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Resumen

Una metodología de alto rendimiento, la producción de protoplastos de tabaco automatizado y se describe la transformación. El sistema robótico permite la expresión de genes masivamente paralelo y el descubrimiento en el sistema modelo BY-2 que debe ser traducible a los cultivos no modelo.

Resumen

Durante la última década ha habido un resurgimiento en el uso de protoplastos de plantas que van desde especies modelo para recortar las especies, para el análisis de las vías de transducción de señales, redes de regulación transcripcional, la expresión de genes, genoma de edición, y el silenciamiento de genes. Por otra parte, se ha hecho un progreso significativo en la regeneración de plantas a partir de protoplastos, que ha generado aún más interés en el uso de estos sistemas para la genómica de las plantas. En este trabajo, un protocolo ha sido desarrollado para la automatización de aislamiento de protoplastos y la transformación de 2 (A-2) un cultivo en suspensión de tabaco 'amarillo brillante' usando una plataforma robótica. Los procedimientos de transformación se validaron utilizando una proteína fluorescente de color naranja (OFP) gen reportero (pporRFP) bajo el control del promotor del virus del mosaico de la coliflor 35S (35S). expresión OFP en protoplastos se confirmó por microscopía de epifluorescencia. Los análisis también incluyen métodos de eficiencia de producción de protoplastos utilizando propidium yoduro. Por último, se utilizaron enzimas de grado alimenticio de bajo costo para el procedimiento de aislamiento de protoplastos, eludiendo la necesidad de enzimas de laboratorio de grado que son un costo prohibitivo en automatizada de alto rendimiento de aislamiento y análisis de protoplastos. Basado en el protocolo desarrollado en este trabajo, el procedimiento completo de aislamiento de protoplastos a la transformación puede llevarse a cabo en menos de 4 horas, sin ninguna entrada por parte del operador. Mientras que el protocolo desarrollado en este trabajo se validó con el cultivo de células BY-2, los procedimientos y métodos deben ser traducible a cualquier sistema de cultivo en suspensión planta / protoplastos, que debería permitir la aceleración de la investigación genómica de cultivos.

Introducción

En los últimos años ha habido un importante impulso colocado en el diseño de los cultivos transgénicos para superar diversas enfermedades 1, dotar de resistencia al herbicida 2, conferir sequía 3,4 y tolerancia a la sal 5, prevenir herbivoría 6, aumentar la producción de biomasa 7, y disminuir la obstinación pared celular 8. Esta tendencia se ha visto favorecido por el desarrollo de nuevas herramientas moleculares para la generación de plantas transgénicas, incluyendo genoma de edición utilizando CRISPR y Talens 9, y el silenciamiento de genes a través de dsRNA 10, 11 miRNA y siRNA 12. Si bien estas tecnologías han simplificado la generación de plantas transgénicas, también han creado un cuello de botella, donde la gran cantidad de plantas transgénicas generadas no pueden ser examinados utilizando los sistemas tradicionales que se basan en la regeneración de plantas. En relación con este cuello de botella, mientras que el silenciamiento y construcciones de edición de genoma se pueden insertar rápidamente en plantas, muchos de losrasgos específicos no producen el efecto deseado, que a menudo no se descubre hasta que las plantas se analizan en el invernadero. En este trabajo, hemos desarrollado un método para la rápida detección automatizada, y de alto rendimiento de protoplastos de plantas, específicamente para hacer frente al actual bloqueo en la detección precoz de un gran número de genoma de edición y silenciamiento de genes objetivos.

El uso de protoplastos, en oposición a las células vegetales intactas, tiene varias ventajas para el desarrollo de una plataforma automatizada. En primer lugar, los protoplastos se aislaron después de la digestión de la pared celular vegetal, y con esta barrera ya no está presente, la eficiencia de transformación se incrementa 13. En las células vegetales intactas sólo hay dos métodos bien establecidos para la transformación biolística, 14 y transformación mediada por Agrobacterium 15. Ninguno de estos métodos se puede traducir fácilmente a plataformas de manejo de líquidos, como biolística requiere equipo especializado para transfoconfirmación, mientras transformación mediada por Agrobacterium requiere co-cultivo y la posterior eliminación de las bacterias. Tampoco son susceptibles de métodos de alto rendimiento. En el caso de protoplastos, la transformación se lleva a cabo rutinariamente utilizando polietilenglicol (PEG) transfección mediada por 16, que sólo requiere varios intercambios de solución, y es ideal para las plataformas de manejo de líquidos. En segundo lugar, los protoplastos, por definición, son cultivos de una sola célula, y por lo tanto los problemas asociados con la formación de grumos y de la cadena en cultivos de células vegetales, no se observan en los protoplastos. En cuanto a la detección rápida utilizando un espectrofotómetro basado en placas, agrupación de células o células en múltiples planos dará lugar a dificultades en la adquisición de mediciones consistentes. Desde protoplastos son también más denso que su medio de cultivo, que sedimentan en el fondo de los pozos, la formación de una monocapa, que es propicio para la espectrofotometría a base de placa. Por último, mientras que los cultivos en suspensión de células vegetales son primarily derivado de callus 17, los protoplastos se pueden cosechar a partir de un número de tejidos de la planta, dando lugar a la capacidad de identificar la expresión específica de tejido. Por ejemplo, la capacidad de analizar Raíz o expresión de hoja específica de un gen puede ser muy importante a la predicción fenotipo. Por estas razones, los protocolos desarrollados en este trabajo se validaron utilizando protoplastos aislados del tabaco utilizado ampliamente (Nicotiana tabacum L.) 2 (A-2) cultivo en suspensión 'amarillo brillante'.

El cultivo en suspensión BY-2 se ha descrito como la célula "HeLa" de las plantas superiores, debido a su uso ubicuo en el análisis molecular de las células vegetales 18. Recientemente, AP-2 células se han utilizado para estudiar los efectos de los factores de estrés vegetal 19-22, intracelular localización de la proteína 23,24, y la biología celular básica 25-27 demuestra la amplia utilidad de estas culturas en biología vegetal. Una ventaja adicional de la AP-2 culturas es lacapacidad de sincronizar los cultivos con afidicolina, que puede conducir a la reproducibilidad mejorada para la expresión génica estudia 28. Además, se han desarrollado métodos para la extracción de BY-2 protoplastos usando enzimas de bajo coste 29,30, como enzimas utilizadas tradicionalmente para generar protoplastos son costo prohibitivo para los sistemas de alto rendimiento. Como tal, el protocolo descrito a continuación ha sido validado con el cultivo en suspensión BY-2, pero debe ser modificable a cualquier cultivo en suspensión de células vegetales. Experimentos de prueba de concepto se realizan utilizando una proteína de la fluorescencia naranja (OFP) gen reportero (pporRFP) de los Porites de coral Porites duros 31 bajo el control del promotor CaMV 35S.

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Protocolo

1. Establecimiento de suspensión Cultivos Celulares

  1. Preparar líquido BY-2 medios de comunicación mediante la adición de 4,43 g Linsmaier y Skoog medios basales, 30 g de sacarosa, 200 mg de KH 2 PO 4, y 200 g de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) a 900 ml de agua destilada el agua y el pH a 5,8 con 0,1 M de KOH. Después de ajustar el pH, ajustar el volumen final a 1.000 ml con agua destilada y se autoclave. Los medios pueden ser almacenados hasta 2 semanas a 4 ° C.
  2. Inocular un matraz Erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de líquido BY-2 medios de comunicación y una sola pieza de BY-2 del callo (> 1 cm de diámetro) cultivadas en sólidos BY-2 (del líquido BY-2 medios con la adición de 1% agar) y sellar con papel de aluminio. Incubar cultivo a 28-30 ° C con agitación durante 5 días.
    NOTA: POR-2 callo se mantuvo en medio sólido para almacenamiento a largo plazo, ya que los cultivos líquidos se cubran rápidamente. volumen de cultivo se puede ajustar según sea necesario, típicamente un cultivo de 100 ml será capaz de cargar treinta y tres 6-wplacas de ELL.
  3. Transferencia de 2 ml de la fase de registro BY-2 de cultivo a 98 ml de frescas medios BY-2 y se incuba durante 5-7 días a 28-30 ° C con agitación.
    NOTA: Sub-cultivo de cultivos líquidos establecidos puede llevarse a cabo utilizando regularmente 1: 100 diluciones de las culturas antiguas 5-7 día, en lugar de la inoculación con el callo.
  4. Mezclar a fondo la cultura, como las células se depositan rápidamente, y la transferencia de 6 ml del cultivo celular a un tubo de centrífuga de 15 ml de fondo cónico y dejar que las células se depositan durante al menos 10 min. Ajustar el volumen de células empaquetadas a 50% del volumen total mediante la eliminación de sobrenadante.
  5. Agitar tubo por inversión y pipeta de 500 l en cada pocillo de una placa de 6 pocillos para la digestión. Utilice pipetas de todo el taladro para transferir las células en esta etapa, ya que son densos y obstruye los puntas de pipeta estándar.

2. Aislamiento de protoplastos

  1. Encienda todos los componentes del sistema robótico (Figura 1) y abra la tarea de programar la placa motor suavemercancía. El programa de la programación de tareas integra el motor de microplacas con el resto del equipo para permitir la transferencia de las placas entre cada pieza del equipo.
  2. Antes de la experimentación, definir las especificaciones técnicas de los aparatos de laboratorio (por ejemplo, platos, tapas) utilizados en el protocolo, así como posiciones inicial y final de cada pieza de material de laboratorio, en el software de la placa de motor, de la siguiente manera:
    1. Haga clic en Configuración de la barra de herramientas principal en el software de la placa de motor y seleccione el contenedor de comandos Administrar tipos.
    2. Si el tipo de contenedor aparece en la biblioteca de tipos de contenedores existentes, a continuación, seleccione el contenedor adecuado.
    3. Si el tipo de envase no aparece en la biblioteca de tipos de contenedores existentes continuación, haga clic en Agregar para especificar un nuevo tipo de contenedor.
    4. Después de la adición de un nuevo tipo de contenedor, introduzca las dimensiones del nuevo contenedor (altura, anchura, dimensiones de apilamiento, y la pinza de compensación) en las fichas apropiadas y haga clic en Guardar.
      1. Si las dimensiones correctas no están disponibles por el fabricante, a continuación, determinar con precisión todas las dimensiones al milímetro más cercano usando calibres. Los errores en la medición de las dimensiones de los contenedores van a resultar en una falla del motor placa.
    5. Repita los pasos 2.2.2 a 2.2.4.1 para todos los tipos de contenedores que el motor placa tendrá que enfrentar. Después de la terminación de este paso para todos los aparatos de laboratorio, es necesario definir el comienzo y la ubicación final para cada contenedor (etapa 2.2.6).
      NOTA: Para este protocolo incluye el material de laboratorio de la placa de 6 pocillos, la placa de pozo profundo, y la placa de cribado de 96 pocillos fluorescente.
    6. Para definir la posición de inicio y final de cada contenedor, haga clic en la pestaña de inicio / fin en un protocolo específico. En primer lugar, seleccionar la posición de inicio de cada contenedor. A continuación, marque la casilla de Lidded / Unlidded tanto en la posición inicial y final. Repita este procedimiento para todos los contenedores.
      NOTA: Si el contenedor será dejado en otro pedazo de equipment (en lugar de la placa de motor) la localización final puede dejarse en blanco.
  3. En esta etapa cargar manualmente todas las placas en la posición de partida para todo el flujo de trabajo. Cargar las placas de detección fluorescentes de 96 pocillos en hoteles 2, placas de 6 pocillos con células BY-2 en hotel 3, una placa de 96 pozos profundos que se utiliza para la transformación en calentador de placas / enfriador nido 2, y un cónico de 50 ml tubo que contiene la solución de enzima (véase el archivo de consulta, sección 1.2.2) en el dispensador de multi-modo.
    1. Si la transformación se lleva a cabo en el protocolo, pre-cargar la placa de pozo profundo 96 con 10 l de plásmido de ADN por pocillo (1 mg / l, A 260/280> 1,8) que contiene el constructo indicador OFP y se incuba en la placa calentador / refrigerador a 4 ° C. Cada pozo se utiliza para una sola transformación, por lo tanto el número de pozos llenos dependerá de la configuración experimental.
  4. Cargar todos los suministros y placas en el automaticed plataforma de manejo de líquidos en los lugares designados y definir la posición de cada elemento en el software de control de automatización (Figura 1B).
    1. Cargar una placa de 96 pocillos precargada con 200 l de 40% de PEG MMG (0,4 M de manitol, 100 mM de MgCl 2, MES 4 mM, pH 5,7) en la columna 1, 200 l de yoduro de propidio (PI, 1 mg / ml) en la columna 2, y 200 l de etanol en la columna 3 (nido 2), y una caja de puntas de pipeta en el nido 8.
    2. Para definir la ubicación del material de laboratorio en el software de la plataforma de manejo de líquidos automatizado, seleccione Herramientas en el menú y haga clic en Editor de material de laboratorio.
    3. Seleccione el tipo de material de laboratorio en el menú desplegable o definir un nuevo tipo de material de laboratorio utilizando el botón Nuevo material de laboratorio.
    4. Definir la posición de cada pieza de material de laboratorio seleccionadas mediante la selección de la ficha Protocolo principal y haciendo clic en Configurar para laboratorio. Asegúrese de que cada pieza de material de laboratorio colocado en la plataforma de manejo de líquidos automatizado esdefinir antes de ejecutar el protocolo.
    5. Para activar los protocolos automatizados, haga clic en la ventana del perfil Explorer y seleccione el nombre del protocolo que va a ejecutar (el aislamiento de protoplastos, recuento de células, y la transformación mediada por PEG).
    6. Haga clic en Ejecutar para inicializar todos los dispositivos que serán utilizados en el protocolo.
    7. Por último, en la ventana del Explorador de trabajo, haga clic en Agregar unidad de trabajo para verificar todos los contenedores / material de laboratorio en el sistema y comenzar el protocolo automatizado.
      NOTA: Las descripciones completas de los protocolos automatizados están contenidas en el archivo suplementario.

3. Establecer curva estándar para contar las células

  1. Concentrar manualmente protoplastos a una concentración de 1 x 10 6 protoplastos / ml en un volumen de 1 ml. Centrifugar protoplastos a 1.000 xg durante 10 min, y eliminar el sobrenadante.
  2. Adición manual de 900 l de etanol al 70% (se mantiene a 4 ° C) al sedimento de protoplastosy volver a suspender el sedimento. Incubar durante 10 minutos en hielo para fijar las células.
  3. Añadir 100 l de PI (1 g / ml) a los protoplastos para etiquetar los núcleos y permitir la detección por el lector de placas.
  4. Carga de 80 l de líquido BY-2 medios en cada columna y fila de la placa de cribado de 96 pocillos fluorescente a partir de la columna 2.
  5. En la columna 1 de una placa de cribado de 96 pocillos fluorescente, añadir 70 l de protoplastos y 50 l por 2 los medios de comunicación a cada pocillo en la columna.
  6. Colocar la placa en nido 6 de la plataforma de manejo de líquidos automatizado, y ejecutar una serie de dilución de 2 veces.
    1. Para llevar a cabo una dilución en serie en la plataforma de manejo de líquidos automatizado, haga clic en Iniciar Asistente de dilución en serie y ajustar el volumen de transferencia (60 l), número de mezclas y volumen (2, 70 l), pozos iniciales (columna 1, filas AF), la dilución Wells (2-11 Columnas, Filas AF), y aspirar y dosificar propiedades (0,5 mm del fondo del pozo).
    2. Después de ajustar los parámetros, guardar unad ejecutar el protocolo.
      NOTA: Dado que todos los protoplastos se marcan con PI (debido a la fijación de las células), la fluorescencia es proporcional a la concentración de protoplastos.
    3. Después de que se completó la dilución en serie, retirar la placa de nido 9 y se insertan en el lector de placas y ejecutar el protocolo de curva estándar en el software lector de placas.
      NOTA: una curva estándar a continuación, se genera comparando la fluorescencia de PI (excitación 536 nm / emisión 620 nm) en cada pocillo con la concentración de protoplastos conocido.
  7. Tras la finalización del protocolo de lector de placas, eliminar la placa y recoger las células transgénicas para la esterilización en autoclave u otros procedimientos de-vitalizar tal como se definen en los protocolos de seguridad de la biotecnología.

4. Análisis microscópico de Transformación

  1. Retire la placa con protoplastos transformados (el producto de Protocolo Automatizado 3, Archivo Suplementario) del Hotel 1 del sistema robótico.
  2. Giroen microscopio invertido, cámara, y la lámpara fluorescente.
  3. Seleccione el objetivo de 10X para inicial se centra en los protoplastos, encender la lámpara de halógeno, y cerrar el obturador de la lámpara fluorescente.
  4. Carga de placa en el sistema microscópico y se centran en los protoplastos utilizando campo claro.
  5. Después de centrarse en protoplastos, apague la lámpara halógena y abrir el obturador de la lámpara fluorescente.
  6. Seleccione el filtro CY3 / TRITC establecido para la visualización de la proteína pporRFP expresada por los protoplastos transgénicos.
  7. Analiza cada pocillo para determinar el número de protoplastos que expresan la pporRFP marcador fluorescente.
  8. Calcular la eficiencia de transformación como el número total de protoplastos que expresan el marcador fluorescente el número total de protoplastos.
  9. Recoger las placas que contienen células transgénicas en bolsas de bioseguridad aprobados para el tratamiento en autoclave u otros procedimientos de-vitalizar tal como se definen en los protocolos de bioseguridad '.

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Resultados

En el estudio actual, la tasa de duplicación de BY-2 varió desde 14 hasta 18 hr depende de la temperatura a la cual se incubaron los cultivos, coherente con los informes anteriores de una longitud media del ciclo celular de 15 hr. Con esta velocidad de duplicación, un 1: se utilizó el inóculo de partida 100 para iniciar los cultivos, lo que lleva a los cultivos con un volumen de células empaquetadas (PCV) de 50% en 5-7 días. En el protocolo actual, en el que se hicieron crecer cul...

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Discusión

El protocolo descrito anteriormente ha sido validado con éxito para el aislamiento de protoplastos, enumeración, y la transformación mediante el cultivo de células de tabaco suspensión BY-2; Sin embargo, el protocolo puede ampliarse fácilmente a cualquier planta de cultivo en suspensión. En la actualidad, el aislamiento de protoplastos y la transformación que se ha logrado en numerosas plantas, incluido el maíz (Zea mays) 10, la zanahoria (Daucus carota) 32, el álamo

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen ningún interés financiero en competencia.

Agradecimientos

This research was supported by Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Orbitor RS Microplate moverThermo Scientific
Bravo Liquid HandlerAgilent
Synergy H1 Multi-mode ReaderBioTek
MultiFlo FX Multi-mode DispenserBioTek
TeleshakeInheco3800048
CPAC Ultraflat Heater/coolerInheco7000190
Vworks Automation SoftwareAgilentSoftware used to control and write protocols for Agilent Bravo
Momentum SoftwareThermo ScientificTask scheduling software for controlling Orbiter RS
Liquid Handling Control 2.17 SoftwareBiotekSoftware used to control and write protocols for MultiFlo FX
IX81 Inverted MicroscopeOlympus
Zyla 3-Tap microscope cameraAndor
ET-CY3/TRITC Filter SetChroma Technology Corp49004
Rohament CLAB Enzymessample bottlelow-cost cellulase
Rohapect UFAB Enzymessample bottlelow-cost pectinase
Rohapect 10LAB Enzymessample bottlelow-cost pectinase/arabinase
Linsmaier & Skoog Basal MediumPhytotechnology LaboratoriesL689
2,4-dichlorophenoxyacetic acidPhytotechnology LaboratoriesD295
propidium iodideSigma AldrichP4170
Poly(ethylene glycol) 4000Sigma Aldrich95904-250G-FFormerly Fluka PEG
Propidium IodideFisher Scientific25535-16-4Acros Organics
CaCl2Sigma AldrichC7902-1KG
Sodium AcetateFisher ScientificBP333-500
MannitolSigma AldrichM1902-1KG
SucroseFisher ScientificS5-3
KH2PO4Fisher ScientificAC424205000
KOHSigma AldrichP1767
Gelzan CMSigma AldrichG1910-250G
6-well plateThermo Scientific103184
96-well 1.2 ml deep well plateThermo ScientificAB-0564
96 well optical bottom plateThermo Scientific165305
Finntip 1000 Wide bore Pipet tipsThermo Scientific9405 163
NaClFisher ScientificBP358-10
KClSigma AldrichP4504-1KG
MESFisher ScientificAC17259-5000
MgCl2Fisher ScientificM33-500

Referencias

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