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要約

ハイスループット、自動化され、タバコプロトプラストの生産と変換方法について説明します。ロボットシステムは、非モデル作物に翻訳可能であるべきであるBY-2システムモデルにおける大規模並列遺伝子発現と発見を可能にします。

要約

過去10年間のシグナル伝達経路、転写制御ネットワーク、遺伝子発現、ゲノム編集、および遺伝子サイレンシングの分析のため、モデル種からの作物種に及ぶ植物プロトプラストの使用に復活がありました。さらに、重要な進展は、植物ゲノミクスのためのこれらのシステムの使用であってもより多くの関心を生成したプロトプラストからの植物の再生、で行われています。この作業では、プロトコルは、ロボットプラットフォームを使用して「明るい黄色 '2（BY-2）タバコ懸濁培養からのプロトプラストの分離および形質転換の自動化のために開発されてきました。形質転換手順は、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター（35S）の制御下で、オレンジ色蛍光タンパク質（OFP）レポーター遺伝子（pporRFP）を用いて検証しました。プロトプラストにおけるOFPの発現は、エピ蛍光顕微鏡によって確認されました。分析はまたpropidiuを用いてプロトプラスト生産効率の方法を含めメートルヨウ化。最後に、低コストの食品グレードの酵素は、ハイスループット自動プロトプラスト単離および分析にコスト高である実験室グレードの酵素の必要性を回避する、プロトプラスト単離手順のために使用しました。今回開発したプロトコルに基づいて、変換へのプロトプラスト単離からの完全な手順は、オペレータからの入力なしに、4時間の下で行うことができます。今回開発したプロトコルは、BY-2細胞培養で検証されたが、手順および方法は、作物ゲノム研究の加速を有効にする必要があります任意の植物懸濁培養/プロトプラストシステムに翻訳可能でなければなりません。

概要

除草剤抵抗性2を与える、様々な疾患1を克服するために、トランスジェニック作物の設計上に配置された有意な刺激があった近年、バイオマス収率7を高める、草食性6を防ぐ、干ばつ3,4および塩耐性5を付与し、細胞壁の反抗を減少させます8。この傾向は、CRISPRとTALENs 9を用いて、ゲノム編集、およびdsRNAの10、miRNAの11、およびsiRNA 12を介して遺伝子サイレンシングを含むトランスジェニック植物を生成するための新たな分子ツールの開発によって支援されています。これらの技術は、トランスジェニック植物の生成を簡略化しているが、彼らはまた、生成されたトランスジェニック植物の膨大な数は植物体再生に依存している従来のシステムを用いてスクリーニングすることができないボトルネックを作成しました。 、多くのサイレンシングゲノム編集構築物が急速に植物内に挿入することができるが、このボトルネックに関連します標的の形質は、植物を温室内で分析されるまで、頻繁に発見されていない所望の効果を生み出すことができません。この研究では、特異的ゲノム編集及び遺伝子サイレンシングの標的の多数の初期スクリーニングにおいて現在のボトルネックに対処するために、植物プロトプラストの迅速、自動化、ハイスループットスクリーニングのための方法を開発しました。

無傷の植物細胞とは対照的に、プロトプラストの使用は、自動化されたプラットフォームの開発のためのいくつかの利点を有します。まず、プロトプラストは、植物細胞壁の消化後に単離されており、もはや存在し、このバリアと、形質転換効率は、13に増加します。無傷の植物細胞14およびアグロバクテリウム媒介形質転換15遺伝子銃形質転換のために2つだけの十分に確立された方法があります。微粒子銃がtransfoのための特殊な装置を必要とするこれらの方法のいずれもが簡単に、液体ハンドリングプラットフォームに変換することができますアグロバクテリウムを介した形質転換一方rmationは、共培養し、細菌のその後の除去を必要とします。どちらも高スループット方法のために適していません。プロトプラストの場合には、変換は、日常的にのみ、いくつかの溶液交換を必要とし、理想的には、液体ハンドリングプラットフォームに適しているポリエチレングリコール（PEG）媒介性トランスフェクション16を用いて行われます。第二に、プロトプラストは、定義により、単一細胞培養物であり、従って、植物細胞培養物中で凝集し、鎖形成に関連する問題は、プロトプラストでは観察されません。プレートベースの分光光度計を用いて迅速なスクリーニングの観点から、複数の平面内の細胞、または細胞の凝集は、一貫した測定値を取得することの困難につながります。プロトプラストは、それらの培地よりも密であるので、それらは、プレートベースの分光光度法のために助長している単分子層を形成し、ウェルの底に沈降します。最後に、植物細胞懸濁培養物はprimarいる間ILYカルス17由来のプロトプラストは、組織特異的発現を同定する能力をもたらす、植物組織の数から採取することができます。例えば、遺伝子のルートで、または葉特異的発現を分析する能力は、表現型の予測にとって非常に重要であることができます。これらの理由から、本研究で開発されたプロトコルが広く使用されているタバコ（ タバコ L.）「明るい黄色'2（BY-2）懸濁培養物から単離したプロトプラストを用いて検証しました。

BY-2浮遊培養は、植物細胞18の分子分析におけるその遍在使用のために、高等植物の「HeLa細胞」細胞として記載されています。最近、BY-2細胞は、植物の効果を研究するために使用されている、細胞内タンパク質局在23,24、および植物生物学において、これらの培養物の広範な有用性を示す基本的な細胞生物学25-27を 19-22をストレッサー。 BY-2培養物のさらなる利点は遺伝子発現研究28向けに拡張再現性につながる可能性がアフィディコリン、と文化を同期する機能。さらに、方法は、伝統的に、プロトプラストを生成するために使用される酵素は、コスト高スループットシステムのために禁止されているように、低コストの酵素29,30を用いた BY-2プロトプラストの抽出のために開発されてきました。そのようなものとして、以下に記載されるプロトコルは、BY-2浮遊培養を用いて検証されていますが、それは任意の植物細胞懸濁培養に修正可能でなければなりません。概念実証実験は、ハードサンゴハマからオレンジ色蛍光タンパク質（OFP）レポーター遺伝子（pporRFP）はCaMV35Sプロモーターの制御下で、31を ハマ使用して実行されます。

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プロトコル

懸濁細胞培養の1の確立

  1. 蒸留900 mlの4.43 gでLinsmaier＆スクーグ基本培地、スクロース30gを、200mgのKH 2 PO 4、及び2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）200μgのを添加することにより、BY-2培地液を調製水および0.1 M KOHで5.8にpHを。 pHを調整した後、蒸留水、オートクレーブで千ミリリットルへの最終的な音量を調整します。培地は4℃​​で2週間まで保存することができます。
  2. 1％を添加した培地BY-2 BY-2液を100mlの培地およびBY-2固体上に成長したBY-2カルス（>直径1cm）の一枚の媒体（液体250 mlの三角フラスコに接種寒天）とアルミニウム箔でシール。 5日間振とうしながら28から30℃で培養をインキュベートします。
    注：液体培養物は急速に過剰に増殖ますようBY-2カルスは、長期保存のための固体培地上で維持されます。培養容量は、典型的には、100mlの培養物は、30個の6-Wロード可能となり、必要に応じて調整することができますエルプレート。
  3. 転送2 BY-2培養新鮮BY-2メディアの98ミリリットルに対数期のミリリットル、振とうしながら28から30℃で5〜7日間インキュベートします。
    注：カルス100 5-7日齢の培養物の希釈物ではなく、接種：確立された液体培養物の継代培養は、定期的に1を用いて行うことができます。
  4. 細胞が急速に沈降するよう、徹底的に文化をミックスし、転送細胞培養の6ミリリットルを15ミリリットルコニカル遠心管に、細胞は、少なくとも10分間沈降させます。上清を除去することにより、全体積の50％まで充填細胞音量を調整します。
  5. 消化のための6ウェルプレートの各ウェルに500μlのを反転してピペットでチューブを振ります。彼らは密であるように、この段階で細胞を転送するために広い口径のピペットを使用し、標準的なピペットチップを詰まらせます。

2.プロトプラストの単離

  1. ロボットシステム（ 図1A）のすべてのコンポーネントをオンにして、ソフトスケジューリングプレートムーバタスクを開きますウェア。タスクスケジューリングプログラムは、各機器間のプレートの移動を可能にするために他の機器とマイクロムーバを統合します。
  2. 実験に先立ち、プロトコルで使用される技術的な実験機器の仕様（ 例えば 、プレート、蓋）を定義するだけでなく、次のように、プレートムーバソフトウェアで、実験器具の各部分のための開始位置と終了：
    1. プレートムーバソフトウェアのメインツールバーからセットアップをクリックし、[ 管理コンテナタイプ]コマンドを選択します。
    2. コンテナタイプが既存のコンテナタイプライブラリに記載されている場合は、適切なコンテナを選択します。
    3. コンテナタイプが既存のコンテナタイプライブラリに記載されていない場合、新しいコンテナ型を指定するには、[ 追加 ] をクリックします。
    4. 新しいコンテナ型を追加した後、適切なタブに新しいコンテナ（高さ、幅、寸法を積み重ね、グリッパオフセット）の寸法を挿入し、[ 保存 ] をクリックします。
      1. 正しい寸法はメーカーから利用できない場合は、正確にキャリパーを使用して、最も近いミリメートルまでのすべての寸法を決定。コンテナの寸法を測定する際のエラーは、プレート移動装置の故障の原因となります。
    5. 繰り返しは、プレート・ムーバーが遭遇するすべてのコンテナ型のための2.2.4.1を介して、2.2.2繰り返します。すべての実験器具のために、この工程の完了後、各容器（ステップ2.2.6）の開始と終了の位置を定義する必要があります。
      注：このプロトコルについて実験器具は6ウェルプレート、ディープウェルプレート、および96ウェル蛍光スクリーニングプレートを含んでいます。
    6. 各コンテナの開始と終了位置を定義するには、特定のプロトコルに開始/終了]タブをクリックします。まず、各コンテナの開始位置を選択します。次に、開始と終了位置の両方で蓋付き/ Unliddedためのチェックボックスをオンにします。すべてのコンテナのために繰り返します。
      注：コンテナは、EQUの別の部分に残される場合ipment（代わりにプレートムーバの）終了位置を空白のままにすることができます。
  3. この段階で手動で全体のワークフローの開始位置にすべてのプレートをロードします。ホテル3、プレートヒーター/冷却器巣2、及び50 mLコニカルに変換するために使用される96ディープウェルプレートにBY-2細胞を96ウェル蛍光ホテル2にスクリーニングプレート、6ウェルプレートにロードマルチモードディスペンサー上に酵素液を含むチューブ（ 補足ファイル 、第1.2.2項を参照してください）。
    1. 変換は、プロトコルで行わOFPレポーター構築物を含むウェルあたりプラスミドDNA（1μgの/μlの、260/280> 1.8）10μlのとプリロード96ディープウェルプレートとプレート上でインキュベートされる場合4℃でヒーター/チラー。各ウェルは、従って充填ウェルの数は、実験に依存し、単一の形質転換のために使用されます。
  4. 自動化上のすべての電源およびプレートをロード指定された場所にあるD液体処理プラットフォームとは、自動化制御ソフトウェア（ 図1B）の各項目の位置を定義します。
    1. MMGで40％PEG（0.4 Mマンニトール、100のMgCl 2、4mMのMES、pHは5.7）列1で、ヨウ化プロピジウム（PI、を1μg/ ml）を200μlの200μlのプリロード96ウェルプレートをロード列2、列3（巣2）中のエタノールを200μl、および巣8でのピペットチップのボックスに入力します。
    2. 、自動液体処理プラットフォームのソフトウェアで実験器具の位置を定義メニューから[ ツールや実験器具エディタをクリックします。
    3. プルダウンメニューから、実験器具の種類を選択するか、 新しい実験器具のボタンを使用して、新しい実験器具タイプを定義します。
    4. 主なプロトコル]タブを選択し、Configure実験器具をクリックして選択実験器具の各部分の位置を定義します。自動液体処理プラットフォーム上に配置された実験器具の各部分であることを確認してくださいプロトコルを実行する前に定義されています。
    5. 自動化されたプロトコルをトリガするには、プロファイル・エクスプローラウィンドウをクリックして、実行するプロトコル（ プロトプラストの単離 、 セル数 、およびPEG媒介形質転換 ）の名前を選択します。
    6. プロトコルで使用されるすべてのデバイスを初期化するために、[ 実行 ] をクリックします。
    7. 最後に、ワークエクスプローラウィンドウで、システム内のすべてのコンテナ/実験器具を確認し、自動化されたプロトコルを開始するために作業ユニットを追加 ] をクリックします。
      注：自動化されたプロトコルの完全な説明は補足ファイルに含まれています。

3.細胞数の標準曲線を確立

  1. 手動で1 mlの容量で、1×10 6プロトプラスト/ mlの濃度でプロトプラストを濃縮します。遠心分離機は10分1,000×gでプロトプラスト、上清を除去します。
  2. 手動プロトプラストペレットに（4℃で維持）の70％エタノール900μlを添加しますそしてペレットを再懸濁します。細胞を固定するために、氷上で10分間インキュベートします。
  3. 核を標識し、プレートリーダーによる検出を可能にするために、プロトプラストにPI（1μg/ ml）の100μlのを追加します。
  4. 負荷BY-2液の80μlを96ウェル蛍光スクリーニングプレートの各列と行にメディアが2列で始まります。
  5. 96ウェル蛍光スクリーニングプレートの列1で、列に各ウェルにBY-2メディアプロトプラスト70μlの50μlを添加します。
  6. 自動液体処理プラットフォームの巣6に板を置き、2倍連続希釈を実行します。
    1. 自動液体処理プラットフォーム上で連続希釈を行うために、 シリアル希釈ウィザードを起動し、転送量（60μl）を調整し、ミックスとボリューム（2、70μl）を、最初のウェル（カラム1、行AF）の数、希釈クリックウェル（列2-11、行AF）、および吸引及び分配する性質（ウェル底から0.5ミリメートル）。
    2. パラメータを設定した後、保存プロトコルを実行しますdは。
      注：すべてのプロトプラスト（細胞の固定化のために）PIで標識されているので、蛍光がプロトプラストの濃度に比例します。
    3. 連続希釈が完了した後、ネスト9からプレートを取り外し、プレートリーダーに挿入し、プレートリーダーソフトウェアの標準曲線プロトコルを実行します。
      注：標準曲線は、既知のプロトプラストの濃度で各ウェルにPI（励起536 nmの/発光620 nm）での蛍光を比較することによって生成されます。
  7. プレートリーダープロトコルが完了すると、プレートを取り外し、オートクレーブまたは「バイオセーフティプロトコルで定義されている他の脱活性化の手順については、任意のトランスジェニック細胞を収集します。

変革の4顕微鏡分析

  1. ロボットシステムのホテル1から形質転換されたプロトプラスト（自動プロトコル3、 補足ファイルの製品）でプレートを取り外します。
  2. 順番倒立顕微鏡、カメラ、および蛍光灯に。
  3. プロトプラストに焦点を当てた初期のための10倍の対物レンズを選択し、ハロゲンランプをオンにし、蛍光ランプ用のシャッターを閉じます。
  4. 明を使用してプロトプラストに微細システムとフォーカス上にロードプレート。
  5. プロトプラストに焦点を当てた後、ハロゲン電球をオフにして、蛍光灯のためのシャッターを開きます。
  6. トランスジェニックプロトプラストによって発現pporRFPタンパク質の可視化のために設定CY3 / TRITCフィルターを選択します。
  7. pporRFP蛍光マーカーを発現するプロトプラストの数を決定するために、各ウェルをスキャンします。
  8. 蛍光マーカーをプロトプラストの合計数を表すプロトプラストの総数として、形質転換効率を計算します。
  9. オートクレーブ処理または「バイオセーフティプロトコルで定義されている他の脱活性化の手順については、承認されたバイオセーフティバッグでトランスジェニック細胞を含む任意のプレートを収集します。

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結果

現在の研究では、BY-2の倍加速度は、培養物は、15時間の平均細胞周期の長さの以前の報告と一致して培養したときの温度に依存して14から18時間から変化しました。この倍加速度で、1：100の出発接種材料は5-7日で50％のパック細胞容積（PCV）での文化につながる、培養を開始するために使用されました。培養物を培地200mlに成長された現在のプロトコルでは、100mlとPCV 3...

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ディスカッション

上記のプロトコルが正常BY-2タバコ懸濁細胞培養を用いてプロトプラスト単離、列挙、および形質転換のために検証されています。しかしながら、このプロトコルは容易に任意の植物懸濁培養に拡張することができます。現時点では、プロトプラストの分離および形質転換は、トウモロコシ（ トウモロコシ ）10、ニンジン（ ニンジン属のcarota）32、ポプラ（ ?...

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開示事項

著者は、彼らが競合する経済的利害関係を持っていないことを宣言します。

謝辞

This research was supported by Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Orbitor RS Microplate moverThermo Scientific
Bravo Liquid HandlerAgilent
Synergy H1 Multi-mode ReaderBioTek
MultiFlo FX Multi-mode DispenserBioTek
TeleshakeInheco3800048
CPAC Ultraflat Heater/coolerInheco7000190
Vworks Automation SoftwareAgilentSoftware used to control and write protocols for Agilent Bravo
Momentum SoftwareThermo ScientificTask scheduling software for controlling Orbiter RS
Liquid Handling Control 2.17 SoftwareBiotekSoftware used to control and write protocols for MultiFlo FX
IX81 Inverted MicroscopeOlympus
Zyla 3-Tap microscope cameraAndor
ET-CY3/TRITC Filter SetChroma Technology Corp49004
Rohament CLAB Enzymessample bottlelow-cost cellulase
Rohapect UFAB Enzymessample bottlelow-cost pectinase
Rohapect 10LAB Enzymessample bottlelow-cost pectinase/arabinase
Linsmaier & Skoog Basal MediumPhytotechnology LaboratoriesL689
2,4-dichlorophenoxyacetic acidPhytotechnology LaboratoriesD295
propidium iodideSigma AldrichP4170
Poly(ethylene glycol) 4000Sigma Aldrich95904-250G-FFormerly Fluka PEG
Propidium IodideFisher Scientific25535-16-4Acros Organics
CaCl2Sigma AldrichC7902-1KG
Sodium AcetateFisher ScientificBP333-500
MannitolSigma AldrichM1902-1KG
SucroseFisher ScientificS5-3
KH2PO4Fisher ScientificAC424205000
KOHSigma AldrichP1767
Gelzan CMSigma AldrichG1910-250G
6-well plateThermo Scientific103184
96-well 1.2 ml deep well plateThermo ScientificAB-0564
96 well optical bottom plateThermo Scientific165305
Finntip 1000 Wide bore Pipet tipsThermo Scientific9405 163
NaClFisher ScientificBP358-10
KClSigma AldrichP4504-1KG
MESFisher ScientificAC17259-5000
MgCl2Fisher ScientificM33-500

参考文献

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