موثوقة وعالية استخراج كفاءة الكلى الخلايا المناعية

Summary

Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

Abstract

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.

Introduction

يحدث تنشيط جهاز المناعة في أمراض الكلى متعددة والعمليات الفيزيولوجية المرضية ^{6،10،11،13.} المجالات المحتملة للأبحاث نشطة تشمل محفزات مختلفة لتنشيط الجهاز المناعي، ومختلف أنواع الخلايا المعنية، ونمط خلوى / chemokine في وضع مرض معين، تعديل من جميع العمليات الآنفة الذكر التي دواء معين وما إلى ذلك مثالا، في نقص التروية ضخه إصابة (نموذج لقصور كلوي حاد)، أن هناك زيادة في الخلايا المناعية أو النخاع العظمي المستمدة الخلايا المكونة للدم أو CD45 ⁺ الخلايا في غضون ساعات قليلة، والذي أصيب خلال الفترة من إصلاح أو التليف (بعد 6 أسابيع) ^{5، 12.} هذه الخلايا المناعية تفرز كل من السيتوكينات و chemokines الموالية للالتهابات ومضادة للالتهابات لتنظيم عملية إصلاح ^5،12. حاليا، قد زاد من القدرة على استخدام fluorophores متعددة في وقت واحد لتسمية السكان الخلية في تعليق خلية واحدة مع الإعلانتنفيس عن تدفق الحديث الخلوي الأجهزة مع 4-5 الليزر. وقد أضاف هذا إلى حد كبير في القدرة على تمييز السكان الخلية على أساس حالتها التشغيلية ^3،7. على سبيل المثال، لتسمية بدقة بلعم ^{منخفضة،} ستكون هناك حاجة F4 / 80 ^منخفضة CD11b ^عالية Ly6b CD206 ^ارتفاع لا يقل عن 3 المزيد من fluorophores في حجم العينة نفسه إلى بوابة للخلايا الحية، CD45 + (الكريات البيضاء) وLy6G- (العدلات) و هذا ممكن إلى حد كبير مع أحدث تدفق Cytometers ^3. ومع ذلك، فإن المقايسات المصب لإفراز السيتوكينات، تكاثر الخلايا، سمية الخلايا، وتفعيل البلاعم والكمي لأعداد مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا اللمفية وحيدات لا يحتاج فقط نوعية جيدة (خلايا حية، singlets ل) ولكن أعداد كافية من الخلايا.

ويتكون نظام المناعة في الكلى تتكون من كل من مكونات التكيف والفطرية وأنواع خلايا متعددة ^1،7،13. على سبيل المثال، في الفئران طفل اثنينneys يتم الإبلاغ معا لاحتواء 2-17٪ (28،000-266،000) CD45 ⁺ الخلايا من الخلايا المناعية مجموع الكلى معزولة (1.4 × 10 ⁶ خلايا) وحوالي 5-15٪ (1،400-4،200) هذه هي خلايا CD4 ^{+ 1 ، 5،12.} وهناك نسبة صغيرة (5-15٪، 70-630) من هذه CD4 + الخلايا FoxP3 + الخلايا (الشكل 1) ^1. ونتيجة لهذه التخفيضات خطوة حكيمة في النسب المئوية للخلايا، وأحيانا السكان خلية من الاهتمام (في هذه الحالة CD45 + CD4 + FoxP3 + الخلايا) يمثله مجرد ~ 100 خلية. عدد قليل من CD45 + CD4 + FoxP3 + خلايا يحتم أن عددا كبيرا من مجموع الخلايا يتم عزل والخلايا هي من نوعية جيدة للدراسات المصب مثل المقايسات خلوى إفراز. وعلاوة على ذلك، قد يكون من الضروري الجمع بين الكليتين 2-3 الفئران منذ لا يتم تمثيل مجموعات سكانية فرعية بأعداد كبيرة كافية لتنفيذ فحوصات قياس الكمي. وبالتالي، العزلة موثوقة وفعالة للسكان الخلية وحيدة النواة الكلى أمر مرغوب فيه من أجل عشيقذ الطيف المناعية المرتبطة أمراض الكلى.

تقليديا، لعزل الخلايا وحيدة النواة الكلى، وقد استخدم الباحثون مجموعة متنوعة من الهضم الأنزيمية مثل كولاجيناز 1A أو الثاني بما في ذلك الدناز 1 ^1،5،12. ومن المعروف جيدا أن collagenases يكون النشاط الأنزيمي أن يختلف مع الأرقام كثيرا، ومن قبل شركة التصنيع، مما استلزم المعايرة للتركيز الأمثل ومدة الحضانة ^4،14،15. وبالإضافة إلى ذلك، والهضم مع كولاجيناز يضيف الوقت لتنميق الكلى إلى قطع صغيرة، يتطلب الحضانة من القطع الكلى في (37 درجة مئوية) حمام ساخن وقتا إضافيا للحضانة في EDTA لوقف التفاعل. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تحقيق أقل العقم لبعض الإجراءات اللاحقة التي تحتاج إلى زراعة الخلايا. الأهم من ذلك، اعتمادا على المحقق وجميع المتغيرات التي تنطوي عليها، فإنه يؤدي إلى التباين في البيانات وتفسيرها عبر المختبرات. في الآونة الأخيرة، معتطوير الميكانيكية الأنسجة اختلال / المجانسة ^16، يتم تجنب خطوة كولاجيناز الهضم تماما والاستعاضة عن تعطل ميكانيكية بسيطة الكلى ^2. هنا، علينا أن نظهر طريقة كفؤ بسيط لعزل الخلايا المناعية الكلى للاستخدام اليومي استخراج الخلايا المناعية. الأهم من ذلك، هذا الأسلوب يمكن أن تتكيف مع الأنسجة الرخوة وغير ليفية أخرى مثل الكبد والدماغ ^16.

Protocol

تم استعراض جميع الخطوات بروتوكول تنفيذ والموافقة عليها من قبل جامعة ميسوري رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (ACUC). لهذا البروتوكول، وتم استخدام الذكور C57BL / 6 الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 15 أسبوعا على الرغم من الناحية النظرية أي القوارض في أي سن يمكن أن تستخدم في التجارب. منذ ذلك الحين، هذا هو عملية جراحية عدم بقاء، ويتحقق القتل الرحيم من استنزاف واسترواح الصدر الثنائي.

1. الإرواء من الكلى

ملاحظة: الإرواء الأعضاء مثل القلب والكبد والكلى ويزيل الدم التي قد تتداخل مع تفسير البيانات. وبالتالي، إذا كان ذلك ممكنا ونحن دائما يروي الأجهزة.

1. ضع الماوس في الأيزوفلورين (3 مل / دقيقة) غرفة الاستقراء حتى انها قادرة على الحركة. بعد ذلك، إزالة الماوس من الغرفة، ووضع ذلك ظهريا على طاولة تشريح ووضع مخروط الأيزوفلورين على الأنف الماوس، ودفع الأيزوفلورين بمعدل 1.5 مل / دقيقة عن طريق التنظيم.
2. تحقق من رد و قرصة أخمص قدميهه مع ملاقط لتقييم إذا كان الحيوان قد حققت طائرة من التخدير الجراحي. تنظيف البطن بطني مع المياه المالحة وخفض فتح البطن مع مقص، ودفع أعضاء البطن (من الحقل الجراحي) إلى الجانب الأيسر من الفأرة.
3. جمع الدم من الوريد الأجوف السفلي مع قياس 25 الثابتة إبرة حقنة سم مكعب 1 وإضافته إلى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge تحتوي على 10 ميكرولتر من 0.5M EDTA.
   ملاحظة: جمع الدم هو اختياري. البلازما يمكن استخدامها لقياس البيوكيميائية. ويمكن استخدام الكريات البيض لفحوصات التدفق الخلوي.
4. باستخدام مقص، وجعل قطع صغير في الأذين الأيمن للسماح للخروج من مزيج من الدم وبرنامج تلفزيوني من الخطوة التالية.
5. أخذ حقنة 50 سم وملء مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني (20-30 سم). بعد ذلك، إرفاق 21-25 G الإبرة إلى حقنة، ثقب البطين الأيسر في قمته (في حين الضغط على القلب بلطف بين ملقط) ويروي ببطء البطين الأيسر مع الفوسفات مخزنة المالحة 7.4 درجة الحموضة (PBS) على مدارمن 1-2 دقيقة.
   ملاحظة: قلب يبيض فور ملليلتر القليلة الأولى من نضح. مراقبة الكبد لابيضاض، وهذا يدل على أن نضح يستنزف الدم من الكبد عن طريق العائد الوريدي عبر الوريد الأجوف. وبالإضافة إلى ذلك، تأكد من أن الرئتين لا تتوسع خلال ضخ لأن هذا يدل على ثقب البطين الأيمن. إذا كانت الرئتين في التوسع، وسحب إبرة الظهر قليلا إلى البطين الأيسر ومواصلة التروية. الوقت المستغرق من شق الأولى حتى يتحقق القتل الرحيم هو أقل من 2 دقيقة

2. تشريح الكلى

1. بعد نضح كاملة، استخدم مقص وملقط لتشريح الكلية اليمنى من مرفقاتها (الأوعية الدموية، والدهون والغدد الكظرية) والمكوس.
2. إزالة بلطف الكبسولة التي تغطي الكلى عن طريق القص وتشريح مع ملقط. وزن الكلى.
   ملاحظة: وزن الكلى هو اختياري. ومع ذلك، بعض التجاربقد يؤدي إلى تغيير في حجم الكلى / الوزن التي يمكن استخدامها لتطبيع العائد خلية في كل غرام من الأنسجة.
3. بعد وزنها الكلى، وضعه في 1 مل من RPMI-1640 التي تحتوي على 0.5٪ FBS أو التدفق الخلوي حل العازلة تلطيخ (50 مل المخروطية اللولبية أنبوب الحد الأقصى) ووضع أنبوب على الجليد حتى استخدامها مرة أخرى.
   ملاحظة: لتسهيل الوصف، فإننا سوف تصف ما تبقى من عزل الخلايا المناعية في التدفق الخلوي حل العازلة تلطيخ. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا سوف تصف عزل الخلايا المناعية من الكلى واحد، على الرغم من أن كل من الكليتين أو 1 + 1/3 ^{الثالثة} والكلى يمكن أن تستخدم اعتمادا على التجارب المصب (اختياري). 1/3 ^{الثالثة} والكلى يمكن تجميدها لبروتين التجارب / RNA و1/3 ^الثالث يمكن وضعها في مخازن للفحص المجهري المناعية أو نقل الإلكترون.

3. تجانس الكلى

1. تسمية 5-80 مل حقيبة قدرة التجانس مع معلومات تحديد العينة،إزالة مصفاة داخل (STR) وتخلص منه. شغل حقيبة مع 5 مل من الجليد الباردة حل التدفق الخلوي تلطيخ العازلة ونقل الكلى إلى المخزن المؤقت. كرر هذه العملية لعينة ثانية أو أكثر من العينات التي تحتاج إلى معالجة.
2. طي حقيبة التجانس في نصف، مثل أن نصف واحد لديه الكلى غارقة في حل التدفق الخلوي تلطيخ العازلة ومطوية النصف الآخر ببساطة أكثر من ذلك.
3. بدوره على الخالط الأنسجة وضعه على (الإعداد) السريعة دورة في الدقيقة. ضع كيس التجانس مطوية مع الكلى التي تواجه مجداف، على مقربة من الحافة السفلية ولكن تأكد من أن الطرف الأدنى من أكياس لا تنزلق تحت الحد السفلي من المجاذيف.
   1. معالجة العينة الثانية في وقت واحد كما أن هناك 2 المجاذيف. تحديد الوقت 120 ثانية. مراقبة المجاذيف تتحرك ذهابا وإيابا إلى التجانس الكلى.
      ملاحظة: في الوقت نفسه، وهذا التوقف يمكن استخدامها لإعداد 2 أكثر الكلى (أو الأنسجة الأخرى) عينات بينما الأولين والمعالجة.
   2. بعد الانتهاء مع أول مجموعة من التجانس، ونقل الحقائب إلى جليد وإعادة تحميل الخالط الأنسجة مع المجموعة التالية من عينات وهلم جرا. ضمان بصريا أن الكلى هي متجانسة بشكل كاف وليس أجزاء كبيرة مرئية.
      ملاحظة: عموما، 2 دقيقة في الخالط الأنسجة دورة في الدقيقة بسرعة كافية لالكلى.
   3. وضع خلية مصفاة 100 ميكرون إلى 50 مل أنبوب مخروطي على الجليد. بعد ذلك، ماصة جناسة تماما إلى مصفاة الخلية. تعيين جهاز للطرد المركزي الكلمة في 50 x ج لمدة 1 دقيقة على 4 درجات مئوية، وتحميل العينات في جهاز الطرد المركزي.
      ملاحظة: سوف الطرد المركزي التأكد من أن جميع جناسة (التي تحتوي على خلايا) قد مرت من خلال مصفاة الخلية.
   4. إزالة أنابيب من أجهزة الطرد المركزي ووضعها مرة أخرى على الجليد. تجاهل مصافى الخلية والحفاظ على جناسة. إضافة حجم مساو (~ 6 مل) من تحلل العازلة 1X RBC إلى بيليه خلية / طاف وماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لجعل التعليق خلية موحد. VisuaLLY، ومراقبة بعض من اللون الأحمر في انخفاض تعليق على الفور. ترك أنابيب على الجليد لمدة 5 دقائق لتحقيق أقصى قدر من RBC تحلل.
      ملاحظة: الخطوة تحلل كريات الدم الحمراء يمكن تخطي إذا المحقق واثق من نضح الكلى وهو المطلوب أقل التلاعب الخلية. وقد لاحظنا زيادة كبيرة في العائد خلية الكلى من خلال عدم إخضاع تعليق الخلية إلى RBC تحلل.
   5. تدور الأنابيب في جهاز الطرد المركزي الذي تم تعيينه إلى 500 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتشكيل خلية بيليه.
      ملاحظة: خلال الخطوات 3.6 و 3.7، وإعداد لالسيليكا الغروية (Percoll) على أساس التدرج الكثافة الطرد المركزي.
      1. يستغرق 10 مل جولة أنابيب البولي بروبلين القاع وتسمية لهم مع أرقام العينة المناظرة ووضعها في رف أنبوب.
         ملاحظة: فيما يلي وصف كيفية جعل ما يكفي من الكواشف التدرج الكثافة لمدة 4 عينات الكلى.
      2. خذ 7 مل من محلول التدفق الخلوي تلطيخ العازلة وماصة قبل أن تتحول إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. إضافة 1 مل من 2 M السكروز لإعداد 0.25 M السكروز.
      3. المقبل، واتخاذ 7.2 مل من كاشف التدرج الكثافة وماصة عليه في 15 مل آخر أنبوب مخروطي الشكل. إضافة 1.55 مل من محلول التدفق الخلوي تلطيخ العازلة و 1.25 مل من 2 M السكروز لإعداد 72٪ كاشف التدرج الكثافة و 0.25 M السكروز.
      4. ماصة 1 مل من 72٪ كثافة التدرج كاشف في جولة واحدة أنبوب أسفل البولي بروبلين للكل عينة.

   4. الطرد المركزي التدرج

   1. بعد الخطوة 3.7، واتخاذ أنابيب بها وبلطف صب طاف في اقتراح واحد على نحو سلس وأيضا صب الانخفاض القادم من السائل الذي يشكل بينما تعود ملكية الأنبوب رأسا على عقب.
      ملاحظة: هذه الخطوة مهمة منذ تاركا وراءه السائل الزائد يمكن تغيير درجة الكثافة كافيا لخلق التباين في العوائد. عندما يتم تعيين أنبوب الظهر في وضع مستقيم، ~ 200-300 ميكرولتر من السائل يبقى مع بيليه الخلية.
   2. ماصة 1 مل من 0.25 M السكروز على بيليه خلية بلطف ولكن بحزم ماصة صعودا وهبوطا لبرينز الخلايا إلى تعليق موحد. المقبل، إضافة تعليق الخلية إلى 1 مل 72٪ كاشف التدرج الكثافة (3.7.4)، ومرة ​​أخرى ماصة بقوة لخلط الخلايا لتشكل 36٪ التدرج الكثافة كاشف.
   3. خذ 1 مل من 72٪ كثافة التدرج الكاشف إلى باستور (نقل) ماصة البولي بروبلين. حتى مع الضغط على لمبة (تحافظ على عمود السائل في طرف ويمنع تكوين فقاعة)، إدراج ماصة باستير إلى الجزء السفلي من تعليق خلية (36٪ كثافة التدرج كاشف) بلطف وتفريغ 72٪ التدرج الكثافة كاشف لتشكيل متميزة أثقل طبقة.
   4. اختيار أنابيب العينات بلطف ومكان في أجهزة الطرد المركزي، والذي هو في درجة حرارة الغرفة لهذه الخطوة. تدور لمدة 20-30 دقيقة في 500 × ز.
   5. وفي الوقت نفسه، وإعداد مجموعتين آخر من البولي بروبلين جولة أنابيب الطرد المركزي أسفل مع معرفات عينة المقابلة.
   6. بعد الخطوة 4.4 كاملة، وإزالة عينة تحتوي على أنابيب البولي بروبلين بلطف، مع الحد الأدنى من الهز ويضعهاعلى الرف الأنبوب.
   7. التقاط أنبوب العينة الأولى وأنبوب فارغ المقابل لها. مع ماصة باستور البولي بروبلين، ولكن بلطف تماما مع شفط قياس، وإزالة العليا "طبقة غير المرغوب فيه" أو "مادة لزج" ووضعها في أنبوب الجولة القاع أجهزة الطرد المركزي فارغة.
      1. المضي قدما بإزالة الجزء العلوي من التدرج حتى "معطف الشهباء" وصلت (قد يبدو من البيض مع مسحة المحمر [خلايا الدم الحمراء]). وقف شفط اذا تم التوصل الى ذروة ~ 3 ملم من "معطف بافي".
         ملاحظة: تأكد من أن هذه الأشياء قد ولى تماما من الجزء العلوي من التدرج قبل مواصلة الشفط.
   8. خذ ماصة باستور جديدة وجولة أنبوب أسفل الطرد المركزي الطازجة وإزالة بلطف معطف الشهباء. مواصلة لشفط 3-5 ملم تحت معطف الشهباء، للتأكد من أن معظم الخلايا التي تم جمعها وإضافتها إلى أنبوب 2 ^{الثانية} جولة جديدة أسفل مع معرف عينة المناسب.
   9. إضافة 1-2 مل سحل و التدفق الخلوي تلطيخ العازلة للأنبوب 2 ^{الثانية} ومزيج دقيق من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
   10. تدور أسفل الخلايا في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. وغسل الخطوة 2 ^{الثانية} مع الحل التدفق الخلوي تلطيخ العازلة اختيارية. resuspend في 500 ميكرولتر من حل التدفق الخلوي تلطيخ العازلة، والشروع في عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.

   5. الاختياري (وسم الخلية)

   1. Aliqout كل عينة لنفس العدد من الخلايا. إضافة الجسم المضاد عرقلة في التخفيف من 0.5 ميكروغرام لكل 10 ⁶ خلايا (CD16 المضادة لل/ CD32 FCR)، واحتضان على الجليد لمدة 15 دقيقة.
   2. إضافة كوكتيل المطلوب من الأجسام المضادة الأولية (مترافق إلى fluorophores المناسبة) التي يتم تحديدها للعمل بشكل جيد مع بعضها البعض من قبل المحقق، قبل التجارب الفعلية. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: للحصول على المظاهرة الكلى المناعي وسم الخلية لهذه المخطوطة، استخدمنا T-لايmphocyte والبلاعم / لوحة الخلايا الجذعية. وتألفت لوحة الخلايا اللمفاوية التائية من قابل للتثبيت الجدوى وصمة عار FVS510، ومكافحة CD45 (استنساخ: 30-F11) BV421، ومكافحة Foxp3 (استنساخ: FJK-16S) APC، ومكافحة CD127 (استنساخ: A7R34) PE / Cy7، ومكافحة CD44 (استنساخ: IM7) PerCP / Cy5.5، ومكافحة CD4 (استنساخ: RM4-5) APC-Cy7، ومكافحة CD8 (استنساخ: 53 حتي 6،7) BV785. وتألفت لوحة بلعم من قابل للتثبيت الجدوى وصمة عار FVS510، ومكافحة CD45 (استنساخ: 30-F11) BV421، ومكافحة Ly6G (استنساخ: 1A8) FITC، ومكافحة CD11b (استنساخ: M1 / ​​70) PerCP-Cy5.5، مكافحة APC، ومكافحة CD11c و(استنساخ: N418): / 80 (BM8 استنساخ) F4 BV785.
   3. إضافة قابل للتثبيت الجدوى وصمة عار وترك على مقاعد البدلاء أعلى لمدة 5 دقائق. غسل الخلايا مع حل التدفق الخلوي تلطيخ العازلة لإزالة الفائض من قابل للتثبيت الجدوى وصمة عار.
   4. إضافة التثبيت / Permeabilization كاشف واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. يغسل في حل permeabilization.
   5. وصمة عار للداخل الخلايا، منع مرة أخرى مع مكافحة CD16 / 32 FCR ل10min. إضافة البقع داخل الخلايا واحتضان لمدة 20-30 دقيقة. غسل 2X في بيحل rmeabilization.
   6. resuspend في التدفق الخلوي تلطيخ العازلة حل وتشغيل عينات من خلال آلة نظام مراقبة الأصول الميدانية ^3،9.

النتائج

يعتمد عدد من اللوحات التي يمكن تشغيلها على عدد من الخلايا المناعية التي يمكن استخلاصها بشكل موثوق من الكلى. هنا، علينا أن نظهر القدرة على تشغيل 2 لوحات، واحدة للالخلايا اللمفاوية التائية واحد لالضامة / الخلايا الجذعية. على لوحة الخلايا اللمفاوية ال?...

Discussion

لقد قدمنا ​​هنا منهجية للحصول على خلايا المناعة من الكلى بطريقة موثوقة وفعالة. تعديل رئيسي إلى الخطوة كولاجيناز الهضم المستخدمة على نطاق واسع (اضطراب الميكانيكية من الأنسجة) يوفر حوالي 30 دقيقة، ويأخذ عزل عدد كبير من الخلايا المناعية قابلة للحياة اقل من ساعتين لمدة ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stomacher 80 Biomaster lab system	Seward
Stomacher 80 Classic bags	Seward	BA6040/STR
Sorvall Legend XFR Centrifuge	Thermo Scientific		Or equivalent equipment
Hemocytometer	Electron Microscopy Sciences	63514-11
Analytical flow cytometer	BD LSR-X20 Fortessa
Percoll	Sigma	P1644
Dulbecco’s phosphate buffered saline 1x (DPBS)	Gibco, Life Technologies	14190-250
Polypropylene tubes, no cap	Becton Dickinson	352002
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	FVS510,  564406
Anti-CD16/32 (Clone: 93)	EBioscience	14-0161
anti-CD45 (clone: 30-F11)  BV421	BD Pharmingen	103133/4
Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC	EBioscience	17-5773
Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7	Biolegend	135013/4
anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5	Biolegend	103031/2
anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7	Biolegend	100413/4
anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785	Biolegend	100749/50
Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC	Biolegend	127605/6
Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5	Biolegend	101227/8
Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC	Biolegend	123115/6
Anti-CD11c (Clone: N418) BV785	Biolegend	117335/6
Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7	Biolegend	145705/6
Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE	Biolegend	137803/4
100 μm filter	Fisher Scientific	22363548
Fisherbrand Tubes 50 ml	Fisher		Or equivalent equipment
Fisherbrand Tubes 15 ml	Fisher		Or equivalent equipment
Sucrose	Fisher chemical	S5-3
Transfer pipette fine tip	Samco Scientific	232	Or equivalent equipment
Flow Cytometery Staining Buffer Solution	EBioscience	00-4222-26	Or equivalent equipment
1x RBC Lysis Buffer	EBioscience	00-4333-57	Or equivalent equipment