JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوصف منهجية الإنتاجية العالية، الآلي، إنتاج البروتوبلازم التبغ والتحول. النظام الآلي يمكن التعبير الجيني الموازي واسع والاكتشاف في نظام نموذجي BY-2 التي ينبغي أن تكون للترجمة للمحاصيل غير النموذجية.

Abstract

على مدى العقد الماضي كان هناك تجدد في استخدام جبلة مجردة النباتية التي تتراوح بين الأنواع نموذج لاقتصاص أنواع، لتحليل مسارات نقل الإشارة والشبكات التنظيمية النسخي، التعبير الجيني، الجينوم التحرير، والجينات إسكات. وعلاوة على ذلك، تم إحراز تقدم كبير في تجديد النباتات من جبلة مجردة، التي ولدت المزيد من الاهتمام في استخدام هذه النظم لعلم الجينوم المصنع. في هذا العمل، وقد تم وضع بروتوكول لأتمتة العزلة البروتوبلازم والتحول من 2 (BY-2) ثقافة تعليق التبغ "الأصفر الساطع" باستخدام منصة الروبوتية. تم التحقق من صحة إجراءات التحول باستخدام البرتقال ببروتين (النفط مقابل الغذاء) مراسل الجين (pporRFP) تحت سيطرة المروج القرنبيط فيروس تبرقش 35S (35S). وأكد التعبير النفط مقابل الغذاء في جبلة مجردة بواسطة المجهر epifluorescence. شملت التحليلات أيضا الأساليب كفاءة الإنتاج البروتوبلازم باستخدام propidiuم يوديد. وأخيرا، تم استخدام منخفضة التكلفة الإنزيمات للمأكولات لإجراء البروتوبلازم العزلة، التحايل على الحاجة إلى مختبر الصف الانزيمات التي هي في الإنتاجية العالية الآلي العزلة البروتوبلازم وتحليل باهظة التكلفة. على أساس بروتوكول المتقدمة في هذا العمل، ويمكن إجراء الإجراء الكامل من العزلة البروتوبلازم إلى تحول في أقل من 4 ساعات، من دون أي مساهمة من المشغل. في حين تم التحقق من صحة بروتوكول المتقدمة في هذا العمل مع ثقافة الخلية BY-2، وينبغي أن تكون الإجراءات والأساليب للترجمة إلى أي ثقافة تعليق مصنع / نظام بروتوبلازمي، والتي ينبغي تمكين تسريع الأبحاث الجينومية المحاصيل.

Introduction

في السنوات الأخيرة كان هناك زخم كبير وضعت على تصميم المحاصيل المعدلة وراثيا للتغلب على الأمراض المختلفة 1، منح مقاومة مبيدات الأعشاب 2، منح الجفاف 3،4 والتسامح الملح 5، ومنع الحيوانات العاشبة 6، وزيادة العائد الكتلة الحيوية 7، وتقليل جدار الخلية عناد 8. وقد ساعد هذا الاتجاه من خلال تطوير أدوات جزيئية جديدة لتوليد النباتات المعدلة وراثيا، بما في ذلك الجينوم التحرير باستخدام كريسبر وTALENs 9، والجينات إسكات من خلال الرنا المزدوج الجديلة 10، ميرنا 11، وسيرنا 12. في حين أن هذه التقنيات وتبسيط جيل من النباتات المعدلة وراثيا، أنها خلقت أيضا عنق الزجاجة، حيث ولدت العدد الهائل من النباتات المعدلة وراثيا لا يمكن عرضه باستخدام الأنظمة التقليدية التي تعتمد على تجديد مصنع. تتعلق هذه العقبة، في حين إسكات ويبني الجينوم التحرير يمكن إدراج بسرعة إلى النباتات، والعديد منفشلت الصفات التي تستهدف إحداث التأثير المطلوب، والتي غالبا ما تكون غير المكتشفة حتى يتم تحليل النباتات في الدفيئة. في هذا العمل، وقد وضعنا طريقة لسريع وتلقائي وفحص عالية الإنتاجية من جبلة مجردة النبات، وعلى وجه التحديد لمعالجة عنق الزجاجة الحالي في الفحص المبكر أعداد كبيرة من الجينوم التحرير والجينات إسكات الأهداف.

استخدام جبلة مجردة، بدلا من الخلايا النباتية سليمة، لديها العديد من المزايا للتطوير منصة الآلي. أولا، يتم عزل جبلة مجردة بعد هضم جدار الخلية النباتية، ومع هذا الحاجز لم تعد موجودة، وزيادة كفاءة تحويل 13. في الخلايا النباتية سليمة لا يوجد سوى اثنين أساليب راسخة للتحول، biolistics 14 و الأجرعية التحول بوساطة 15. أيا من هذه الأساليب يمكن ترجمتها بسهولة إلى منصات المعالجة السائلة، كما biolistics يتطلب معدات متخصصة لtransformation، في حين الأجرعية التحول بوساطة يتطلب ثقافة مشتركة وإزالة اللاحقة من البكتيريا. ولا هي قابلة لأساليب إنتاجية عالية. في حالة جبلة مجردة، يجري التحول بشكل روتيني باستخدام البولي ايثيلين جلايكول (PEG) ترنسفكأيشن بوساطة 16، والتي تتطلب فقط عدة بورصات حل، ويعتبر مثاليا لمنصات المعالجة السائلة. ثانيا، جبلة مجردة، بحكم التعريف، هي ثقافات وحيدة الخلية، وبالتالي فإن المشاكل المرتبطة تشكيل تكتل وسلسلة في مزارع الخلايا النباتية، وليس لوحظ في جبلة مجردة. من حيث الفحص السريع باستخدام مقياس الطيف الضوئي، القائم على لوحة تكتل من الخلايا أو الخلايا في الطائرات متعددة سوف يؤدي إلى صعوبة في الحصول على قياسات متناسقة. منذ جبلة مجردة هي أيضا الأكثر كثافة من وسائل الاعلام ثقافتهم، والرواسب في قاع الآبار، وتشكيل أحادي الطبقة، والتي تفضي للالطيفي القائم على طبق من ذهب. وأخيرا، في حين أن الثقافات تعليق خلية النبات PRIMARالمستمدة إيلي من الكالس 17، جبلة مجردة يمكن حصاده من عدد من الأنسجة النباتية، مما يؤدي إلى القدرة على تحديد التعبير الأنسجة محددة. على سبيل المثال، القدرة على تحليل root- أو التعبير عن ورقة محددة من الجينات يمكن أن تكون هامة جدا للتنبؤ النمط الظاهري. لهذه الأسباب، ولم يتم التحقق من البروتوكولات وضعت في هذا العمل باستخدام جبلة مجردة معزولة عن التبغ تستخدم على نطاق واسع (النيكوتين تبغ L.) "برايت صفراء '2 (BY-2) ثقافة تعليق.

وقد وصفت ثقافة تعليق BY-2 باعتبارها الخلية "هيلا" من النباتات العليا، وذلك بسبب استخدام كل مكان في التحليل الجزيئي للخلايا النبات 18. في الآونة الأخيرة، وقد استخدمت خلايا BY-2 لدراسة الآثار المترتبة على مصنع الضغوطات 19-22، داخل الخلايا البروتين توطين 23،24، وبيولوجيا الخلية الأساسية 25-27 يدل على فائدة واسعة من هذه الثقافات في بيولوجيا النبات. ميزة إضافية لBY-2 الثقافات هيالقدرة على مزامنة مع الثقافات aphidicolin، والتي يمكن أن تؤدي إلى تعزيز استنساخ للتعبير الجين دراسات 28. وعلاوة على ذلك، تم تطوير طرق لاستخراج BY-2 جبلة مجردة باستخدام أنزيمات منخفضة التكلفة 29،30، والإنزيمات التي تستخدم عادة لتوليد جبلة مجردة باهظة لأنظمة عالية الإنتاجية من حيث التكلفة. على هذا النحو، وقد تم التحقق من صحة البروتوكول هو موضح أدناه باستخدام ثقافة تعليق BY-2، ولكن يجب أن تكون قابلة للتعديل إلى أي ثقافة مصنع التعليق الخلية. وتجرى التجارب إثبات صحة مفهوم باستخدام البرتقال البروتين مضان (النفط مقابل الغذاء) مراسل الجين (pporRFP) من Porites المرجانية الصلبة porites 31 تحت سيطرة المروج CAMV 35S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إنشاء الثقافات خلية تعليق

  1. تحضير السائل BY-2 وسائل الاعلام من خلال إضافة 4،43 ز Linsmaier وسكوغ وسائل الإعلام بصل، 30 غرام من السكروز، 200 ملغ KH 2 PO 4، و 200 ميكروغرام من 2،4-ثنائي كلورو فينوكسياسيتين حمض (2،4-D) إلى 900 مل من المقطر المياه ودرجة الحموضة إلى 5.8 مع 0.1 M KOH. بعد تعديل درجة الحموضة، وضبط الحجم النهائي إلى 1000 مل بالماء المقطر والأوتوكلاف. وسائل الاعلام ويمكن تخزين تصل إلى 2 أسابيع في 4 درجات مئوية.
  2. تطعيم قارورة 250 مل مخروطي مع 100 مل من السائل BY-2 وسائل الإعلام وقطعة واحدة من BY-2 الكالس (> 1 سم في القطر) نمت على الصلبة وسائل الاعلام BY-2 (السائل BY-2 وسائل الاعلام مع إضافة 1٪ أجار) وختم بورق الألمنيوم. احتضان الثقافة في 28-30 درجة مئوية مع الهز لمدة 5 أيام.
    ملاحظة: BY-2 هو الحفاظ على الكالس على وسائل الاعلام الصلبة للتخزين على المدى الطويل، والثقافات السائلة واكتسى بسرعة. يمكن تعديل حجم الثقافة عند الضرورة، وعادة ثقافة مل 100 سوف تكون قادرة على تحميل الثلاثة والثلاثين 6-ثلوحات الذراع.
  3. نقل 2 مل من مرحلة سجل BY-2 ثقافة إلى 98 مل من وسائل الإعلام الجديدة BY-2 واحتضان لمدة 5-7 أيام في 28-30 درجة مئوية مع اهتزاز.
    ملاحظة: زراعة الفرعية الثقافات السائل أنشئت يمكن القيام بها بانتظام باستخدام 1: 100 التخفيفات من الثقافات القديمة 5-7 يوم، بدلا من التلقيح مع الكالس.
  4. مزيج من الثقافة بدقة، وخلايا سوف يستقر بسرعة، ونقل 6 مل من ثقافة الخلية إلى أنبوب أسفل الطرد المركزي 15 مل مخروطي الشكل، والسماح للخلايا تسوية لمدة 10 دقيقة على الأقل. ضبط حجم الخلية معبأة إلى 50٪ من الحجم الكلي عن طريق إزالة طاف.
  5. هز أنبوب من قلب والماصة 500 ميكرولتر في كل بئر من لوحة 6 جيدا لعملية الهضم. استخدام pipets على نطاق تتحمل لنقل الخلايا في هذه المرحلة، لأنها كثيفة وسوف تسد نصائح الماصة القياسية.

2. البروتوبلازم عزل

  1. بدوره على جميع مكونات النظام الآلي (الشكل 1A) وفتح مهمة لوحة المحرك جدولة ناعمةوير. يدمج برنامج جدولة المهام المحرك صفيحة مع معدات أخرى لتمكين نقل لوحات بين كل قطعة من المعدات.
  2. قبل التجريب، وتحديد المواصفات الفنية للمعدات المختبرات (على سبيل المثال، لوحات، والأغطية) المستخدمة في بروتوكول، وكذلك الانطلاق والمواقف النهاية لكل قطعة من معدات المختبرات، في البرنامج لوحة المحرك، على النحو التالي:
    1. انقر فوق إعداد من شريط الأدوات الرئيسي في البرنامج لوحة المحرك واختيار إدارة الحاويات أنواع الأوامر.
    2. إذا تم سرد نوع الحاويات في مكتبة نوع الحاويات القائمة، ثم حدد حاوية المناسبة.
    3. إذا لم يتم سرد نوع الحاويات في مكتبة نوع الحاويات القائمة ثم انقر فوق إضافة إلى تحديد نوع الحاوية جديد.
    4. بعد إضافة نوع الحاوية جديد، إدراج أبعاد جديدة للحاويات (الطول، العرض، أبعاد التراص، والقابض الإزاحة) في علامات التبويب المناسبة ثم انقر فوق حفظ.
      1. إذا كانت أبعاد الصحيحة غير متوفرة من الشركة المصنعة، ثم تحدد بدقة جميع الأبعاد إلى أقرب ملليمتر باستخدام الفرجار. سوف أخطاء في قياس أبعاد الحاويات يؤدي إلى فشل المحرك لوحة.
    5. كرر الخطوات من 2.2.2 من خلال 2.2.4.1 لجميع أنواع الحاويات أن المحرك لوحة ستواجه. بعد الانتهاء من هذه الخطوة لجميع المختبرات، فمن الضروري تحديد بداية ونهاية الموقع لكل حاوية (الخطوة 2.2.6).
      ملاحظة: للحصول على هذا البروتوكول يتضمن معدات المختبرات لوحة 6 جيدا، لوحة في آبار عميقة، ولوحة فحص الفلورسنت 96-جيدا.
    6. لتحديد بداية ونهاية الموقف من كل حاوية، انقر فوق علامة التبويب البداية / النهاية في بروتوكول معين. أولا، تحديد موقف بداية كل حاوية. بعد ذلك، ضع علامة في المربع للبغطاء / Unlidded في كل بداية ونهاية الموقف. أكرر لجميع الحاويات.
      ملاحظة: إذا كان سيتم ترك الحاوية على آخر قطعة من EQUipment (بدلا من المحرك لوحة) الموقع نهاية يمكن تركها فارغة.
  3. في هذه المرحلة تحميل يدويا جميع لوحات في نقطة الانطلاق لسير العمل بأكمله. تحميل لوحات فحص الفلورسنت جيدا 96 في فندق 2، 6 لوحات بشكل جيد مع BY-2 الخلايا في فندق 3، لوحة 96 آبار عميقة التي سيتم استخدامها للتحول إلى سخان لوحة / مبرد عش 2، والمخروطية 50 مل الأنبوب الذي يحتوي على حل انزيم (انظر الملف التكميلي، القسم 1.2.2) على موزع متعدد الأوضاع.
    1. إذا كان سيتم تنفيذ التحول في البروتوكول، قبل تحميل لوحة في آبار عميقة 96 مع 10 ميكرولتر من البلازميد لكل بئر (1 ميكروغرام / ميكرولتر، A 260/280> 1.8) التي تحتوي على مراسل بناء OFP واحتضان على لوحة سخان / المبرد عند 4 درجات مئوية. وسوف تستخدم كل بئر لتحويل واحد، وبالتالي فإن عدد الآبار شغل سيعتمد على الإعداد التجريبية.
  4. تحميل جميع اللوازم وألواح على أتمتةد منصة تداول السائلة في مواقع معينة، وتحديد موقف كل بند في البرنامج التحكم الآلي (الشكل 1B).
    1. تحميل لوحة 96-جيدا مسبقة مع 200 ميكرولتر من 40٪ PEG في مجموعة محمد المعجل (0.4 M مانيتول، 100 ملي MgCl 2 و 4 ملي زارة التربية والعلم، ودرجة الحموضة 5.7) في العمود 1، 200 ميكرولتر من يوديد propidium (PI، 1 ميكروغرام / مل) في العمود 2، و 200 ميكرولتر من الايثانول في العمود 3 (عش 2)، وعلبة من نصائح ماصة في عش 8.
    2. لتحديد مكان وجود معدات المختبرات في مجال البرمجيات وسائل التعامل مع منصة الآلي، واختر Tools من القائمة وانقر فوق محرر المختبرات الطبية.
    3. حدد نوع من معدات المختبرات من القائمة المنسدلة أو تحديد نوع معدات المختبرات جديد باستخدام زر جديد المختبرات الطبية.
    4. تحديد موقف من كل قطعة من معدات المختبرات التي اختارها اختيار علامة التبويب بروتوكول الرئيسية والنقر تكوين المختبرات الطبية. تأكد من أن كل قطعة من معدات المختبرات وضعت على منصة الآلي التعامل مع السائلتعرف قبل تشغيل البروتوكول.
    5. لتحريك بروتوكولات الآلية، انقر فوق إطار مستكشف الملف وحدد اسم البروتوكول ليتم تشغيلها (البروتوبلازم عزل، كونت الخلية، والتحول بوساطة PEG).
    6. انقر فوق تشغيل لتهيئة كافة الأجهزة التي سيتم استخدامها في البروتوكول.
    7. وأخيرا، في إطار مستكشف العمل، انقر فوق إضافة وحدة العمل للتحقق من جميع الحاويات / معدات المختبرات في النظام وبدء بروتوكول الآلي.
      ملاحظة: الوصف الكامل للبروتوكولات الآلي الموجودة في الملف التكميلي.

3. إنشاء ستاندرد Curve للتعداد خلايا

  1. التركيز يدويا جبلة مجردة بتركيز 1 × 10 6 جبلة مجردة / مل في حجم 1 مل. الطرد المركزي جبلة مجردة في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة، وإزالة طاف.
  2. يدويا إضافة 900 ميكرولتر من 70٪ من الإيثانول (الحفاظ على 4 درجات مئوية) لبيليه البروتوبلازموإعادة تعليق بيليه. احتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد لإصلاح الخلايا.
  3. إضافة 100 ميكرولتر من PI (1 ميكروغرام / مل) إلى جبلة مجردة لتسمية نوى والسماح الكشف من قبل قارئ لوحة.
  4. تحميل 80 ميكرولتر من السائل BY-2 وسائل الإعلام في كل الصفوف والأعمدة من لوحة فحص الفلورسنت 96-جيدا بدءا من العمود 2.
  5. في العمود 1 من لوحة فحص الفلورسنت 96-جيدا، إضافة 70 ميكرولتر من جبلة مجردة و 50 ميكرولتر BY-2 وسائل الإعلام إلى كل بئر في العمود.
  6. وضع لوحة في عش 6 من منصة الآلي التعامل مع السائل، وتشغيل التخفيف المتسلسل 2 أضعاف.
    1. لإجراء التخفيف المتسلسل على منصة الآلي التعامل مع السائل، انقر فوق تشغيل معالج التخفيف المسلسل وضبط حجم نقل (60 ميكرولتر)، وعدد من أمزجة وحجم (2، 70 ميكرولتر) والآبار الأولية (العمود 1، الصفوف AF)، تخفيف الآبار (أعمدة 11/02، الصفوف AF)، ونضح والاستغناء عن خصائص (0.5 ملم من أسفل أيضا).
    2. بعد إعداد المعلمات، حفظد تشغيل البروتوكول.
      ملاحظة: منذ وصفت كل جبلة مجردة مع PI (بسبب تثبيت الخلايا)، ومضان غير متناسبة مع تركيز البروتوبلازم.
    3. بعد الانتهاء من التخفيف المتسلسل، وإزالة لوحة من عش 9 وإدراجه في قارئ لوحة وتشغيل بروتوكول المنحنى القياسي في البرنامج لوحة القارئ.
      ملاحظة: سيتم بعد ذلك إنشاء منحنى القياسية من خلال مقارنة مضان من PI (الإثارة 536 نانومتر / انبعاث 620 نانومتر) في كل بئر مع تركيز البروتوبلازم المعروفة.
  7. عند الانتهاء من بروتوكول قارئ لوحة، وإزالة لوحة وجمع أي خلايا معدلة وراثيا لالتعقيم أو غيرها من إجراءات اجتثاث إنعاش كما هي محددة في بروتوكولات السلامة الأحيائية.

4. تحليل مجهري للتحول

  1. إزالة لوحة مع جبلة مجردة تتحول (نتاج بروتوكول الآلي 3، الملف التكميلي) من فندق 1 من النظام الآلي.
  2. منعطفعلى مجهر مقلوب، وكاميرا، ومصباح الفلورسنت.
  3. حدد الهدف 10X للعسل مع التركيز على جبلة مجردة، تشغيل مصابيح الهالوجين، وإغلاق مصراع للمصباح الفلورسنت.
  4. لوحة الحمل على نظام المجهري والتركيز على جبلة مجردة باستخدام brightfield.
  5. بعد التركيز على جبلة مجردة، إيقاف لمبة الهالوجين وفتح مصراع لمبة الفلورسنت.
  6. حدد مرشح CY3 / TRITC وضع التصور من البروتين pporRFP التي أعرب عنها جبلة مجردة المعدلة وراثيا.
  7. مسح كل بئر لتحديد عدد من جبلة مجردة تعبر عن pporRFP علامة فلوري.
  8. حساب كفاءة التحول حيث بلغ إجمالي من جبلة مجردة تعبر عن علامة فلوري إجمالي عدد جبلة مجردة.
  9. جمع أي لوحات تحتوي على خلايا معدلة وراثيا في أكياس السلامة الأحيائية الموافقة على التعقيم أو غيرها من إجراءات اجتثاث إنعاش كما هي محددة في بروتوكولات السلامة الأحيائية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

في الدراسة الحالية، فإن معدل مضاعفة BY-2 تباينت 14-18 ساعة تعتمد على درجة الحرارة التي حضنت الثقافات، بما يتفق مع التقارير السابقة لطول دورة الخلية متوسط ​​من 15 ساعة. مع هذا المعدل مضاعفة، 1: تم استخدام 100 ابتداء من اللقاح لبدء الثقافات، مما يؤدي إلى الث...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وقد تم التحقق من صحة بروتوكول المذكورة أعلاه بنجاح لعزل البروتوبلازم، والعد، والتحول باستخدام التبغ زراعة الخلايا تعليق BY-2. ومع ذلك، يمكن بسهولة تمديد بروتوكول لأي ثقافة تعليق النبات. في الوقت الحاضر، وقد تم تحقيق العزلة والتحول البروتوبلازم في محطات عديدة، بما في ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصلحة مالية المتنافسة.

Acknowledgements

This research was supported by Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Orbitor RS Microplate moverThermo Scientific
Bravo Liquid HandlerAgilent
Synergy H1 Multi-mode ReaderBioTek
MultiFlo FX Multi-mode DispenserBioTek
TeleshakeInheco3800048
CPAC Ultraflat Heater/coolerInheco7000190
Vworks Automation SoftwareAgilentSoftware used to control and write protocols for Agilent Bravo
Momentum SoftwareThermo ScientificTask scheduling software for controlling Orbiter RS
Liquid Handling Control 2.17 SoftwareBiotekSoftware used to control and write protocols for MultiFlo FX
IX81 Inverted MicroscopeOlympus
Zyla 3-Tap microscope cameraAndor
ET-CY3/TRITC Filter SetChroma Technology Corp49004
Rohament CLAB Enzymessample bottlelow-cost cellulase
Rohapect UFAB Enzymessample bottlelow-cost pectinase
Rohapect 10LAB Enzymessample bottlelow-cost pectinase/arabinase
Linsmaier & Skoog Basal MediumPhytotechnology LaboratoriesL689
2,4-dichlorophenoxyacetic acidPhytotechnology LaboratoriesD295
propidium iodideSigma AldrichP4170
Poly(ethylene glycol) 4000Sigma Aldrich95904-250G-FFormerly Fluka PEG
Propidium IodideFisher Scientific25535-16-4Acros Organics
CaCl2Sigma AldrichC7902-1KG
Sodium AcetateFisher ScientificBP333-500
MannitolSigma AldrichM1902-1KG
SucroseFisher ScientificS5-3
KH2PO4Fisher ScientificAC424205000
KOHSigma AldrichP1767
Gelzan CMSigma AldrichG1910-250G
6-well plateThermo Scientific103184
96-well 1.2 ml deep well plateThermo ScientificAB-0564
96 well optical bottom plateThermo Scientific165305
Finntip 1000 Wide bore Pipet tipsThermo Scientific9405 163
NaClFisher ScientificBP358-10
KClSigma AldrichP4504-1KG
MESFisher ScientificAC17259-5000
MgCl2Fisher ScientificM33-500

References

  1. Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops. Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).
  2. Duke, S. O. Perspectives on transgenic, herbicide-resistant crops in the United States almost 20 years after introduction. Pest Manag. Sci. 71 (5), 652-657 (2015).
  3. Mir, R., Zaman-Allah, M., Sreenivasulu, N., Trethowan, R., Varshney, R. Integrated genomics, physiology and breeding approaches for improving drought tolerance in crops. Theor. Appl. Genet. 125 (4), 625-645 (2012).
  4. Hu, H., Xiong, L. Genetic engineering and breeding of drought-resistant crops. Annu. Rev. Plant Bio. 65, 715-741 (2014).
  5. Marco, F., et al. Plant Biology and Biotechnology. , Springer. 579-609 (2015).
  6. Edgerton, M. D., et al. Transgenic insect resistance traits increase corn yield and yield stability. Nat. Biotechnol. 30 (6), 493-496 (2012).
  7. Vanhercke, T., et al. Metabolic engineering of biomass for high energy density: oilseed-like triacylglycerol yields from plant leaves. Plant Biotech. J. 12 (2), 231-239 (2014).
  8. Baxter, H. L., et al. Two-year field analysis of reduced recalcitrance transgenic switchgrass. Plant Biotech. J. 12 (7), 914-924 (2014).
  9. Xing, H. L., et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. 14 (1), 327(2014).
  10. Cao, J., Yao, D., Lin, F., Jiang, M. PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize. Acta Physio. Plant. 36 (5), 1271-1281 (2014).
  11. Martinho, C., et al. Dissection of miRNA pathways using Arabidopsis mesophyll protoplasts. Mol. Plant. 8 (2), 261-275 (2015).
  12. Bart, R., Chern, M., Park, C. J., Bartley, L., Ronald, P. C. A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts. Plant Methods. 2 (1), 13(2006).
  13. Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -L. Protoplasts: a useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation. Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).
  14. Martin-Ortigosa, S., Valenstein, J. S., Lin, V. S. Y., Trewyn, B. G., Wang, K. Nanotechnology meets plant sciences: Gold functionalized mesoporous silica nanoparticle mediated protein and DNA codelivery to plant cells via the biolistic method. Adv. Funct. Mater. 22 (17), 3529-3529 (2012).
  15. Křenek, P., et al. Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles, methods and applications. Biotechnol. Adv. , (2015).
  16. Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  17. Mustafa, N. R., de Winter, W., van Iren, F., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nat. Protoc. 6 (6), 715-742 (2011).
  18. Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 cell line as the "HeLa" cell in the cell biology of higher plants. Int. Rev. Cytol. 132 (1), 1-30 (1992).
  19. Centomani, I., et al. Involvement of DNA methylation in the control of cell growth during heat stress in tobacco BY-2 cells. Protoplasma. , 1-9 (2015).
  20. Sgobba, A., et al. Cyclic AMP deficiency stimulates a stress condition in tobacco BY-2 cells. BioTechnologia. 94 (2), (2013).
  21. Väisänen, E. E., et al. Coniferyl alcohol hinders the growth of tobacco BY-2 cells and Nicotiana benthamiana seedlings. Planta. 242 (3), 747-760 (2015).
  22. Ortiz-Espìn, A., et al. Over-expression of Trxo1 increases the viability of tobacco BY-2 cells under H2O2 treatment. Ann. Botany. 116 (4), 571-582 (2015).
  23. Ito, Y., et al. cis-Golgi proteins accumulate near the ER exit sites and act as the scaffold for Golgi regeneration after brefeldin A treatment in tobacco BY-2 cells. Mol. Bio. Cell. 23 (16), 3203-3214 (2012).
  24. Madison, S. L., Nebenführ, A. Live-cell imaging of dual-labeled Golgi stacks in tobacco BY-2 cells reveals similar behaviors for different cisternae during movement and brefeldin A treatment. Mol. Plant. 4 (5), 896-908 (2011).
  25. de Pinto, M. C., et al. S-nitrosylation of ascorbate peroxidase is part of programmed cell death signaling in tobacco Bright Yellow-2 cells. Plant Physiol. 163 (4), 1766-1775 (2013).
  26. Hanamata, S., et al. In vivo imaging and quantitative monitoring of autophagic flux in tobacco BY-2 cells. Plant Signa. Behav. 8 (1), 22510(2013).
  27. Sakai, A., Takusagawa, M., Nio, A., Sawai, Y. Cytological Studies on proliferation, differentiation, and death of BY-2 cultured tobacco cells. Cytologia. 80 (2), 133-141 (2015).
  28. Yasuhara, H., Kitamoto, K. Aphidicolin-induced nuclear elongation in tobacco BY-2 cells. Plant Cell Physiol. 55 (5), 913-927 (2014).
  29. Buntru, M., Vogel, S., Stoff, K., Spiegel, H., Schillberg, S. A versatile coupled cell-free transcription-translation system based on tobacco BY-2 cell lysates. Biotechnol. Bioeng. 112 (5), 867-878 (2015).
  30. Buntru, M., Vogel, S., Spiegel, H., Schillberg, S. Tobacco BY-2 cell-free lysate: an alternative and highly-productive plant-based in vitro translation system. BMC Biotechnol. 14 (1), 37(2014).
  31. Alieva, N. O., et al. Diversity and evolution of coral fluorescent proteins. PLoS ONE. 3 (7), 2680(2008).
  32. Maćkowska, K., Jarosz, A., Grzebelus, E. Plant regeneration from leaf-derived protoplasts within the Daucus genus: effect of different conditions in alginate embedding and phytosulfokine application. Plant Cell Tiss. Org. 117 (2), 241-252 (2014).
  33. Guo, Y., Song, X., Zhao, S., Lv, J., Lu, M. A transient gene expression system in Populus euphratica Oliv. protoplasts prepared from suspension cultured cells. Acta Physio. Plant. 37 (8), 1-8 (2015).
  34. Wang, H., Wang, W., Zhan, J., Huang, W., Xu, H. An efficient PEG-mediated transient gene expression system in grape protoplasts and its application in subcellular localization studies of flavonoids biosynthesis enzymes. Sci. Hort. 191, 82-89 (2015).
  35. Masani, M. Y. A., Noll, G. A., Parveez, G. K. A., Sambanthamurthi, R., Pruefer, D. Efficient transformation of oil palm protoplasts by PEG-mediated transfection and DNA microinjection. PLoS One. 9 (5), 96831(2014).
  36. Sasamoto, H., Ashihara, H. Effect of nicotinic acid, nicotinamide and trigonelline on the proliferation of lettuce cells derived from protoplasts. Phytochem. Lett. 7, 38-41 (2014).
  37. Uddin, M. J., Robin, A. H. K., Raffiand, S., Afrin, S. Somatic embryo formation from co-cultivated protoplasts of Brassica rapa & B. juncea. Am. J. Exp. Ag. 8 (6), 342-349 (2015).
  38. Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
  39. Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Stewart, C. N. Protoplast isolation and transient gene expression in switchgrass, Panicum virgatum L. Biotechnol. J. 3 (3), 354-359 (2008).
  40. Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Joyce, B. L., Stewart, C. N. Switchgrass (Panicum virgatum L.) cell suspension cultures: Establishment, characterization, and application. Plant Sci. 181 (6), 712-715 (2011).
  41. Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Rep. 21 (9), 865-871 (2003).
  42. Di Sansebastiano, G. P., Paris, N., Marc-Martin, S., Neuhaus, J. M. Specific accumulation of GFP in a non-acididc vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. 15 (4), 449-457 (1998).
  43. De Sutter, V., et al. Exploration of jasmonate signalling via automated and standardized transient expression assays in tobacco cells. Plant J. 44 (6), 1065-1076 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

115

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved