (PBS). הצמד להקפיא את הצלחת על קרח יבש.
6. לאחר שהנקודה בפעם האחרונה (16 שעות), לגרד את התאים קפואים (מכל המועדים לפי השעון) לתוך 150 μl של חיץ תמוגה תא קר כקרח וטופח על קרח למשך 30 דקות.
7. צנטריפוגה lysates תא בצנטריפוגה benchtop על 17,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C..
8. מעבירים את supernatant, המכיל NP-40-מסיסים (NS) חלבונים, כדי צינור אחר בעזרת פיפטה.
   הערה: השתמש supernatants למדידת ריכוזי חלבון ידי assay ברדפורד במידת הצורך.
9. יש לשטוף את הכדורים על ידי ההוספה בעדינות כ 200 μl 1x PBS על הצינורות מבלי להפריע את הכדורים. מוציאים בזהירות PBS על ידי שאיפה ואקום או טפטפת. Re- להשעות אותם 150 חיץ גלול μl קר כקרח תא, ואחריו דגירת 15-30 דקות על קרח.
   הערה: חלק גלולה מושעים מכיל NP-40 חלבונים מסיסים (NI). ראה איור 1B עבור תרשיםאיל חלוקת חומר ניקוי.
10. הוסף 75 μl של חיץ רותחים 3x לשברירי NS ו- NP-40 שברים מסיסים (NI) resuspended מכדורי. מחמם את הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס על גוש חום למשך 5 דקות.
    הערה: גושים של השברים המסיסים NP-40, נמוגים לאחר החימום ודוגמאות תתבהרנה.
11. הוסף חוצץ טעינת SDS-ג'ל aliquot של NS המבושל NI. טען נפח שווה של דגימות שנאספו מכל נקודות זמן ג'ל SDS-PAGE. המקבילה טעונה בנפח של כ 20 מיקרוגרם של NS ממדגם שנאספה הערת זמן 0.: NS, וכן SDS-מסיס (SS) חלבון מסיעתו NI, ניתן לפתור על ידי ג'ל מפריד SDS. לעומת זאת, SDS-עמיד (SR) אגרגטים מן השבר NI תקועים בארות טעינת ג'ל (איור 1B). כדי לשפר את זיהוי כתם המערבי, נפח כפול של NI ניתן לטעון.
12. זיהוי NS ו SS Atxn1 82Q-GFP על ידי כתם המערבי באמצעות נוגדן אנטי- GFP ו chemiluminescence משופרת (ECL).
    הערה: Atxn1 82Q בשבריר SS מושווה פחות בדרך כלל לשבר NS בעת שימוש בפרוטוקול זה. חשיפת ECL ארוכה דרושה אותות אופטימליים.
13. בדוק SR Atxn1 82Q מן השבר גלולה ידי מבחני פיגור מסנן באמצעות מנגנון dot-כתם (איור 1B). בקצרה, להקים מנגנון dot-כתם מחזיק קרום אצטט תאית 0.2 מיקרומטר. μl טען 80-120 של NI המבושל לבאר כל מנגנון dot-הכתם.
    הערה: ככל כמויות קטנות בלבד של אגרגטים SR נוצרות בתאים, עבור assay כתם נקודה, לטעון נפח של השבר SR כי הוא כ 10-15 פעמים מהיקף השבר NS להשתמש לצורך ניתוח כתם המערבי.
    1. לאחר סינון דגימות דרך הממברנה על ידי ואקום, אגרגטים Atxn1 82Q-GFP תקוע על הממברנה ניתן לאתרם באמצעות immunoblotting אנטי GFP ^9,12,22.
       הערה: ראה דיווחים קודמים ^9,12,22 תיאור מפורט של assay פיגור מסנן. שלב זה הוא אופציונליבגלל SR Atxn1 82Q היא מזערית לעומת שברי ס"ס NS בעקבות transfection הקצר מתואר בפרוטוקול זה. בנוסף, הרמות של SR Atxn1 82Q בעיקר להישאר זהה לאורך מרדף chx (איור 2 ב). עם זאת, הוא עדיין חיוני כדי לבחון האם סכומי SS Atxn1 82Q מושפעים לאורך זמן עבור כל טיפול תרופתי או ביטוי גני ניסויים ראשוניים. מיני חלבון SS להישאר בבארות טעינת ג'ל SDS-PAGE יכולים להיות מזוהים על ידי כתם מערבי. עם זאת, שיטה זו היא פחות רגישה ומייצרת יותר תוצאות משתנות (איור 1B).

Assay הביזוי 3. NLS-בלוציפראז-GFP שימוש SDS-PAGE ומערב כתם

1. פלייט כ 3 x 10 ⁵ תאים הלה לתוך 35 צלחות מ"מ עם המדיום DMEM בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS). לאחר culturing O / N, מפגש של 40-60% הוא הגיע בזמן transfection. מספר הצלחות הדרושות מבוסס על מספר tנקודות וטיפולים IME כמתואר להלן.
2. Transfect הלה התאים עם 1.0 מיקרוגרם NLS-בלוציפראז-GFP / pRK5 פלסמיד לתוך כל מגיב transfection באמצעות היטב בהתאם להוראות היצרן ^9. הכן תערובת transfection מאסטר המכיל דנ"א מגיב transfection עבור aliquot של כל טוב.
3. לאחר O / transfection N (כ -15 שעות), לבדוק תאים חיים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה לביטוי GFP עם ננומטר גל עירור 450-490. חזרו תאים בחזרה חממה לאחר הדמיה.
   הערה: אות ה- GFP הגרעינית מתפזרת ניתן להבחין ברוב של התאים (70%). אחוז קטן (5%) של תאים יש אגרגטים גרעיניים.
4. הסר בינוני על ידי שאיפה ואקום ולהוסיף 2 מ"ל DMEM טרי המכיל chx 50 מיקרוגרם / מ"ל. פנקו את התאים עבור 0, 1.5, 3, 4.5 ו -6 שעות עם chx לפני הקטיף. כדי לבחון שפלת proteasomal, כולל MG132 מעכבי פרוטאזום נוסף (10 מיקרומטר) בצלחת אחת שטופלה במשך 6 שעות כמו שליטה.
5. קציר צלחת אחת של תאים בכל נקודת זמן. הסר בינוני על ידי שאיפה ואקום לשטוף את הצלחות פעמיים עם 3 מ"ל בופר פוספט קר כקרח (PBS). הצמד להקפיא את הצלחת על קרח יבש.
6. לאחר שהנקודה בפעם האחרונה (6 שעות) מסתיים, תאים קפוא ב כל זמני נקודות התחככו 150 μl של חיץ תמוגה תא קר כקרח וטופחו על קרח למשך 30 דקות.
7. הוסף חוצץ טעינת ג'ל SDS כדי lysates התא כולו ריכוז סופי של SDS 2% ו -50 מ"מ DTT. דגירת דגימות על גוש חום 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
8. לנתח NLS-בלוציפראז-GFP על ידי SDS-PAGE ומערב כתם באמצעות נוגדן אנטי GFP. טען נפח שווה של דגימות שנאספו מכל נקודות זמן ג'ל SDS-PAGE. היקף טעון מקבילה כ 20 מיקרוגרם של lysates התא כולו מן המדגם נאספו בזמן 0.

4. Assay הביזוי בזמן אמת של NLS-בלוציפראז-GFP שימוש קורא microplate פלואורסצנטי

1. זרע כ 1 x 10 ⁴תאי הלה לתוך צלחות תרבית רקמת 96, גם שחורות עם תחתית שקופה. לאחר culturing O / N, מפגש של 50-70% הוא הגיע בזמן transfection.
   הערה: 60 μl של מדיום המכיל מושעה לחלוטין תאי הלה הם זורעים ישירות לתוך כל אחד. אל תוסיף צלחת בינונית או סלע נוסף קדימה ואחורה לאחר זריעה, אחרת תאים עשויים להיות מופצים באופן לא אחיד.
2. Transfect הלה תאים עם 0.05-0.1 מיקרוגרם של NLS-בלוציפראז-GFP / pRK5 פלסמיד ⁹ לתוך כל מגיב transfection באמצעות היטב בהתאם להוראות היצרן. הכן תערובת transfection מאסטר המכיל מגיב דנ"א transfection ו aliquot זה עבור כל טוב. שלוש בארות עם תאים אינן transfected עם DNA, אשר ממשמש בקרת אותות קרינת רקע עבור כל תנאי טיפול.
   הערה: דרך חלופית כדי להפחית וריאציה transfection היא transfect תאים לפני זריעה. עם זאת, חלק גדול של תאים transfected עם חלבון misfoldedהים להיכשל לצרף או להראות כדאיות מופחתת תוך שימוש בשיטה זו. סביר להניח כי חלק מן התאים לא יכול לסבול את הלחץ שנגרם על ידי עיכול טריפסין כאשר לבטא חלבונים misfolded רעילים. כתוצאה מכך, אות ניאון הכוללת מצטמצם משמעותי.
3. 20-24 שעות לאחר transfection, לבחון תאי החיים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך לביטוי GFP עם ננומטר גל עירור 450-490.
4. הסר בינוני על ידי שאיפה ואקום. להוסיף כ 200 μl 1x PBS היטב כל ולאחר מכן לשאוב אותו כדי להסיר הסכום השיורי של מדיום DMEM.
5. הוסף 60 μl של DMEM בינוני נמוך הקרינה עם FBS 5% ו -50 מיקרוגרם / מ"ל ​​chx. כדי לבחון שפלת proteasomal, כולל MG132 מעכבי פרוטאזום נוסף (10 מיקרומטר) קבוצה אחת של דגימות. הגדר בשלושה עותקים של בארות עבור כל / מצב הטיפול.
   הערה: טיפול MG132 כלול שולטת עבור השפלה proteasomal כי זה חיוני כדי לשלול גורמים אחרים שיכולים לגרום לירידה של fluoאות rescence, כולל מוות של תאים מרווה הקרינה.
6. מדוד את אותות הקרינה של ה- GFP מייד על קורא צלחת ניאון לאחר הוספת chx.
   הערה: הגדרות מדידת תוכנה מוצגות בלוח 1.
7. קראו את הצלחת בכל שעה עד 8-10 שעות. לאחר הקריאה, להחזיר את הצלחת בחזרה חממת תרבית תאים.
8. לייצא את הנתונים לקובץ גיליון אלקטרוני. השתמש בערך ממוצע של רב קורא לכל גם עוצמת הקרינה. לנרמל הערכים של כל הנתונים מצביעים על הערכים הממוצעים של זמן 0 בקבוצות בהתאמה. מגרש את עוצמת הקרינה המנורמלת לאורך זמן כפי שמוצג באיור 4 א ו -4, ואיור 5, לוחות מימין.
9. ביצוע ניתוח סטטיסטי של שיעורי השפלה בין שני תנאים באמצעות ANOVA דו סטרי עם מדידות חוזרות ^23.
   הערה: בניתוח זה, "עוצמת הקרינה" הוא המשתנה התלוי ואילו "treatmהתנאים אף אוזן גרון "ו-" זמן "הם שני הגורמים. במקום להשוות נתונים בנקודות זמן בודדים, דו כיוונית ANOVA עם מדידות חוזרות מנתח את ההבדל בין שתי קבוצות הטיפול שני במשך כל הזמן.

תוצאות

בניתוח מצב יציב, גלויים מיקרוסקופי Atxn1 אגרגטים גרעיניים 82Q-GFP ניתן לצפות 30 - 50% של תאים הלה 20 שעות לאחר transfection (איור 1 א). ניתוח כתם המערבי של שברי NS ו SS באמצעות נוגדן אנטי GFP מציג להקה ברורה של Atxn1 82Q-GFP בין 100 kDa ו -150 סמני kDa, התואם את המשקל המולקולרי ...

Discussion

מנגנונים מווסתים הפירוק של חלבוני misfolded חיוניים לשמירה על הומאוסטזיס של חלבונים תאיים, והם ככל הנראה מייצגים מטרות תרופה יקרות לטיפול בהפרעות ניווניות ומחלות misfolding-חלבון אחרות. כאן, מבחני הבוחנים את הפירוק של החלבונים misfolded מתוארים, באמצעות חלבון Atxn1 פתוגניים (Atxn1 82Q) ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Life Technologies	11995-092
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10082147
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019
NP-40	Sigma-Aldrich	NP40S-500ML
SDS	Sigma-Aldrich	L3771
MG132	Sigma-Aldrich	M8699
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C7698
Dithiothreitol (DTT)	Fisher Scientific	45000232
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche Boehringer Mannheim	4693159001
Bio-Dot Apparatus	Bio-Rad	1706545
Living Colors GFP Monoclonal Antibody	Clonetech	632375
Anti-Actin mAb Rabbit, IgG	Sigma-Aldrich	A45060-200UL
Amino acids	Sigma-Aldrich		Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium
Olympus IX-81  Inverted Fluorescence Microscope	Olympus	IX71/IX81
96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom	Sigma-Greiner	89135-048
Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO	TECAN	Infinite 200® PRO
Cellulose acetate membrane 0.2 µm	Sterlitech	CA023001
Prism 5	GraphPad		Statistical analysis software