JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Методология с высокой пропускной способностью, автоматизированное, табачных протопластов производство и преобразование описано. Роботизированная система позволяет массово-параллельной экспрессии генов и открытие в модельной системе BY-2, которая должна быть переводимым не-модельных культур.

Аннотация

За последнее десятилетие наблюдается всплеск в использовании растительных протопластов, которые варьируются от модельных видов подрезать видов, для анализа путей передачи сигнала, транскрипционных регуляторных сетей, экспрессии генов, генома редактирования и гена-глушителей. Кроме того, значительный прогресс был достигнут в регенерации растений из протопластов, породившей еще больший интерес к использованию этих систем для растений геномики. В этой работе, протокол был разработан для автоматизации изоляции протопластов и трансформации из «Ярко-желтый '2 (BY-2) табака суспензионной культуры с использованием роботизированной платформы. Процедуры трансформации были подтверждены с использованием оранжевый флуоресцентный белок (ОФП) ген-репортер (pporRFP) под контролем промотора вируса мозаики цветной капусты 35S (35S). ОФП выражение в протопласты было подтверждено эпифлуоресцентной микроскопии. Анализы также включены протопластов методы эффективности производства с использованием propidiuм йодистый. И, наконец, недорогие ферменты пищевые были использованы для процедуры выделения протопластов, обходя необходимость лабораторного класса ферментов, которые непомерно в высокой пропускной способности автоматизированной изоляции и анализа протопластов. На основании протокола, разработанного в данной работе, полная процедура от выделения протопластов к трансформации может быть проведена в соответствии с 4 ч, без какого-либо вмешательства оператора. В то время как протокол, разработанный в данной работе была подтверждена с клеточной культурой BY-2, процедуры и методы должны быть переводимым к любой подвески растений культуры / протопластов системы, которая должна позволить ускорению исследований в области геномики культур.

Введение

В последние годы наблюдается значительный импульс уделяется разработке трансгенных культур для преодоления различных заболеваний 1, наделяют устойчивость к гербицидам 2, придают засуху 3,4 и солеустойчивости 5, предотвратить herbivory 6, увеличить выход биомассы 7, и уменьшение клеточной стенки упрямство 8. Эта тенденция способствовала развитию новых молекулярных инструментов для создания трансгенных растений, в том числе генома редактирования с использованием CRISPR и Таленс 9 и молчанием генов через дсРНК 10, микроРНК 11 и миРНК 12. Несмотря на то, что эти технологии упростили поколение трансгенных растений, они также создали узкое место, где огромное количество трансгенных растений, генерируемый не могут быть подвергнуты скринингу с использованием традиционных систем, которые полагаются на регенерации растений. В связи с этим узким местом, в то время как глушителей и геном-редактирования конструкции могут быть быстро вставлены в растения, многие изцелевые черты не производят желаемого эффекта, который часто не обнаружен, пока растения не анализируются в теплице. В этой работе, мы разработали метод для быстрого, автоматизированного, высокопроизводительного скрининга растительных протопластов, специально для решения текущего узкого места в начале скрининга большого количества генома-редактирования и молчанием генов мишеней.

Использование протопластов, в отличие от интактных клеток растений, имеет ряд преимуществ для разработки автоматизированной платформы. Во- первых, Протопласты были выделены после переваривания клеточной стенки растений, и с этим барьером больше нет, эффективность преобразования повышается 13. В интактных клетках растений существуют только два хорошо известных методов трансформации, биолистики 14 и Agrobacterium опосредованной трансформации 15. Ни один из этих методов могут быть легко переведены на жидких погрузочно-платформ, так как биолистики требует специального оборудования для Трансформатория, в то время как Agrobacterium -опосредованного преобразование требует совместной культуре и последующее удаление бактерий. Ни один не поддаются для высоких методов пропускной способности. В случае протопластов, преобразование обычно проводят с использованием полиэтиленгликоля (PEG) -опосредованного трансфекцию 16, которая требует только несколько обменов решения, и идеально подходит для жидких обработки платформ. Во-вторых, протопласты, по определению, являются одноклеточные культуры, и, таким образом, проблемы, связанные с слипания и цепи формирования в растительных клеточных культурах, не наблюдаются в протопласты. С точки зрения быстрого скрининга с использованием планшетов на основе спектрофотометра, слипание клеток, или клетки в нескольких плоскостях, приведет к трудности в получении устойчивых результатов измерений. Так как протопласты также более плотной, чем их культуральных сред, они оседают на дно лунок, образуя монослой, которая благоприятна для плиты на основе спектрофотометрии. И, наконец, в то время как клетки растения суспензионные культуры являются примарILY полученный из каллуса 17, протопласты могут быть собраны из ряда тканей растений, что приводит к возможности идентификации экспрессии тканеспецифической. Например, возможность анализа или листа: корневой-специфическую экспрессию гена, может быть очень важным для прогнозирования фенотипа. По этим причинам, протоколы , разработанные в этой работе были проверены с использованием протопластов , выделенных из широко используемых табака (Nicotiana аЬасит L.) 'Ярко - желтый' 2 (BY-2) суспензионную культуру.

Побочный 2 суспензионной культуры была описана как "HeLa" клетки высших растений, из - за его повсеместной использования в молекулярном анализе растительных клеток 18. В последнее время BY-2 клетки были использованы для изучения влияния основных стрессоров 19-22, локализация внутриклеточный белок 23,24, и основной клеточной биологии 25-27 демонстрируют широкой полезности этих культур в биологии растений. Дополнительное преимущество × 2 культур являетсявозможность синхронизации культур с aphidicolin, что может привести к повышению воспроизводимости для экспрессии гена исследования 28. Кроме того, были разработаны методы для извлечения BY-2 протопласты с использованием недорогих ферментов 29,30, так как ферменты , традиционно используемые для формирования протопластов являются экономически запретительной для систем с высокой пропускной способностью . Таким образом, протокол, описанный ниже, была проверена с использованием суспензионного культуры BY-2, но оно должно быть исправимо к любой клеточной суспензии растений культуры. Доказательство концептуальных экспериментов проводили с использованием оранжевого флуоресцентного белка (ОФП) ген - репортер (pporRFP) из твердых кораллов Porites Porites 31 под контролем промотора CaMV 35S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Создание суспензионных клеточных культур

  1. Готовят жидкость × 2 сред путем добавления 4,43 г Linsmaier & Скоог основных сред, 30 г сахарозы, 200 мг KH 2 PO 4, и 200 мкг 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-D) до 900 мл дистиллированной воды и рН до 5,8 с помощью 0,1 М КОН. После доведения рН, регулировать конечный объем до 1000 мл дистиллированной водой и автоклаве. Средства массовой информации могут храниться до 2-х недель при 4 ° С.
  2. Привить колбу 250 мл Эрленмейера с 100 мл жидкости-2 СМИ и одного куска BY-2 каллуса (> 1 см в диаметре), выращенных на твердом теле-2 сред (жидкости-2 средах с добавлением 1% агар) и печать с алюминиевой фольгой. Инкубируйте культуру при 28-30 ° С при встряхивании в течение 5 дней.
    Примечание: BY-2 каллус поддерживается на твердых средах для длительного хранения, так как жидкие культуры будут быстро зарастают. Объем культуры может быть отрегулировано по мере необходимости, как правило, 100 мл культуры будет способен загружать тридцать три 6-WELL пластины.
  3. Передача 2 мл лог-фазы BY-2 культуры до 98 мл свежей среды, BY-2 и инкубировать в течение 5-7 дней при температуре 28-30 ° С при встряхивании.
    Примечание: Под-Культивирование установленных жидких культур может осуществляться регулярно с использованием 1: 100 разбавлени 5-7-дневных культур, а не инокуляции каллуса.
  4. Смешайте культуру тщательно, как и клетки быстро оседают, и передача 6 мл клеточной культуры в 15 мл коническую центрифужную пробирку снизу, и пусть клетки оседать в течение не менее 10 мин. Отрегулировать гематокрита до 50% от общего объема удалением надосадочной жидкости.
  5. Взболтать трубку, перевернув и пипетка 500 мкл в каждую лунку 6-луночного планшета для пищеварения. Использование широким отверстием пипетки для переноса клеток на этой стадии, поскольку они плотны и закупоривать стандартные советы пипеткой.

2. Выделение протопластов

  1. Включите все компоненты роботизированной системы (рис 1А) и откройте задачу пластины первопроходца планирования мягкойпосуда. Программа планирования задач интегрирует микропланшетов движитель с другим оборудованием, чтобы включить передачу пластин между каждой единицы оборудования.
  2. До начала эксперимента, определить технические спецификации для лабораторного оборудования (например, плиты, крышки) , используемые в протоколе, а также начальные и конечные позиции для каждой части лабораторного оборудования, в программном обеспечении пластины первопроходца, следующим образом :
    1. Выберите пункт Настройка главной панели инструментов в программном обеспечении пластины первопроходца и выберите контейнер команды управления типами.
    2. Если тип контейнера указан в существующей библиотеке контейнерного типа, затем выберите соответствующий контейнер.
    3. Если тип контейнера не указан в существующей библиотеке контейнерного типа затем нажмите кнопку Добавить , чтобы указать новый тип контейнера.
    4. После добавления нового контейнерного типа, вставьте размеры нового контейнера (высота, ширина, укладывая размеры и грейфером Offset) в соответствующие вкладки и нажмите кнопку Сохранить.
      1. Если правильные размеры не доступны от производителя, а затем точно определить все размеры с точностью до миллиметра с помощью штангенциркуля. Ошибки при измерении размеров контейнера приведет к выходу из строя пластины движителя.
    5. Повторите шаги 2.2.2 через 2.2.4.1 для всех типов контейнеров, что пластина движитель будет столкнуться. После завершения этого шага для всех лабораторного оборудования, необходимо определить начальную и конечную место для каждого контейнера (этап 2.2.6).
      Примечание: Для этого протокола лабораторного оборудования включает в себя 6-луночного планшета, глубоководный луночного планшета, а также 96-луночного флуоресцентного скрининга пластины.
    6. Для того, чтобы определить начальную и конечную позицию каждого контейнера, щелкните вкладку Start / End в определенном протоколе. Во-первых, выбрать начальное положение каждого контейнера. Далее, установите флажок / Unlidded закрывают крышкой как на начальной и конечной позиции. Повторите эти действия для всех контейнеров.
      Примечание: Если контейнер будет оставлен на другой части фасчь (вместо пластины движителя) конец местоположение может быть оставлено пустым.
  3. На этом этапе вручную загрузить все пластины в исходное положение в течение всего рабочего процесса. Загрузить 96-луночного флуоресцентных экранирующих пластин в отеле 2, 6-луночные планшеты с BY-2 клеток в Hotel 3, 96-артезианской пластину, которая будет использоваться для преобразования на пластины нагревателя / чиллера гнезда 2 и 50 мл коническую пробирку , содержащую раствор фермента (см Дополнительный файл, раздел 1.2.2) на многорежимный дозаторе.
    1. Если преобразование будет осуществляться в протоколе, предзагрузить 96 артезианской пластинку с 10 мкл ДНК плазмиды на лунку (1 мкг / мкл, А 260/280> 1,8) , содержащий репортерной конструкции OFP и инкубировать на пластине нагреватель / охладитель при температуре 4 ° С. Каждая скважина будет использоваться для одного преобразования, таким образом, число скважин, заполненных будет зависеть от экспериментальной установки.
  4. Загрузите все расходные материалы и плиты на Automated жидкости платформы обработки в специально отведенных местах и определить положение каждого элемента автоматизации управления программным обеспечением (Рисунок 1В).
    1. Загрузка 96-луночный планшет предварительно загружено с 200 мкл 40% ПЭГ в ММГ (0,4 М маннитола, 100 мМ MgCl 2, 4 мМ MES, рН 5,7) в колонке 1, 200 мкл пропидийиодидом (PI, 1 мкг / мл) в колонке 2, и 200 мкл этанола в колонке 3 (гнездо 2), и коробку пипеток в гнезде 8.
    2. Для того, чтобы определить местоположение лабораторного оборудования в программном обеспечении автоматической обработки платформы Ликвида, выберите Сервис в меню и выберите Редактор Лабораторное оборудование.
    3. Выберите тип лабораторного оборудования из выпадающего меню или определить новый тип , используя лабораторное кнопку New Лабораторное оборудование.
    4. Определить положение каждого элемента , выбранного лабораторного оборудования, выбрав вкладку Main Protocol и нажать кнопку Настроить Лабораторное оборудование. Убедитесь в том, что каждая часть лабораторного оборудования размещена на платформе автоматизированной обработки жидкостиопределены перед запуском протокола.
    5. Для запуска автоматизированных протоколов, щелкните окно проводника профиля и выберите имя протокола , который будет запускать (выделения протопластов, Cell Count и ПЭГ-опосредованной трансформации).
    6. Нажмите кнопку Выполнить , чтобы инициализировать все устройства , которые будут использоваться в протоколе.
    7. Наконец, в окне Проводника работы, нажмите кнопку Add Work Unit для проверки всех контейнеров / лабораторного оборудования в системе и начать автоматизированный протокол.
      Примечание: Полное описание автоматизированных протоколов содержатся в Дополнительной File.

3. Установите стандартную кривую для Цитоз

  1. Вручную концентрировать протопластов при концентрации 1 × 10 6 протопластов / мл в объеме 1 мл. Центрифуга протопластов при 1000 х г в течение 10 мин, и удаления надосадочной жидкости.
  2. Вручную добавьте 900 мкл 70% этанола (поддерживаемую при 4 ° С) до протопластов гранулыи повторно приостанавливать осадок. Инкубировать в течение 10 мин на льду, чтобы зафиксировать клетки.
  3. Добавьте 100 мкл PI (1 мкг / мл) в протопласты для обозначения ядра и позволяют обнаружить с помощью ридера.
  4. Нагрузка 80 мкл жидкости × 2 носитель в каждом столбце и строке 96-луночного флуоресцентного скрининга пластины, начиная с колонки 2.
  5. В колонке 1 в 96-луночные флуоресцентного скрининга пластины, добавить 70 мкл протопластов и 50 мкл × 2 сред в каждую лунку в колонке.
  6. Место пластины в гнезде 6 автоматизированной платформы и транспортировки жидкости, и запустить 2-кратное серийное разведение.
    1. Провести серийное разведение на автоматизированную платформу обработки жидкости, нажмите кнопку Запустить мастер последовательного разбавления и регулировки громкости передачи (60 мкл), количество смесей и объема (2, 70 мкл), начальные лунки (колонка 1, строки AF), разведение колодцы (Столбцы 2-11, Ряды AF), а также диспенсирующих и отсасывающих свойства (0,5 мм от скважины снизу).
    2. После настройки параметров, сохранитеd запустить протокол.
      Примечание: Так как все протопласты помечены PI (из-за фиксации клеток), флуоресценция пропорциональна концентрации протопластов.
    3. После того, как последовательное разведение завершено, удалить пластину из гнезда 9 и вставить в планшет-ридере и запустить стандартный протокол кривой в программном обеспечении планшет-ридер.
      Примечание: Стандартная кривая будет генерироваться путем сравнения флуоресценции от PI (возбуждение 536 нм / эмиссии 620 нм) в каждой лунке с известной концентрацией протопластов.
  7. После завершения протокола для считывания планшетов, удалить пластину и собирают трансгенной клетки для автоклавирования или других процедур, де-витализации, как это определено в протоколах биологической безопасности.

4. Микроскопический анализ трансформации

  1. Удалить пластину с трансформированных протопластов (продукт Automated протокола 3 Справочная файлов) из Hotel 1 роботизированной системы.
  2. Очередьна инвертированный микроскоп, фотоаппарат, и люминесцентной лампой.
  3. Выберите цель 10X для первоначального упором на протопластов, включите галогенной лампы, и закройте затвор для люминесцентной лампы.
  4. Нагрузка на пластины микроскопической системы и сосредоточиться на протопласты с использованием светлого.
  5. После фокусировки на протопластов, выключите галогенную лампу и открыть затвор для люминесцентной лампы.
  6. Выберите Cy3 / TRITC набор фильтров для визуализации белка pporRFP, выраженное трансгенных протопластов.
  7. Сканирование в каждую лунку, чтобы определить количество протопластов, выражающий pporRFP флуоресцентный маркер.
  8. Расчет эффективности преобразования как общее число протопластов, выражающее флуоресцентный маркер общее количество протопластов.
  9. Соберите все пластины, содержащие трансгенные клетки в утвержденных мешки для автоклавирования биобезопасности или других процедур де-витализации, как это определено в протоколах биобезопасности.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В текущем исследовании, удвоение скорости BY-2 изменялась от 14-18 ч в зависимости от температуры, при которой инкубировались культуры, в соответствии с предыдущими сообщениями о средней продолжительности клеточного цикла 15 ч. При этом скорость удвоения, 1: 100, начиная при?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Протокол, описанный выше, был успешно проверен для выделения протопластов, перечисления и трансформации с использованием табака культуры суспензии клеток BY-2; Тем не менее, протокол может быть легко расширена на любое растение подвески культуры. В настоящее время протопластов выделен?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

This research was supported by Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Orbitor RS Microplate moverThermo Scientific
Bravo Liquid HandlerAgilent
Synergy H1 Multi-mode ReaderBioTek
MultiFlo FX Multi-mode DispenserBioTek
TeleshakeInheco3800048
CPAC Ultraflat Heater/coolerInheco7000190
Vworks Automation SoftwareAgilentSoftware used to control and write protocols for Agilent Bravo
Momentum SoftwareThermo ScientificTask scheduling software for controlling Orbiter RS
Liquid Handling Control 2.17 SoftwareBiotekSoftware used to control and write protocols for MultiFlo FX
IX81 Inverted MicroscopeOlympus
Zyla 3-Tap microscope cameraAndor
ET-CY3/TRITC Filter SetChroma Technology Corp49004
Rohament CLAB Enzymessample bottlelow-cost cellulase
Rohapect UFAB Enzymessample bottlelow-cost pectinase
Rohapect 10LAB Enzymessample bottlelow-cost pectinase/arabinase
Linsmaier & Skoog Basal MediumPhytotechnology LaboratoriesL689
2,4-dichlorophenoxyacetic acidPhytotechnology LaboratoriesD295
propidium iodideSigma AldrichP4170
Poly(ethylene glycol) 4000Sigma Aldrich95904-250G-FFormerly Fluka PEG
Propidium IodideFisher Scientific25535-16-4Acros Organics
CaCl2Sigma AldrichC7902-1KG
Sodium AcetateFisher ScientificBP333-500
MannitolSigma AldrichM1902-1KG
SucroseFisher ScientificS5-3
KH2PO4Fisher ScientificAC424205000
KOHSigma AldrichP1767
Gelzan CMSigma AldrichG1910-250G
6-well plateThermo Scientific103184
96-well 1.2 ml deep well plateThermo ScientificAB-0564
96 well optical bottom plateThermo Scientific165305
Finntip 1000 Wide bore Pipet tipsThermo Scientific9405 163
NaClFisher ScientificBP358-10
KClSigma AldrichP4504-1KG
MESFisher ScientificAC17259-5000
MgCl2Fisher ScientificM33-500

Ссылки

  1. Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops. Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).
  2. Duke, S. O. Perspectives on transgenic, herbicide-resistant crops in the United States almost 20 years after introduction. Pest Manag. Sci. 71 (5), 652-657 (2015).
  3. Mir, R., Zaman-Allah, M., Sreenivasulu, N., Trethowan, R., Varshney, R. Integrated genomics, physiology and breeding approaches for improving drought tolerance in crops. Theor. Appl. Genet. 125 (4), 625-645 (2012).
  4. Hu, H., Xiong, L. Genetic engineering and breeding of drought-resistant crops. Annu. Rev. Plant Bio. 65, 715-741 (2014).
  5. Marco, F., et al. Plant Biology and Biotechnology. , Springer. 579-609 (2015).
  6. Edgerton, M. D., et al. Transgenic insect resistance traits increase corn yield and yield stability. Nat. Biotechnol. 30 (6), 493-496 (2012).
  7. Vanhercke, T., et al. Metabolic engineering of biomass for high energy density: oilseed-like triacylglycerol yields from plant leaves. Plant Biotech. J. 12 (2), 231-239 (2014).
  8. Baxter, H. L., et al. Two-year field analysis of reduced recalcitrance transgenic switchgrass. Plant Biotech. J. 12 (7), 914-924 (2014).
  9. Xing, H. L., et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. 14 (1), 327(2014).
  10. Cao, J., Yao, D., Lin, F., Jiang, M. PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize. Acta Physio. Plant. 36 (5), 1271-1281 (2014).
  11. Martinho, C., et al. Dissection of miRNA pathways using Arabidopsis mesophyll protoplasts. Mol. Plant. 8 (2), 261-275 (2015).
  12. Bart, R., Chern, M., Park, C. J., Bartley, L., Ronald, P. C. A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts. Plant Methods. 2 (1), 13(2006).
  13. Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -L. Protoplasts: a useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation. Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).
  14. Martin-Ortigosa, S., Valenstein, J. S., Lin, V. S. Y., Trewyn, B. G., Wang, K. Nanotechnology meets plant sciences: Gold functionalized mesoporous silica nanoparticle mediated protein and DNA codelivery to plant cells via the biolistic method. Adv. Funct. Mater. 22 (17), 3529-3529 (2012).
  15. Křenek, P., et al. Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles, methods and applications. Biotechnol. Adv. , (2015).
  16. Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  17. Mustafa, N. R., de Winter, W., van Iren, F., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nat. Protoc. 6 (6), 715-742 (2011).
  18. Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 cell line as the "HeLa" cell in the cell biology of higher plants. Int. Rev. Cytol. 132 (1), 1-30 (1992).
  19. Centomani, I., et al. Involvement of DNA methylation in the control of cell growth during heat stress in tobacco BY-2 cells. Protoplasma. , 1-9 (2015).
  20. Sgobba, A., et al. Cyclic AMP deficiency stimulates a stress condition in tobacco BY-2 cells. BioTechnologia. 94 (2), (2013).
  21. Väisänen, E. E., et al. Coniferyl alcohol hinders the growth of tobacco BY-2 cells and Nicotiana benthamiana seedlings. Planta. 242 (3), 747-760 (2015).
  22. Ortiz-Espìn, A., et al. Over-expression of Trxo1 increases the viability of tobacco BY-2 cells under H2O2 treatment. Ann. Botany. 116 (4), 571-582 (2015).
  23. Ito, Y., et al. cis-Golgi proteins accumulate near the ER exit sites and act as the scaffold for Golgi regeneration after brefeldin A treatment in tobacco BY-2 cells. Mol. Bio. Cell. 23 (16), 3203-3214 (2012).
  24. Madison, S. L., Nebenführ, A. Live-cell imaging of dual-labeled Golgi stacks in tobacco BY-2 cells reveals similar behaviors for different cisternae during movement and brefeldin A treatment. Mol. Plant. 4 (5), 896-908 (2011).
  25. de Pinto, M. C., et al. S-nitrosylation of ascorbate peroxidase is part of programmed cell death signaling in tobacco Bright Yellow-2 cells. Plant Physiol. 163 (4), 1766-1775 (2013).
  26. Hanamata, S., et al. In vivo imaging and quantitative monitoring of autophagic flux in tobacco BY-2 cells. Plant Signa. Behav. 8 (1), 22510(2013).
  27. Sakai, A., Takusagawa, M., Nio, A., Sawai, Y. Cytological Studies on proliferation, differentiation, and death of BY-2 cultured tobacco cells. Cytologia. 80 (2), 133-141 (2015).
  28. Yasuhara, H., Kitamoto, K. Aphidicolin-induced nuclear elongation in tobacco BY-2 cells. Plant Cell Physiol. 55 (5), 913-927 (2014).
  29. Buntru, M., Vogel, S., Stoff, K., Spiegel, H., Schillberg, S. A versatile coupled cell-free transcription-translation system based on tobacco BY-2 cell lysates. Biotechnol. Bioeng. 112 (5), 867-878 (2015).
  30. Buntru, M., Vogel, S., Spiegel, H., Schillberg, S. Tobacco BY-2 cell-free lysate: an alternative and highly-productive plant-based in vitro translation system. BMC Biotechnol. 14 (1), 37(2014).
  31. Alieva, N. O., et al. Diversity and evolution of coral fluorescent proteins. PLoS ONE. 3 (7), 2680(2008).
  32. Maćkowska, K., Jarosz, A., Grzebelus, E. Plant regeneration from leaf-derived protoplasts within the Daucus genus: effect of different conditions in alginate embedding and phytosulfokine application. Plant Cell Tiss. Org. 117 (2), 241-252 (2014).
  33. Guo, Y., Song, X., Zhao, S., Lv, J., Lu, M. A transient gene expression system in Populus euphratica Oliv. protoplasts prepared from suspension cultured cells. Acta Physio. Plant. 37 (8), 1-8 (2015).
  34. Wang, H., Wang, W., Zhan, J., Huang, W., Xu, H. An efficient PEG-mediated transient gene expression system in grape protoplasts and its application in subcellular localization studies of flavonoids biosynthesis enzymes. Sci. Hort. 191, 82-89 (2015).
  35. Masani, M. Y. A., Noll, G. A., Parveez, G. K. A., Sambanthamurthi, R., Pruefer, D. Efficient transformation of oil palm protoplasts by PEG-mediated transfection and DNA microinjection. PLoS One. 9 (5), 96831(2014).
  36. Sasamoto, H., Ashihara, H. Effect of nicotinic acid, nicotinamide and trigonelline on the proliferation of lettuce cells derived from protoplasts. Phytochem. Lett. 7, 38-41 (2014).
  37. Uddin, M. J., Robin, A. H. K., Raffiand, S., Afrin, S. Somatic embryo formation from co-cultivated protoplasts of Brassica rapa & B. juncea. Am. J. Exp. Ag. 8 (6), 342-349 (2015).
  38. Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
  39. Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Stewart, C. N. Protoplast isolation and transient gene expression in switchgrass, Panicum virgatum L. Biotechnol. J. 3 (3), 354-359 (2008).
  40. Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Joyce, B. L., Stewart, C. N. Switchgrass (Panicum virgatum L.) cell suspension cultures: Establishment, characterization, and application. Plant Sci. 181 (6), 712-715 (2011).
  41. Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Rep. 21 (9), 865-871 (2003).
  42. Di Sansebastiano, G. P., Paris, N., Marc-Martin, S., Neuhaus, J. M. Specific accumulation of GFP in a non-acididc vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. 15 (4), 449-457 (1998).
  43. De Sutter, V., et al. Exploration of jasmonate signalling via automated and standardized transient expression assays in tobacco cells. Plant J. 44 (6), 1065-1076 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

115

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены