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Résumé

Une méthode à haut débit automatisée, la production de tabac en protoplastes et la transformation est décrite. Le système robotisé permet l'expression du gène massivement parallèle et de découverte dans le système modèle BY-2 qui devrait être traduisible aux cultures non-modèle.

Résumé

Au cours de la dernière décennie, il y a eu une résurgence de l'utilisation des protoplastes végétaux qui vont des espèces modèles pour recadrer les espèces, pour l'analyse des voies de signalisation de la transduction, les réseaux de régulation transcriptionnelle, l'expression des gènes, génome d'édition, et la neutralisation des gènes. En outre, des progrès significatifs ont été réalisés dans la régénération des plantes à partir de protoplastes, qui a généré encore plus d'intérêt dans l'utilisation de ces systèmes pour la génomique végétale. Dans ce travail, un protocole a été mis au point pour l'automatisation de l'isolement de protoplastes et la transformation de 2 (PAR-2) la culture du tabac en suspension un «Bright Yellow» en utilisant une plate-forme robotique. Les procédures de transformation ont été validés à l'aide d'une protéine fluorescente orange (OFP) gène rapporteur (pporRFP) sous le contrôle du promoteur de chou-virus de la mosaïque 35S (35S). OFP expression dans des protoplastes a été confirmée par microscopie à épifluorescence. Les analyses comprenaient également des méthodes d'efficacité de production protoplastes utilisant propidium iodure. Enfin, les enzymes de qualité alimentaire à faible coût ont été utilisés pour la procédure d'isolement de protoplastes, de contourner la nécessité d'enzymes de laboratoire de qualité qui sont un coût prohibitif en haut débit automatisé isolement et l'analyse protoplastes. Basé sur le protocole mis au point dans ce travail, la procédure complète de l'isolement de protoplastes à la transformation peut être réalisée en moins de 4 heures, sans aucune intervention de l'opérateur. Alors que le protocole mis au point dans ce travail a été validé avec la culture cellulaire BY-2, les procédures et les méthodes doivent être traduisible à tout système de culture en suspension végétale / protoplastes, ce qui devrait permettre une accélération de la recherche en génomique des cultures.

Introduction

Ces dernières années , il y a eu une impulsion significative placé sur la conception des cultures transgéniques pour surmonter diverses maladies 1, conférer une résistance aux herbicides 2, confère la sécheresse 3,4 et la tolérance au sel 5, prévenir herbivory 6, augmenter le rendement de la biomasse 7, et de diminuer la paroi cellulaire récalcitrante 8. Cette tendance a été favorisée par le développement de nouveaux outils moléculaires pour générer des plantes transgéniques, y compris le génome d'édition en utilisant CRISPR et TALENs 9 et silençage génique par ARNdb 10, miRNA 11 et siRNA 12. Bien que ces technologies ont simplifié la génération de plantes transgéniques, ils ont également créé un goulot d'étranglement, où le grand nombre de plantes transgéniques générées ne peuvent pas être criblée en utilisant les systèmes traditionnels qui reposent sur la régénération des plantes. Associés à ce goulot d'étranglement, tout en réduisant au silence et génome édition constructions peuvent être insérés rapidement dans les plantes, un grand nombre detraits ciblés ne parviennent pas à produire l'effet désiré, qui est souvent découverte que les plantes sont analysées dans la serre. Dans ce travail, nous avons développé une méthode pour rapide automatisée, le dépistage, à haut débit de protoplastes végétaux, en particulier pour résoudre le goulot d'étranglement dans le dépistage précoce d'un grand nombre de génomes d'édition et le gène silencieux cibles.

L'utilisation de protoplastes, par opposition à des cellules végétales intactes, présente plusieurs avantages pour le développement d'une plateforme automatisée. Tout d' abord, les protoplastes sont isolés après digestion de la paroi cellulaire de la plante, et cette barrière ne présentent plus, l' efficacité de transformation 13 est augmentée. Dans les cellules végétales intactes il y a seulement deux méthodes bien établies pour la transformation, biolistique 14 et Agrobacterium transformation médiée 15. Aucune de ces méthodes peuvent être facilement convertis aux plates-formes de manipulation de liquides, comme biolistique nécessite un équipement spécialisé pour transformation, alors que Agrobacterium transformation médiée nécessite co-culture et l' élimination ultérieure des bactéries. Ni se prêtent à des procédés à haut débit. Dans le cas de protoplastes, la transformation est habituellement effectuée en utilisant le polyéthylène glycol (PEG) de transfection médiée 16, qui ne nécessite plusieurs échanges de solutions, et est idéale pour les plates - formes de manipulation de liquides. En second lieu, les protoplastes, par définition, sont des cultures monocellulaires, et donc les problèmes associés à l'agglutination et la formation chaîne dans des cultures de cellules végétales, ne sont pas observés dans les protoplastes. En termes de dépistage rapide à l'aide d'un spectrophotomètre à base de plaque, l'agglutination des cellules, ou des cellules dans plusieurs plans vont conduire à des difficultés dans l'acquisition de mesures cohérentes. Etant donné que les protoplastes sont aussi plus denses que les milieux de culture, ils sédimentent au fond du puits, la formation d'une monocouche, ce qui est favorable à la spectrophotométrie sur la base de plaque. Enfin, alors que les cultures en suspension de cellules végétales sont primarille dérivé de 17 cals, les protoplastes peuvent être récoltées à partir d' un certain nombre de tissus végétaux, conduisant à la possibilité d'identifier une expression spécifique d' un tissu. Par exemple, la capacité d'analyser root- ou une expression spécifique de feuille d'un gène peut être très important pour la prédiction du phénotype. Pour ces raisons, les protocoles mis au point dans ce travail ont été validées en utilisant des protoplastes isolés du tabac largement utilisé (Nicotiana tabacum L.) 2 (PAR-2) de culture en suspension 'Bright Yellow'.

La culture en suspension BY-2 a été décrite comme étant la cellule "Hela" des plantes supérieures, en raison de son utilisation généralisée dans l' analyse moléculaire des cellules végétales 18. Récemment, PAR-2 cellules ont été utilisées pour étudier les effets de facteurs de stress plante 19-22, protéine intracellulaire localisation 23,24, et la biologie cellulaire de base 25-27 démontrant l'utilité générale de ces cultures en biologie végétale. Un avantage supplémentaire de BY-2 est la culturepossibilité de synchroniser les cultures avec aphidicoline, ce qui peut conduire à une meilleure reproductibilité pour l' expression génique des études 28. En outre, des méthodes ont été mises au point pour l'extraction de PAR-2 protoplastes utilisant des enzymes à faible coût 29,30, comme enzymes traditionnellement utilisées pour générer des protoplastes sont des coûts prohibitifs pour les systèmes à haut débit. En tant que tel, le protocole décrit ci-dessous a été validé en utilisant la culture en suspension BY-2, mais il devrait être amendable à une culture usine de suspension cellulaire. Les expériences de validation de concept sont effectuées en utilisant une protéine de fluorescence orange (OFP) gène rapporteur (pporRFP) des Porites de coraux durs porites 31 sous le contrôle du promoteur CAMV 35S.

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Protocole

1. Mise en place de la suspension des cultures cellulaires

  1. Préparer liquide par 2 supports en y ajoutant 4,43 g Linsmaier & Skoog basal, 30 g de saccharose, 200 mg de KH 2 PO 4 et 200 pg d'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique (2,4-D) à 900 ml d' eau distillée l'eau et le pH à 5,8 avec 0,1 M KOH. Après ajustement du pH, ajuster le volume final à 1000 ml avec de l'eau distillée et autoclave. Les médias peuvent être stockés jusqu'à 2 semaines à 4 ° C.
  2. Inoculer un flacon de 250 ml Erlenmeyer avec 100 ml de liquide BY-2 médias et une seule pièce de PAR-2 ​​cals (> 1 cm de diamètre) cultivés sur milieu solide PAR-2 ​​(liquide BY-2 médias avec l'ajout de 1% agar) et sceller avec du papier d'aluminium. Incuber la culture à 28-30 ° C avec agitation pendant 5 jours.
    NOTE: PAR-2 ​​cals est maintenu sur un support solide pour le stockage à long terme, comme des cultures liquides vont rapidement proliférer. le volume de la culture peut être ajusté si nécessaire, typiquement une culture de 100 ml sera capable de charger trente-trois 6-wplaques Ell.
  3. Transfert 2 ml de phase logarithmique BY-2 culture à 98 ml de milieu frais PAR-2 ​​et incuber pendant 5-7 jours à 28-30 ° C avec agitation.
    REMARQUE: Sous-culture des cultures liquides établies peut être effectuée en utilisant régulièrement 1: 100 dilutions de 5-7 jours vieilles cultures, plutôt que l'inoculation avec des cals.
  4. Mélanger la culture à fond, que les cellules vont rapidement s'installer, et le transfert de 6 ml de la culture de cellules dans un tube de 15 ml fond conique de centrifugeuse et laisser les cellules se déposent pendant au moins 10 min. Réglez le volume de l'hématocrite à 50% du volume total en retirant le surnageant.
  5. Agiter le tube par inversion et pipette 500 pi dans chaque puits d'une plaque à 6 puits pour la digestion. Utiliser des pipettes de large calibre pour transférer les cellules à ce stade, car ils sont denses et bouchent les embouts de pipettes standard.

2. protoplastes Isolation

  1. Allumez toutes les composantes du système robotique (figure 1A) et ouvrir la tâche plaque moteur planification soupleware. Le programme de planification de tâches intègre le moteur de microplaques avec les autres équipements pour permettre le transfert de plaques entre chaque pièce d'équipement.
  2. Avant l' expérimentation, définir les spécifications techniques pour labware (par exemple, des plaques, couvercles) utilisés dans le protocole, ainsi que le démarrage et les positions de fin de chaque morceau de labware, dans le logiciel plaque de moteur, comme suit:
    1. Cliquez sur Configuration de la barre d'outils principale dans le logiciel plaque de moteur et sélectionnez le conteneur commande Gérer les types.
    2. Si le type de conteneur est répertorié dans la bibliothèque de type conteneur existant, puis sélectionnez le conteneur approprié.
    3. Si le type de conteneur ne figure pas dans la bibliothèque de type conteneur existant puis cliquez sur Ajouter pour spécifier un nouveau type de conteneur.
    4. Après l' ajout d' un nouveau type de conteneur, insérer les dimensions du nouveau conteneur (hauteur, largeur, les dimensions d' empilage, et la pince de décalage) dans les onglets appropriés et cliquez sur Enregistrer.
      1. Si les dimensions correctes ne sont pas disponibles auprès du fabricant, puis de déterminer avec précision toutes les dimensions au millimètre près à l'aide des étriers. Des erreurs dans la mesure des dimensions de conteneurs se traduira par un échec de l'auteur de la plaque.
    5. Répétez les étapes 2.2.2 à 2.2.4.1 pour tous les types de conteneurs que le moteur de la plaque va rencontrer. Après l'achèvement de cette étape pour tous les labware, il est nécessaire de définir le début et l'emplacement de fin pour chaque conteneur (étape 2.2.6).
      NOTE: Pour ce protocole le labware comprend la plaque de 6 puits, la plaque de puits profonds, et la plaque de criblage 96 puits fluorescent.
    6. Pour définir la position de début et de fin de chaque conteneur, cliquez sur l'onglet Début / Fin dans un protocole spécifique. Tout d'abord, sélectionnez la position de départ de chaque conteneur. Ensuite, cochez la case Lidded / Unlidded à la fois le début et la fin de course. Répétez l'opération pour tous les conteneurs.
      NOTE: Si le conteneur sera laissé sur un autre morceau de équipment (au lieu du moteur de la plaque) l'emplacement final peut être laissée en blanc.
  3. A ce stade, charger manuellement toutes les plaques dans la position de départ pour l'ensemble du workflow. Chargez les plaques de blindage fluorescentes 96 puits dans Hôtel 2, plaques de 6 puits avec by-2 cellules dans Hôtel 3, une assiette creuse 96 puits qui sera utilisé pour la transformation sur la plaque de chauffage / refroidisseur nid 2, et 50 ml conique tube contenant la solution d'enzyme (voir fichier supplémentaire, section 1.2.2) sur le distributeur multi-mode.
    1. Si la transformation sera effectuée dans le protocole, pré-charger la plaque à 96 puits profonds avec 10 pi d'ADN plasmidique par puits (1 pg / pl, A 260/280> 1,8) contenant la construction rapporteur OFP et incuber sur la plaque chauffage / refroidissement à 4 ° C. Chaque puits est utilisée pour une transformation unique, donc le nombre de puits remplis dépendra de la configuration expérimentale.
  4. Chargez toutes les fournitures et les plaques sur l'automated plate - forme de manipulation de liquides dans les endroits désignés et définir la position de chaque élément dans le logiciel de contrôle d'automatisation (figure 1B).
    1. Chargez une plaque de 96 puits préchargé avec 200 pi de 40% de PEG dans MMg (0,4 M mannitol, 100 mM MgCl 2, mM MES 4, pH 5,7) dans la colonne 1, 200 pi d'iodure de propidium (PI, 1 pg / ml) dans la colonne 2, et 200 pi d'éthanol dans la colonne 3 (nid 2), et une boîte de pointes de pipette dans le nid 8.
    2. Pour définir l'emplacement du labware dans le logiciel de l'automatisé liquide manutention plate - forme, sélectionnez Outils dans le menu et cliquez sur Editeur Labware.
    3. Sélectionnez le type de labware dans le menu déroulant ou définir un nouveau type de labware en utilisant le bouton Nouveau Labware.
    4. Définir la position de chaque morceau de labware sélectionné en sélectionnant l'onglet Protocole principal et cliquez sur Configurer Labware. Assurez-vous que chaque morceau de labware placé sur la plate-forme de traitement des liquides est automatisédéfini avant l'exécution du protocole.
    5. Pour déclencher les protocoles automatisés, cliquez sur la fenêtre de l' Explorateur de profil et sélectionnez le nom du protocole à être exécuté (protoplastes Isolation, Cell Count, et la transformation médiée par PEG).
    6. Cliquez sur Exécuter pour initialiser tous les périphériques qui seront utilisés dans le protocole.
    7. Enfin, dans la fenêtre de travail Explorer, cliquez sur Ajouter unité de travail pour vérifier tous les conteneurs / labware dans le système et commencer le protocole automatisé.
      NOTE: Les descriptions complètes des protocoles automatisés sont contenus dans le fichier supplémentaire.

3. Établir la courbe standard pour le nombre de cellules

  1. Concentrer manuellement protoplastes à une concentration de 1 x 10 6 protoplastes / ml dans un volume de 1 ml. Centrifugeuse protoplastes à 1000 xg pendant 10 min, et retirer le surnageant.
  2. ajouter manuellement 900 ul d'éthanol à 70% (conservé à 4 ° C) au culot de protoplasteset remettre en suspension le culot. Incuber pendant 10 min sur la glace pour fixer les cellules.
  3. Ajouter 100 pi de pi (1 pg / ml) pour les protoplastes pour marquer les noyaux et permettre la détection par le lecteur de plaque.
  4. Charge 80 pi de liquide BY-2 médias dans chaque colonne et rangée de la plaque de criblage 96 puits fluorescent à partir de la colonne 2.
  5. Dans la colonne 1 d'une plaque de criblage 96 puits fluorescent, ajouter 70 pi de protoplastes et 50 ul PAR-2 ​​médias à chaque puits dans la colonne.
  6. Placer la plaque dans le nid 6 de la plate-forme de traitement des liquides automatisé, et exécuter une dilution en série 2 fois.
    1. Pour effectuer une dilution en série sur la plate - forme de traitement des liquides automatisé, cliquez sur Lancer l' Assistant Dilution série et régler le volume de transfert (60 pi), le nombre de mélanges et volume (2, 70 pl), des puits initiaux (colonne 1, lignes AF), la dilution puits (colonnes 2-11, lignes AF), et aspiration et de distribution des biens (0,5 mm de fond de puits).
    2. Après avoir réglé les paramètres, enregistrer uned exécuter le protocole.
      Remarque: Comme tous les protoplastes sont étiquetés avec PI (en raison de la fixation des cellules), la fluorescence est proportionnelle à la concentration de protoplastes.
    3. Après la dilution en série est terminée, retirez la plaque du nid 9 et l'insérer dans le lecteur de plaque et exécuter le protocole de courbe standard dans le logiciel de lecteur de plaque.
      NOTE: Une courbe standard sera alors généré en comparant la fluorescence de PI (excitation 536 nm / émission 620 nm) dans chaque puits avec la concentration de protoplastes connue.
  7. À la fin du protocole de lecteur de plaque, enlever la plaque et de recueillir toutes les cellules transgéniques pour l'autoclavage ou d'autres procédures de-vitalisation tels que définis dans les protocoles de biosécurité ».

4. Analyse microscopique de la transformation

  1. Retirer la plaque avec des protoplastes transformées (le produit du Protocole automatisé 3, fichier supplémentaire) de l' Hôtel 1 du système robotique.
  2. Toursur microscope inversé, la caméra et la lampe fluorescente.
  3. Sélectionnez l'objectif 10X pour initial se concentrant sur les protoplastes, allumer la lampe halogène, et fermer l'obturateur pour la lampe fluorescente.
  4. plaque de charge sur le système microscopique et de se concentrer sur les protoplastes utilisant fond clair.
  5. Après s'être concentrée sur protoplastes, éteindre l'ampoule halogène et ouvrir l'obturateur pour la lampe fluorescente.
  6. Sélectionnez le filtre CY3 / TRITC fixé pour la visualisation de la protéine pporRFP exprimée par les protoplastes transgéniques.
  7. Balayez chaque puits pour déterminer le nombre de protoplastes exprimant le pporRFP marqueur fluorescent.
  8. Calculer l'efficacité de transformation que le nombre total de protoplastes exprimant le marqueur fluorescent du nombre total de protoplastes.
  9. Collecter des plaques contenant des cellules transgéniques dans des sacs de biosécurité approuvés pour autoclavage ou d'autres procédures de-vitalisation tels que définis dans les protocoles de biosécurité ».

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Résultats

Dans la présente étude, le taux de doublement de BY-2 a varié de 14 à 18 h dépendant de la température à laquelle les cultures ont été incubées, en accord avec les rapports précédents, d'une longueur moyenne de 15 heures du cycle cellulaire. Avec ce taux de doublement, 1: 100 à partir inoculum a été utilisé pour initier des cultures, ce qui conduit à des cultures avec un volume cellulaire tassé (CVP) de 50% en 5-7 jours. Dans le protocole actuel, dans lequel les cul...

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Discussion

Le protocole décrit ci-dessus a été validé avec succès pour l'isolement de protoplastes, l'énumération et la transformation du tabac en utilisant une culture de cellules en suspension BY-2; Toutefois, le protocole pourrait facilement être étendu à toute culture de suspension de la plante. À l' heure actuelle, l' isolement de protoplastes et la transformation ont été réalisés dans de nombreuses plantes, notamment le maïs (Zea mays) 10, la carotte (Daucus carota)

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier en compétition.

Remerciements

This research was supported by Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Orbitor RS Microplate moverThermo Scientific
Bravo Liquid HandlerAgilent
Synergy H1 Multi-mode ReaderBioTek
MultiFlo FX Multi-mode DispenserBioTek
TeleshakeInheco3800048
CPAC Ultraflat Heater/coolerInheco7000190
Vworks Automation SoftwareAgilentSoftware used to control and write protocols for Agilent Bravo
Momentum SoftwareThermo ScientificTask scheduling software for controlling Orbiter RS
Liquid Handling Control 2.17 SoftwareBiotekSoftware used to control and write protocols for MultiFlo FX
IX81 Inverted MicroscopeOlympus
Zyla 3-Tap microscope cameraAndor
ET-CY3/TRITC Filter SetChroma Technology Corp49004
Rohament CLAB Enzymessample bottlelow-cost cellulase
Rohapect UFAB Enzymessample bottlelow-cost pectinase
Rohapect 10LAB Enzymessample bottlelow-cost pectinase/arabinase
Linsmaier & Skoog Basal MediumPhytotechnology LaboratoriesL689
2,4-dichlorophenoxyacetic acidPhytotechnology LaboratoriesD295
propidium iodideSigma AldrichP4170
Poly(ethylene glycol) 4000Sigma Aldrich95904-250G-FFormerly Fluka PEG
Propidium IodideFisher Scientific25535-16-4Acros Organics
CaCl2Sigma AldrichC7902-1KG
Sodium AcetateFisher ScientificBP333-500
MannitolSigma AldrichM1902-1KG
SucroseFisher ScientificS5-3
KH2PO4Fisher ScientificAC424205000
KOHSigma AldrichP1767
Gelzan CMSigma AldrichG1910-250G
6-well plateThermo Scientific103184
96-well 1.2 ml deep well plateThermo ScientificAB-0564
96 well optical bottom plateThermo Scientific165305
Finntip 1000 Wide bore Pipet tipsThermo Scientific9405 163
NaClFisher ScientificBP358-10
KClSigma AldrichP4504-1KG
MESFisher ScientificAC17259-5000
MgCl2Fisher ScientificM33-500

Références

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