Zuverlässig und High Efficiency Extraktion von Nieren-Immunzellen

Zusammenfassung

Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

Zusammenfassung

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.

Einleitung

Aktivierung des Immunsystems kommt in mehrere Nierenerkrankungen und pathophysiologischen Prozessen ^6,10,11,13. Mögliche Bereiche der aktiven Forschung umfassen die verschiedenen Auslöser für die Aktivierung des Immunsystems, verschiedene Zelltypen beteiligt sind, das Cytokin / Chemokin-Muster in einer bestimmten Krankheit Einstellung, Modulation aller der zuvor genannten Verfahren durch ein bestimmtes Medikament usw. Zur Veranschaulichung, in der Ischämie-Reperfusion Schädigung (ein Modell für akutes Nierenversagen), eine Zunahme der Immunzellen oder Knochenmark hämatopoetische Zellen oder CD45 ⁺ Zellen innerhalb weniger Stunden abgeleitet ist, die durch die Zeit der Reparatur oder Fibrose (6 Wochen später) ⁵ aufrechterhalten ^{wird, 12.} Diese Immunzellen sekretieren sowohl pro-inflammatorische und anti-inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen , den Prozess der Reparatur ^5,12 zu dirigieren. Derzeit ist die Fähigkeit, gleichzeitig mehrere Fluorophore zu verwenden Zellpopulationen in einer Einzelzellsuspension zu etikettieren ist mit der Anzeige erhöhtEntlüftung der modernen Durchflusszytometrie Maschinen mit vier vor fünf Lasern. Dies hat zu der Fähigkeit , im wesentlichen zugegeben , um die Zellpopulationen auf ihren funktionellen Status ^3,7 basierend zu unterscheiden. Zum Beispiel, beschriften , um genau die Makrophagen als F4 / 80 ^niedrig CD11b ^hoch Ly6b ^hohe CD206 ^niedrig, mindestens 3 weitere Fluorophore würde in der gleichen Probenvolumen Tor für lebende Zellen, CD45 + (Leukozyten) und Ly6G- (Neutrophile) benötigt werden und dies ist sehr viel möglich mit der neueren Durchflusszytometer ^3. Jedoch sind die stromabwärts Assays für Zytokinsekretion, Zellproliferation, Zytotoxizität, Makrophagen-Aktivierung und die Quantifizierung der Anzahl von verschiedenen Untergruppen von Lymphozyten und Monozyten braucht nicht nur gute Qualität (lebenden Zellen, Singuletts), aber eine ausreichende Anzahl von Zellen.

Das Immunsystem in der Niere wird sowohl nach oben als adaptiver und angeborene Komponenten und mehrere Zelltypen ^1,7,13. Zum Beispiel bei Mäusen die zwei Kinderneys zusammen berichtet 2-17% (28,000-266,000) CD45 ⁺ Zellen der Niere Gesamtimmunzellen zu enthalten , isoliert (1,4 x 10 ⁶ Zellen) und etwa 5-15% (1,400-4,200) von diesen sind CD4 ⁺ Zellen ^{1 , 5,12.} Ein kleiner Prozentsatz (5-15%, 70-630) dieser CD4 + FoxP3 + Zellen sind Zellen (Abbildung 1) ^1. Aufgrund dieser schrittweise Verringerungen der Prozentsätze der Zellen, die manchmal der Zellpopulation von Interesse (in diesem Fall CD45 + CD4 + FoxP3 + -Zellen) durch eine bloße ~ 100 Zellen dargestellt. Die geringe Zahl der CD45 + CD4 + FoxP3 + -Zellen macht es zwingend notwendig, dass eine große Anzahl von Gesamtzellen werden isoliert und die Zellen sind von guter Qualität für nachfolgende Studien wie Zytokinsekretion Assays. Außerdem kann es notwendig sein, den Nieren von 2 bis 3 Mäusen zu kombinieren, da die Subpopulationen sind nicht in ausreichend hohen Zahlen repräsentiert, um quantifizierbare Assays durchzuführen. Daher zuverlässige und effiziente Isolierung von Nieren mononukleären Zellpopulationen ist wünschenswert, um zu verziereny die immunologische Spektrum mit Nierenerkrankungen in Verbindung gebracht.

Traditionell für die Isolierung von Nieren mononukleären Zellen, haben Forscher eine Vielzahl von enzymatischen Verdauungen wie Kollagenase 1A oder II einschließlich DNase 1 ^1,5,12 verwendet. Es ist bekannt , daß Kollagenasen enzymatische Aktivität haben , die mit Chargennummern und von der Firma Herstellungs variiert, erfordert Titration für die optimale Konzentration und Dauer der Inkubation ^4,14,15. Zusätzlich Verdau mit Kollagenase Zeit für Zerhacken der Niere in kleine Stücke fügt erfordert Inkubation der Nierenstücke in einem geheizten (37 ° C) Bad und zusätzliche Zeit für die Inkubation in EDTA für die Reaktion zu stoppen. Zusätzlich können weniger Sterilität für einige nachgeschaltete Verfahren Kultur benötigen Zelle erreicht werden. Noch wichtiger ist, je nach Prüfer und alle beteiligten Variablen, führt es über Laboratorien in den Daten und Interpretation der Variabilität. Vor kurzem mit derEntwicklung der mechanischen Gewebe Disruptoren / Homogenisatoren ¹⁶ wird die Kollagenase - Verdauungsschritt vollständig vermieden und durch eine einfache mechanische Aufschluß der Nieren ² ersetzt. Hier zeigen wir eine einfache, aber effiziente Methode zur Isolierung von Nierenimmunzellen für die tägliche Immunzellextrakte. Wichtig ist , dass diese Technik auf andere weiche und nicht-faserigen Geweben wie der Leber und im Gehirn ¹⁶ angepasst werden.

Protokoll

Alle Protokollschritte durchgeführt wurden von der University of Missouri Animal Care und Use Committee (ACUC) überprüft und genehmigt. Für dieses Protokoll, männlichen C57BL / 6-Mäuse im Alter von 15 Wochen wurden genutzt, obwohl theoretisch jeder Nagetier in jedem Alter kann für Experimente verwendet werden. Da dies ist ein Nicht-Überlebens Operation wird Euthanasie durch Ausbluten und bilaterale Pneumothorax erreicht.

1. Durchblutung der Nieren

Hinweis: Perfusion von Organen wie Herz, Leber und Niere entfernt das Blut, das mit der Interpretation der Daten beeinträchtigen kann. Daher, wenn möglich, wir perfuse immer die Organe.

1. Platzieren Sie die Maus in einem Isofluran (3 ml / min) Induktionskammer, bis es unbeweglich ist. Dann entfernen Sie die Maus aus der Kammer lag es vom Rücken her auf dem Seziertisch und die Isofluran-Kegel auf der Maus Nase legen und Isofluran mit einer Rate von 1,5 ml / min durch den Regler schieben.
2. Schauen Sie sich die Zehe Prise response mit einer Pinzette zu beurteilen, ob das Tier eine chirurgische Ebene der Anästhesie erreicht hat. Reinigen Sie das ventrale Abdomen mit Kochsalzlösung und schneiden Sie den Bauch mit einer Schere öffnen und die Bauchorgane drücken (aus dem OP-Feld) auf der linken Seite der Maus.
3. Sammeln von Blut aus der unteren Hohlvene mit einer 25-Gauge-Nadel-fixiert auf eine 1-ml-Spritze und fügen Sie sie in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, das 10 & mgr; l 0,5 M EDTA.
   Hinweis: Ansammlung von Blut ist optional. Plasma kann für biochemische Messungen verwendet werden. Leukozyten können für die Durchflusszytometrie-Tests verwendet werden.
4. Mit einer Schere, machen einen kleinen Schnitt in der rechten Vorhofs die Mischung aus Blut heraus zu lassen und PBS aus dem nächsten Schritt.
5. Nehmen Sie eine 50-ml-Spritze und füllen mit eiskaltem PBS (20-30 cc). Als nächstes befestigen Sie den linken Ventrikel an seiner Spitze an der Spritze, durchstechen eine 21-25 G-Nadel (während das Herz sanft zwischen Pinzette) und langsam den linken Ventrikel mit phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,4 (PBS) über den Verlauf perfusevon 1-2 min.
   Anmerkung: Das Herz sofort nach den ersten paar Milliliter Perfusion blanches. Beachten Sie die Leber für blanchiert, da dies zeigt, dass die Perfusion Blut aus der Leber über den venösen Rückstrom durch die Hohlvene abzulassen. Darüber hinaus stellen Sie sicher, dass die Lunge nicht während der Infusion erweitern, da diese Einstich des rechten Ventrikels anzeigt. Wenn die Lunge zu erweitern waren, ziehen Sie die Nadel leicht nach hinten in den linken Ventrikel und die Perfusion fortzusetzen. Die Zeit vom ersten Schnitt bis Euthanasie genommen wird erreicht, weniger als 2 min

2. Dissection von Kidneys

1. Nach Perfusion abgeschlossen ist, mit einer Schere und Pinzette die rechte Niere von ihrer Anhänge (Blutgefäße, Fett und Nebennieren) und die Verbrauch zu sezieren.
2. Entfernen Sie vorsichtig die Kapsel die Niere Abdeckung durch Schneiden und mit einer Zange zu sezieren. Wiegen Sie die Niere.
   Hinweis: Mit einem Gewicht der Niere ist optional. Jedoch einige Experimentekann in Änderung Nieren Größe / Gewicht führen, die verwendet werden können, Zellausbeute pro Gramm Gewebe zu normalisieren.
3. Nach der Niere mit einem Gewicht, legen Sie sie in 1 ml RPMI-1640 0,5% FBS oder Zytometrie Lösung Färbepuffers (50 ml konischen Schraubdeckel Rohr) fließen und das Rohr auf Eis bis zur weiteren Verwendung in Verkehr bringen.
   Anmerkung: Zur Vereinfachung der Beschreibung werden wir den Rest der Isolierung von Immunzellen in der Durchflusszytometrie Färbepuffer Lösung beschreiben. Darüber hinaus werden wir die Isolierung von Immunzellen aus einem einzigen Niere beschreiben, obwohl beide Nieren oder 1 + 1/3 ^rd der Niere in Abhängigkeit von den nachgeschalteten Experimenten verwendet werden können (optional). ^1/3 der Niere könnte für Protein / RNA - Experimente eingefroren werden und 1/3 ^rd kann in Puffern für die Immunhistochemie oder Transmissionselektronenmikroskopie platziert werden.

3. Homogenisieren von Kidneys

1. Beschriften Sie eine 5-80 ml Kapazität Homogenisieren Beutel mit Probenidentifikationsinformationen,Entfernen Sie das Innere Sieb (STR) und entsorgen. Füllen Sie den Beutel mit 5 ml eiskaltem Durchflusszytometrie Färbepuffers Lösung und übertragen Niere in den Puffer. Wiederholen Sie diesen Vorgang für eine zweite Probe oder mehrere Proben, die verarbeitet werden müssen.
2. Falten Sie die Homogenisierung Beutel in der Hälfte, so dass die eine Hälfte der Niere in der Durchflusszytometrie Färbung Pufferlösung und die andere Hälfte wird einfach umgefaltet es unter Wasser hat.
3. Schalten Sie das Gewebe-Homogenisator und legen Sie es auf schnelle (Einstellung) Umdrehungen pro Minute. Legen Sie das gefaltete Homogenisieren Beutel mit der Niere das Paddel zugewandt, in der Nähe der unteren Kante, aber stellen Sie sicher, dass das untere Ende der Beutel sind nicht unter dem unteren Rand der Paddel schieben.
   1. Verarbeiten Sie die zweite Probe gleichzeitig, wie es 2 Paddel. Wählen Sie Zeit als 120 Sekunden. Beachten Sie die Paddel hin und her bewegen, um die Nieren zu homogenisieren.
      Anmerkung: In der Zwischenzeit können diese Ausfallzeiten verwendet werden 2 weitere Niere herzustellen (oder anderem Gewebe) Proben während der ersten beiden verarbeiten.
4. Nach dem mit dem ersten Satz der Homogenisierung Abschluss übertragen, die Taschen zu Eis und das Gewebe-Homogenisator mit dem nächsten Satz von Proben neu zu laden und so weiter. Optisch sorgen, dass die Nieren sind ausreichend homogenisiert und keine großen Brocken sind sichtbar.
   Hinweis: Im Allgemeinen, 2 min in das Gewebe-Homogenisator bei schnellen rpm für die Niere ausreichend ist.
5. Legen Sie eine 100 & mgr; m Zelle Sieb in den 50 ml konischen Röhrchen auf Eis. Als nächstes Pipette vollständig auf das Homogenat in die Zelle Sieb. Stellen Sie eine Bodenzentrifuge bei 50 × g für 1 min bei 4 ° C und laden Sie die Proben in die Zentrifuge.
   Hinweis: Die Zentrifugation wird sichergestellt, dass alle Homogenat (mit Zellen) durch die Zelle Sieb passiert hat.
6. Entfernen Sie die Röhrchen aus der Zentrifuge und legen Sie sie wieder auf dem Eis. Entsorgen Sie die Zelle Siebe und das Homogenat halten. In gleichem Volumen (~ 6 ml) 1x RBC Lysispuffer zu dem Zellpellet / Überstand und Pipette nach oben und unten mehrmals eine einheitliche Zellsuspension zu machen. Visually, sofort ein Teil der roten Farbe in der Suspension Abnahme beobachten. Lassen Sie die Röhrchen auf Eis für 5 min maximale RBC-Lyse zu erreichen.
   Hinweis: der Schritt RBC-Lyse kann übersprungen werden, wenn die Ermittler der Nierenperfusion zuversichtlich ist und weniger Zellmanipulation erwünscht ist. Wir haben nicht durch Unterwerfen der Zellsuspension auf RBC-Lyse eine signifikante Zunahme der Nierenzellausbeute beobachtet.
7. Dreh die Röhrchen in der Zentrifuge, die mit 500 xg eingestellt wurde, 4 ° C für 5 min ein Zellpellet zu bilden.
   Hinweis: Während der Schritte 3.6 und 3.7, bereiten für kolloidales Siliciumdioxid (Percoll) basiert Dichtegradientenzentrifugation.
   1. Nehmen Sie sich 10 ml Rundbodenpolypropylenröhrchen und beschriften sie mit entsprechenden Probennummern und legen Sie sie in einem Rohrgestell.
      Hinweis: Im Folgenden wird beschrieben, wie genug Dichtegradienten Reagenzien für 4 Nierenproben zu machen.
   2. Nehmen Sie 7 ml Durchflusszytometrie Färbepuffers Lösung und Pipette in eine 15 ml konischen Röhrchen. 1 ml 2 M Sucrosevorbereiten 0,25 M Saccharose.
   3. Dann nehmen Sie es 7,2 ml Dichtegradient Reagenz und Pipette in weiteren 15 ml konischen Röhrchen. Hinzufügen 1,55 ml Durchflusszytometrie Staining Pufferlösung und 1,25 ml 2 M Saccharose 72% Dichtegradienten-Reagenz herzustellen und 0,25 M Sucrose.
   4. Pipette 1 ml 72% Dichtegradienten Reagenz in einem runden Boden Polypropylen-Röhrchen für jede Probe.

4. Gradientenzentrifugation

1. Nach dem Schritt 3.7, nehmen Sie die Schläuche aus und vorsichtig den Überstand in einer fließenden Bewegung dekantieren und auch den nächsten Tropfen Flüssigkeit abgießen, die das Rohr bildet, während der Oberseite nach unten gehalten wird.
   Hinweis: Dieser Schritt seit dem Verlassen hinter überschüssige Flüssigkeit wichtig ist, kann genug, um die Dichte Gradienten ändern Variation der Renditen zu schaffen. Wenn das Rohr zurückversetzt ist aufrecht, ~ 200-300 ul Flüssigkeit bleibt mit dem Zellpellet.
2. Pipette 1 ml 0,25 M Saccharose auf die Pellet-Zelle und vorsichtig, aber kräftig pipettieren nach oben und unten zu bring die Zellen zu einer einheitlichen Suspension. Als Nächstes fügen Sie 1 ml 72% Dichtegradienten Reagenz (3.7.4) und erneut kräftig pipettieren um die Zellen zu mischen, um eine 36% Dichtegradienten Reagenz zur Bildung der Zellsuspension.
3. Nehmen Sie 1 ml der 72% Dichtegradienten Reagenz in einem Polypropylen-Pasteur (Transfer) Pipette. Mit gleichmäßigen Druck auf die Lampe (hält die Flüssigkeitssäule in der Spitze und verhindert Blasenbildung), legen Sie die Pasteur-Pipette auf den Boden der Zellsuspension (36% Dichtegradienten Reagenz) sanft und Entladen der 72% Dichtegradienten Reagenz zur Bildung eines deutliche schwerere Schicht.
4. Wählen Sie die Probenröhrchen vorsichtig aufnehmen und in die Zentrifuge, die bei Raumtemperatur für diesen Schritt ist. Spin für 20-30 Minuten bei 500 x g.
5. Inzwischen bereiten zwei weitere Sätze von Polypropylen Rundboden-Zentrifugenröhrchen mit den entsprechenden Probenkennungen.
6. Nach dem Schritt 4.4 abgeschlossen ist, entfernen Sie die Probe vorsichtig Polypropylen-Röhrchen, die mit minimalem Schütteln und setzte es abauf dem Rohrgestell.
7. Pick-up die erste Probenröhrchen und der entsprechenden Leerrohr. Mit einer Polypropylen-Pasteur-Pipette vorsichtig, aber gründlich mit gemessenen Sog, entfernen Sie die obere "Junk-Schicht" oder "klebriges Material" und legte sie in den leeren Rundbodenzentrifugenröhrchen.
   1. Gehen Sie den oberen Teil des Gradienten, bis die "Leukozytenmanschette" Entfernen erreicht ist (mit einem Rotstich [roten Blutkörperchen] off-weiß erscheinen). Stop Absaugen wenn eine Höhe von ca. 3 mm aus der "buffy coat" erreicht ist.
      Hinweis: Stellen Sie sicher, dass dieses Zeug vollständig aus dem oberen Teil des Gradienten, bevor Sie fortfahren Sog weg ist.
8. Nehmen Sie eine frische Pasteur-Pipette und eine neue Rundboden-Zentrifugenröhrchen und sanft die Leukozytenmanschette entfernen. Weiterhin abzusaugen 3 bis 5 mm unterhalb der buffy coat, um sicherzustellen , dass die meisten Zellen werden gesammelt und zu der 2 ^nd neue Rundbodenröhrchen mit geeigneten Abtastidentifizierer.
9. In 1-2 ml of Flow Cytometry Färbepuffers Lösung der ^2. Röhre und gründlich durch Auf- und Abpipettieren mischen.
10. Drehen, um die Zellen bei 500 · g für 5 min bei 4 ° C. A ^2. Waschschritt mit Durchflusszytometrie Färbepuffers Lösung ist optional. Resuspendieren in 500 ul Durchflusszytometrie Färbepuffers Lösung und gehen Zellen zu zählen eine Zählkammer.

5. Optional (Cell Labeling)

1. Aliquot jeder Probe für die gleiche Anzahl von Zellen. Fügen Sie den blockierenden Antikörper bei einer Verdünnung von 0,5 g pro 10 ⁶ Zellen (Anti - CD16 / CD32 FcR) und Inkubation auf Eis für 15 min.
2. Fügen Sie die gewünschte Cocktail von primären Antikörpern (konjugiert an die entsprechenden Fluorophore), die bestimmt sind gut durch den Prüfer miteinander zu arbeiten, vor den eigentlichen Experimenten. Inkubieren auf Eis für 30 min. Waschen der Zellen mit PBS.
   Hinweis: Für die Demonstration der Niere Immunzellmarkierung für dieses Manuskript verwendeten wir ein T-lymphocyte und Makrophagen / dendritischen Zellen-Panel. Die T-Lymphozyten-Panel bestand aus Fixable Viability Stain FVS510, anti-CD45 (Klon: 30-F11) BV421, Anti-Foxp3 (Klon: FJK-16s) APC, Anti-CD127 (Klon: A7R34) PE / Cy7, anti- CD44 (Klon: IM7) PerCP / Cy5.5, anti-CD4 (Klon: RM4-5) APC-Cy7, anti-CD8 (Klon: 53-6,7) BV785. Die Makrophagen-Panel bestand aus Fixable Viability Stain FVS510, anti-CD45 (Klon: 30-F11) BV421, Anti-Ly6G (Klon: 1A8) FITC, Anti-CD11b (Klon: M1 / ​​70) PerCP-Cy5.5, Anti- F4 / 80 (Klon: BM8) APC, Anti-CD11c (Klon: N418) BV785.
3. Fügen Sie den Fixable Viability Fleck und lassen auf Benchtop-5 min. Waschen Sie die Zellen mit Durchflusszytometrie Färbepuffers Lösung Überschuss der fixierbaren Viability Fleck zu entfernen.
4. In Fixierung / Permeabilisierung Reagenz und Inkubation über Nacht bei 4 ºC. Waschen Sie in Permeabilisierung Lösung.
5. Für die intrazelluläre Fleck, Block wieder mit anti-CD16 / 32 FcR 10min. Fügen Sie die intrazellulären Flecken und Inkubation für 20-30 min. Wash 2x in permeabilization Lösung.
6. Resuspendieren in Durchflusszytometrie Färbepuffers Lösung und Laufproben durch FACS - Maschine ^3,9.

Ergebnisse

Die Anzahl der Platten, die von der Anzahl der Immunzellen kann ausgeführt abhängt, die aus den Nieren zuverlässig extrahiert werden kann. Hier zeigen wir die Möglichkeit, zwei Platten zu laufen, eine für T-Lymphozyten und eine für Makrophagen / dendritischen Zellen. Auf der T-Lymphozyten - Panel, wir in der Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) Muster und beschreiben die Bevölkerung von Interesse schauen zuerst , wie in Abbildung 1 (oben links Punkt - ...

Diskussion

Wir haben hier eine Methode vorgestellt, um Immunzellen aus der Niere in einer zuverlässigen und effizienten Weise zu erhalten. Der Haupt Modifikation der weit verbreiteten Kollagenaseverdau Schritt (mechanische Zerstörung von Gewebe) spart ca. 30 min und die Isolierung einer großen Anzahl von lebensfähigen Immunzellen dauert weniger als zwei Stunden für 4 Nierenproben. Darüber hinaus abhängig von unserer Forschungsfrage, wir jetzt nur eine einzige Niere verwenden für unsere Immunzellisolierung und routinemäßi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stomacher 80 Biomaster lab system	Seward
Stomacher 80 Classic bags	Seward	BA6040/STR
Sorvall Legend XFR Centrifuge	Thermo Scientific		Or equivalent equipment
Hemocytometer	Electron Microscopy Sciences	63514-11
Analytical flow cytometer	BD LSR-X20 Fortessa
Percoll	Sigma	P1644
Dulbecco’s phosphate buffered saline 1x (DPBS)	Gibco, Life Technologies	14190-250
Polypropylene tubes, no cap	Becton Dickinson	352002
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	FVS510,  564406
Anti-CD16/32 (Clone: 93)	EBioscience	14-0161
anti-CD45 (clone: 30-F11)  BV421	BD Pharmingen	103133/4
Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC	EBioscience	17-5773
Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7	Biolegend	135013/4
anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5	Biolegend	103031/2
anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7	Biolegend	100413/4
anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785	Biolegend	100749/50
Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC	Biolegend	127605/6
Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5	Biolegend	101227/8
Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC	Biolegend	123115/6
Anti-CD11c (Clone: N418) BV785	Biolegend	117335/6
Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7	Biolegend	145705/6
Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE	Biolegend	137803/4
100 μm filter	Fisher Scientific	22363548
Fisherbrand Tubes 50 ml	Fisher		Or equivalent equipment
Fisherbrand Tubes 15 ml	Fisher		Or equivalent equipment
Sucrose	Fisher chemical	S5-3
Transfer pipette fine tip	Samco Scientific	232	Or equivalent equipment
Flow Cytometery Staining Buffer Solution	EBioscience	00-4222-26	Or equivalent equipment
1x RBC Lysis Buffer	EBioscience	00-4333-57	Or equivalent equipment