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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Una metodologia high-throughput, la produzione di protoplasti di tabacco automatizzata e la trasformazione è descritto. Il sistema robotico consente l'espressione genica massicciamente parallelo e la scoperta nel sistema modello BY-2 che dovrebbe essere traducibile di colture non-modello.

Abstract

Negli ultimi dieci anni c'è stata una recrudescenza nell'uso dei protoplasti vegetali che vanno da specie modello per ritagliare le specie, per l'analisi di trasduzione del segnale, reti di regolazione trascrizionale, l'espressione genica, del genoma-editing, e Gene-silenziamento. Inoltre, sono stati compiuti progressi significativi nella rigenerazione di piante da protoplasti, che ha generato ancor più interesse per l'uso di tali sistemi per genomica vegetale. In questo lavoro, un protocollo è stato sviluppato per l'automazione di isolamento protoplasti e trasformazione da 2 (BY-2) coltura in sospensione tabacco un 'giallo brillante' utilizzando una piattaforma robotica. Le procedure di trasformazione sono stati convalidati usando un gene reporter proteina fluorescente arancione (OFP) (pporRFP) sotto il controllo del promotore cavolfiore mosaic virus 35S (35S). espressione OFP in protoplasti stata confermata mediante microscopia in epifluorescenza. Le analisi inclusi anche i metodi di efficienza di produzione di protoplasti utilizzando propidium ioduro. Infine, a basso costo enzimi per alimenti sono stati utilizzati per la procedura di isolamento di protoplasti, eludendo la necessità di enzimi di laboratorio di grado che sono un costo proibitivo in high-throughput automatizzato isolamento di protoplasti e di analisi. Basato sul protocollo sviluppato in questo lavoro, la procedura completa dall'isolamento protoplasti di trasformazione può essere effettuata in meno di 4 ore, senza alcun intervento da parte dell'operatore. Mentre il protocollo sviluppato in questo lavoro è stato convalidato con la coltura cellulare BY-2, le procedure ei metodi dovrebbero essere traducibile a qualsiasi / sistema di coltura in sospensione di protoplasti impianto, che dovrebbe consentire l'accelerazione della ricerca genomica nel grano.

Introduzione

Negli ultimi anni vi è stato significativo impulso posto sulla progettazione delle colture transgeniche per superare le varie malattie 1, dotare resistenza agli erbicidi 2, conferiscono alla siccità e 3,4 tolleranza al sale 5, prevenire erbivori 6, aumento della biomassa resa 7, e diminuire recalcitrance parete cellulare 8. Questa tendenza è stata aiutata dallo sviluppo di nuovi strumenti molecolari per la generazione di piante transgeniche, tra cui genoma di modifica utilizzando CRISPR e Talens 9, e silenziamento genico attraverso dsRNA 10, miRNA 11, e siRNA 12. Mentre queste tecnologie hanno semplificato la generazione di piante transgeniche, hanno anche creato un collo di bottiglia, dove il gran numero di piante transgeniche generate non possono essere sottoposti a screening con sistemi tradizionali che si basano sulla rigenerazione delle piante. In relazione a questo collo di bottiglia, mentre il silenziamento e del genoma di modifica costrutti possono essere rapidamente inseriti nelle piante, molte delletratti mirati riescono a produrre l'effetto desiderato, che spesso non è scoperto fino piante sono analizzati nella serra. In questo lavoro, abbiamo messo a punto un metodo per la rapida automatizzato, lo screening, high-throughput di protoplasti vegetali, in particolare per affrontare il collo di bottiglia attuale screening precoce di un gran numero di genoma-editing e silenziamento genico obiettivi.

L'uso di protoplasti, al contrario di cellule vegetali intatte, ha diversi vantaggi per lo sviluppo di una piattaforma automatizzata. Innanzitutto, protoplasti sono isolati dopo la digestione della parete cellulare, e questo non è più presente barriera, efficienza di trasformazione è aumentato 13. In cellule vegetali intatte ci sono solo due metodi consolidati per la trasformazione, biolistics 14 e Agrobacterium mediata trasformazione 15. Nessuno di questi metodi può essere facilmente tradotto per piattaforme gestione di liquidi, come biolistics richiede attrezzature specializzate per Transformazioni, mentre Agrobacterium trasformazione mediata richiede co-cultura e la successiva rimozione dei batteri. Né sono suscettibili di metodi di high throughput. Nel caso di protoplasti, trasformazione viene normalmente condotta utilizzando polietilene glicole (PEG) trasfezione mediata 16, che richiede solo alcuni scambi soluzione, ed è particolarmente adatto per le piattaforme gestione dei liquidi. In secondo luogo, protoplasti, per definizione, sono culture monocellulari e quindi i problemi associati con formazione di grumi e catena di formazione in colture cellulari vegetali, non sono osservati in protoplasti. In termini di screening rapido utilizzando uno spettrofotometro piatto a base di aggregazione delle cellule, o cellule in piani multipli porterà a difficoltà di acquisire misurazioni coerenti. Poiché protoplasti sono anche più densa loro terreni di coltura, essi sedimentare sul fondo dei pozzetti, formando un monostrato, che è favorevole per spettrofotometria piastra base. Infine, mentre colture in sospensione di cellule vegetali sono Primarily derivati da callo 17, protoplasti possono essere raccolte da un certo numero di tessuti vegetali, portando alla capacità di identificare l'espressione tessuto-specifica. Ad esempio, la capacità di analizzare root- o-specifico espressione foglia di un gene può essere molto importante fenotipo previsione. Per queste ragioni, i protocolli sviluppati in questo lavoro sono stati convalidati usando protoplasti isolati dal tabacco diffuso (Nicotiana tabacum L.) 'Bright Yellow' 2 (BY-2) cultura sospensione.

La coltura in sospensione BY-2 è stato descritto come la cella "HeLa" di piante superiori, grazie al suo uso diffuso in analisi molecolare di cellule vegetali 18. Recentemente, BY-2 le cellule sono state usate per studiare gli effetti delle piante di stress 19-22, la localizzazione della proteina intracellulare 23,24, e biologia cellulare di base 25-27 dimostrare l'ampio programma di utilità di queste culture in biologia vegetale. Un ulteriore vantaggio di BY-2 culture è ilpossibilità di sincronizzare le culture con afidicolina, che può portare ad una maggiore riproducibilità per l'espressione genica studia 28. Inoltre, sono stati sviluppati metodi per l'estrazione di BY-2 protoplasti utilizzando enzimi basso costo 29,30, come enzimi tradizionalmente utilizzati per generare protoplasti sono costi proibitivi per i sistemi ad elevata capacità. Come tale, il protocollo descritto di seguito è stato convalidato utilizzando la coltura in sospensione BY-2, ma dovrebbe essere modificabile a qualsiasi coltura in sospensione delle cellule vegetali. Proof-of-concept esperimenti vengono eseguiti utilizzando un arancio proteina a fluorescenza (OFP) gene reporter (pporRFP) dalle Porites di corallo duro Porites 31 sotto il controllo del promotore CaMV 35S.

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Protocollo

1. Istituzione di sospensione culture cellulari

  1. Preparare liquido BY-2 supporti aggiungendo 4,43 g Linsmaier & Skoog supporti basali, 30 g di saccarosio, 200 mg KH 2 PO 4, e 200 mg di 2,4-diclorofenossiacetico acido (2,4-D) a 900 ml di acqua distillata l'acqua e il pH a 5,8 con 0,1 M KOH. Dopo la regolazione del pH, regolare il volume finale a 1000 ml con acqua distillata e autoclave. I supporti possono essere memorizzati fino a 2 settimane a 4 ° C.
  2. Seminare un pallone da 250 ml Erlenmeyer con 100 ml di liquido BY-2 media e un pezzo unico di BY-2 callo (> 1 cm di diametro) coltivati ​​in solidi supporti BY-2 (liquido BY-2 supporti con l'aggiunta di 1% agar) e sigillare con un foglio di alluminio. Incubare cultura a 28-30 ° C con agitazione per 5 giorni.
    NOTA: BY-2 callo è mantenuto sul solido supporto per l'archiviazione a lungo termine, come colture liquide saranno rapidamente invadere. volume di cultura può essere regolata se necessario, tipicamente una cultura 100 ml sarà in grado di caricare trentatré 6-wPiastre ELL.
  3. Trasferimento 2 ml di fase registro BY-2 cultura a 98 ml di fresca media da parte-2 e incubare per 5-7 giorni a 28-30 ° C con agitazione.
    NOTA: Sub-coltura delle colture liquide stabiliti può essere effettuata regolarmente con 1: 100 diluizioni di vecchie culture 5-7 giorno, piuttosto che l'inoculazione con callo.
  4. Mescolare accuratamente la cultura, le cellule saranno rapidamente stabilirsi, e il trasferimento di 6 ml di coltura cellulare in una provetta da fondo centrifuga 15 ml conica e lasciare che le cellule riposare per almeno 10 minuti. Regolare l'ematocrito al 50% del volume totale rimuovendo surnatante.
  5. Agitare il tubo invertendo e pipetta 500 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti per la digestione. Utilizzare pipette ampio tunnel per trasferire le cellule in questa fase, in quanto sono densi e intasare puntali standard.

2. Isolamento Protoplast

  1. Accendere tutti i componenti del sistema robotico (Figura 1A) e aprire l'attività targa motore pianificazione morbidoware. Il programma di pianificazione delle attività integra il motore micropiastra con le altre apparecchiature per consentire il trasferimento di piastre tra ogni pezzo di equipaggiamento.
  2. Prima di sperimentazione, di definire le specifiche tecniche per mediche di laboratorio (ad esempio, piatti, coperchi) utilizzati nel protocollo, così come posizioni di inizio e fine per ogni pezzo di articoli da laboratorio, nel software piastra di motore, come segue:
    1. Fare clic su Imposta dalla barra degli strumenti principale del software piastra di motore e selezionare il comando Gestisci tipi di container.
    2. Se il tipo di contenitore è elencato nella libreria dei tipi contenitore esistente, quindi selezionare il contenitore appropriato.
    3. Se il tipo di contenitore non è elencato nella libreria dei tipi contenitore esistente quindi fare clic su Aggiungi per specificare un nuovo tipo di contenitore.
    4. Dopo aver aggiunto un nuovo tipo di contenitore, inserire le dimensioni del nuovo contenitore (altezza, larghezza, dimensioni accatastamento, e di presa di offset) nelle schede appropriate e fare clic su Salva.
      1. Se le dimensioni corrette non sono disponibili presso il produttore, quindi determinare con precisione tutte le dimensioni al millimetro con le pinze. Gli errori nella misurazione delle dimensioni del contenitore si tradurrà in un fallimento del motore piatto.
    5. Ripetere i passaggi 2.2.2 attraverso 2.2.4.1 per tutti i tipi di contenitori che il motore piatto incontrerà. Dopo il completamento di questa fase per tutti da laboratorio, è necessario definire l'inizio e la posizione di fine per ciascun contenitore (fase 2.2.6).
      NOTA: per questo protocollo il labware comprende la 6-pozzetti, il piatto profondo bene, e la piastra di screening a 96 pozzetti fluorescenti.
    6. Per definire la posizione di inizio e la fine di ogni contenitore, fare clic sulla scheda Start / End in un protocollo specifico. In primo luogo, selezionare la posizione di partenza di ogni contenitore. Avanti, selezionare la casella per Lidded / Unlidded sia l'inizio e la posizione finale. Ripetere l'operazione per tutti i contenitori.
      NOTA: Se il contenitore sarà lasciato su un altro pezzo di equipment (al posto del motore piatto) la posizione finale può essere lasciato vuoto.
  3. In questa fase caricare manualmente tutte le piastre nella posizione di partenza per l'intero flusso di lavoro. Caricare le piastre di screening fluorescenti-ben 96 in hotel 2, 6 pozzetti con by-2 cellule in hotel 3, una piastra 96 ​​profondo bene che verrà utilizzato per la trasformazione sul riscaldamento piatto / chiller nido 2, ed una conica da 50 ml provetta contenente la soluzione enzimatica (vedi file supplementare, sezione 1.2.2) al dispenser multi-mode.
    1. Se trasformazione sarà effettuata nel protocollo, pre-caricare la piastra profondo bene 96 con 10 ml di DNA plasmidico per pozzo (1 mg / mL, A 260/280> 1.8) contenente il reporter costrutto OFP e incubare sul piatto riscaldamento / raffreddamento a 4 ° C. Ogni pozzetto sarà utilizzato per una singola trasformazione, quindi il numero di pozzetti riempiti dipenderà dalla configurazione sperimentale.
  4. Caricare tutte le forniture e le piastre sul automatizzared piattaforma di gestione dei liquidi nei luoghi designati e definire la posizione di ogni elemento del software di controllo di automazione (Figura 1B).
    1. Caricare una piastra a 96 pozzetti precaricato con 200 ml di 40% PEG in MMg (0,4 M mannitolo, 100 mM MgCl 2, 4 MM MES, pH 5.7) nella colonna 1, 200 ml di ioduro di propidio (PI, 1 mg / ml) nella colonna 2, e 200 ml di etanolo nella colonna 3 (nido 2), e una scatola di punte della pipetta in nido 8.
    2. Per definire la posizione del labware nel software della piattaforma di gestione dei liquidi automatizzato, selezionare Strumenti dal menu e fare clic mediche di laboratorio Editor.
    3. Selezionare il tipo di materiale da laboratorio dal menu a tendina o definire un nuovo tipo di materiale da laboratorio utilizzando il pulsante Nuovo mediche di laboratorio.
    4. Definire la posizione di ogni pezzo di labware selezionato selezionando la scheda protocollo principale e facendo clic su Configura mediche di laboratorio. Assicurarsi che ogni pezzo di labware posto sulla piattaforma di gestione dei liquidi automatizzato èdefinito prima di eseguire il protocollo.
    5. Per attivare i protocolli automatici, fare clic sulla finestra di Explorer profilo e selezionare il nome del protocollo da eseguire (Isolamento Protoplast, Cell Count, e trasformazione PEG-mediata).
    6. Fare clic su Esegui per inizializzare tutti i dispositivi che verranno utilizzati nel protocollo.
    7. Infine, nella finestra di lavoro Explorer, fare clic su Aggiungi unità di lavoro per verificare tutti i contenitori / labware nel sistema e iniziare il protocollo automatizzato.
      NOTA: le descrizioni complete dei protocolli automatizzati sono contenuti nel file supplementare.

3. Stabilire curva standard per conteggio delle cellule

  1. Concentrarsi manualmente protoplasti ad una concentrazione di 1 x 10 6 protoplasti / ml in un volume di 1 ml. Centrifuga protoplasti a 1.000 xg per 10 minuti e rimuovere il surnatante.
  2. Aggiungere manualmente 900 ml di etanolo al 70% (mantenuto a 4 ° C) al pellet protoplastie risospendere il pellet. Incubare per 10 minuti in ghiaccio per riparare le cellule.
  3. Aggiungere 100 ml di PI (1 mg / ml) per i protoplasti di etichettare i nuclei e consentire il rilevamento da parte del lettore di piastre.
  4. Carico 80 ml di liquido BY-2 supporti in ogni colonna e riga della piastra di screening a 96 pozzetti fluorescenti a partire da colonna 2.
  5. Nella colonna 1 di una piastra di screening a 96 pozzetti fluorescenti, aggiungere 70 ml di protoplasti e 50 ml BY-2 media per ciascun bene nella colonna.
  6. Porre la piastra in nido 6 della piattaforma di gestione dei liquidi automatizzato, ed eseguire una diluizione seriale a 2 volte.
    1. Per condurre una diluizione di serie sulla piattaforma di gestione dei liquidi automatizzato, fare clic su Avvia procedura guidata diluizione seriale e regolare il volume di trasferimento (60 ml), numero di miscele e di volume (2, 70 ml), pozzi iniziali (colonna 1, righe AF), la diluizione Wells (Colonne 2-11, righe AF), e aspirare e dispensare proprietà (0,5 mm dalla ben inferiore).
    2. Dopo aver impostato i parametri, salvare und eseguire il protocollo.
      NOTA: Dal momento che tutti i protoplasti sono etichettati con PI (a causa della fissazione delle cellule), la fluorescenza è proporzionale alla concentrazione protoplasti.
    3. Dopo la diluizione di serie è completata, rimuovere la piastra dal nido 9 e inserire nel lettore di piastre ed eseguire il protocollo curva standard nel software lettore di piastre.
      NOTA: Una curva standard verrà generato confrontando la fluorescenza da PI (eccitazione 536 nm / emissione 620 nm) in ciascun pozzetto con la concentrazione protoplasti noto.
  7. Al termine del protocollo lettore di piastre, rimuovere la piastra e raccogliere eventuali cellule transgeniche per la sterilizzazione in autoclave o altre procedure di de-vitalizzazione come definite nei protocolli di biosicurezza '.

4. Analisi microscopica di Trasformazione

  1. Rimuovere la piastra con protoplasti trasformati (il prodotto di Automated protocollo 3, File supplementare) dall'Hotel 1 del sistema robotico.
  2. Giroil microscopio invertito, la macchina fotografica, e lampada fluorescente.
  3. Selezionare l'obiettivo 10X per iniziale concentrandosi sui protoplasti, accendere la lampada alogena, e chiudere l'otturatore per la lampada fluorescente.
  4. Piatto di carico sul sistema microscopico e focus sulle protoplasti con campo chiaro.
  5. Dopo concentrandosi su protoplasti, spegnere la lampada alogena e aprire l'otturatore per la lampada fluorescente.
  6. Selezionare il filtro CY3 / TRITC set per la visualizzazione della proteina pporRFP espressa dai protoplasti transgenici.
  7. La scansione di ogni bene per determinare il numero di protoplasti esprimere il marcatore pporRFP fluorescente.
  8. Calcolare l'efficienza di trasformazione come il numero totale di protoplasti esprimere il marcatore fluorescente il numero totale di protoplasti.
  9. Raccogliere tutte le piastre contenenti cellule transgeniche in sacchetti di biosicurezza approvati per la sterilizzazione in autoclave o altre procedure di de-vitalizzazione come definite nei protocolli di biosicurezza '.

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Risultati

In questo studio, il tasso di raddoppio BY-2 varia dai 14-18 hr dipendente dalla temperatura alla quale sono stati incubati le culture, coerente con le precedenti relazioni di media durata del ciclo cellulare delle 15 ore. Con questo tasso raddoppio, 1: 100 inoculo di partenza è stato usato per iniziare culture, portando a culture con un volume imballato cellulare (PCV) del 50% in 5-7 giorni. Nel protocollo attuale, in cui le culture sono state coltivate in 200 ml di mezzi di comunicazi...

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Discussione

Il protocollo sopra descritto è stato convalidato con successo per l'isolamento di protoplasti, l'enumerazione e la trasformazione utilizzando il tabacco coltura cellulare sospensione BY-2; Tuttavia, il protocollo potrebbe facilmente essere esteso a qualsiasi coltura in sospensione pianta. Allo stato attuale, l'isolamento di protoplasti e trasformazione è stato raggiunto in numerose piante, tra cui il mais (Zea mays) 10, carota (Daucus carota) 32, il pioppo (Popu...

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Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario in competizione.

Riconoscimenti

This research was supported by Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Orbitor RS Microplate moverThermo Scientific
Bravo Liquid HandlerAgilent
Synergy H1 Multi-mode ReaderBioTek
MultiFlo FX Multi-mode DispenserBioTek
TeleshakeInheco3800048
CPAC Ultraflat Heater/coolerInheco7000190
Vworks Automation SoftwareAgilentSoftware used to control and write protocols for Agilent Bravo
Momentum SoftwareThermo ScientificTask scheduling software for controlling Orbiter RS
Liquid Handling Control 2.17 SoftwareBiotekSoftware used to control and write protocols for MultiFlo FX
IX81 Inverted MicroscopeOlympus
Zyla 3-Tap microscope cameraAndor
ET-CY3/TRITC Filter SetChroma Technology Corp49004
Rohament CLAB Enzymessample bottlelow-cost cellulase
Rohapect UFAB Enzymessample bottlelow-cost pectinase
Rohapect 10LAB Enzymessample bottlelow-cost pectinase/arabinase
Linsmaier & Skoog Basal MediumPhytotechnology LaboratoriesL689
2,4-dichlorophenoxyacetic acidPhytotechnology LaboratoriesD295
propidium iodideSigma AldrichP4170
Poly(ethylene glycol) 4000Sigma Aldrich95904-250G-FFormerly Fluka PEG
Propidium IodideFisher Scientific25535-16-4Acros Organics
CaCl2Sigma AldrichC7902-1KG
Sodium AcetateFisher ScientificBP333-500
MannitolSigma AldrichM1902-1KG
SucroseFisher ScientificS5-3
KH2PO4Fisher ScientificAC424205000
KOHSigma AldrichP1767
Gelzan CMSigma AldrichG1910-250G
6-well plateThermo Scientific103184
96-well 1.2 ml deep well plateThermo ScientificAB-0564
96 well optical bottom plateThermo Scientific165305
Finntip 1000 Wide bore Pipet tipsThermo Scientific9405 163
NaClFisher ScientificBP358-10
KClSigma AldrichP4504-1KG
MESFisher ScientificAC17259-5000
MgCl2Fisher ScientificM33-500

Riferimenti

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