신장 면역 세포의 신뢰성 및 고효율 추출

요약

Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

초록

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.

서문

면역 시스템의 활성화는 여러 신장 질환 및 병태 생리 학적 과정 ^{6,10,11,13에서} 발생합니다. 활발한 연구 발생할 수있는 영역은 면역계의 활성화를위한 다양한 트리거들을 포함, 다양한 세포 유형과 관련된 특정 질환 속에서 사이토킨 / 케 모킨 패턴 등 특정 약물에 의한 상기 프로세스의 모두의 조절은 국소 빈혈 - 재관류에 예증 상해 (급성 신부전에 대한 모델), (6 주 이상) ⁵ 수리 또는 섬유증의 기간을 통해 유지된다 몇 시간 내에 조혈 세포 또는 CD45 ⁺ 세포 유래 면역 세포 또는 골수의 ^{증가가,가, 12.} 이들 면역 세포가 복구 ^5,12- 과정을 조율하는 염증성 및 항 염증성 사이토 카인 및 케모카인을 분비 모두. 현재, 단일 세포 현탁액으로 세포 집단 라벨을 동시에 다수의 형광체를 사용할 수있는 능력은 광고와 증가4 ~ 5 레이저와 기계 계측법 현대적인 흐름을 배출. 이것은 실질적으로 자신의 기능 상태 ^3,7에 따라 세포 집단을 구별하는 기능을 추가했습니다. F4 / 80 ^로우는 CD11b ^고 Ly6b ^높은 CD206 ^낮은 적어도 3 개의 형광체는 생균, CD45 + (백혈구) 및 Ly6G- (호중구) 및 위해 게이트에 동일한 샘플 볼륨에 필요한 것 예를 들어, 정확하게 식세포 레이블을 이것은 매우 가능한 새로운 흐름 세포 계측기 ^3입니다. 그러나, 사이토 카인의 분비, 세포 증식, 세포 독성, 대 식세포 활성화 및 림프구 및 단구의 다양한 서브 세트의 수의 정량 하류 분석법뿐만 아니라 좋은 품질 (생균, 단봉)하지만 세포의 적당한 숫자를 필요로한다.

신장에서의 면역 체계는 적응 및 선천적 부품 및 여러 세포 유형 ^1,7,13 모두 이루어진다. 예를 들어, 마우스에서 두 아이(1.4 × ¹⁰⁶ 세포) 및 이들의 약 5~15% (1,400-4,200) 절연 신장 총 면역 세포 neys 함께 2~17%를 포함하는보고 (28,000-266,000)는 CD45 ⁺ 세포는 CD4 ⁺ 세포이다 ^{한 , 5,12-.} 이 CD4 + 세포의 작은 비율 (5-15%, 70-630)는 Foxp3의 + 세포 (그림 1) ^일 수 있습니다. 때문에 (이 경우 CD45 + CD4 + Foxp3의 + 세포) 세포의 비율에서 이러한 단계 현명한 감소 관심 때로는 세포 인구 100 ~ 단순한 세포에 의해 표현된다. CD4 + CD45 + 세포 + Foxp3의 소수는 필수적 총 다수의 셀이 분리되어 상기 세포는 시토 킨 분비 분석 등 하류 연구 양질의 것으로한다. 또한, 상기 개체군은 정량 분석​​을 수행하기 위해 충분히 높은 숫자로 표현되지 않기 때문에 2-3 마우스로부터 신장을 결합 할 필요가있다. 따라서, 신장 단핵 세포 집단의 안정적이고 효율적인 분리 스터드 위해 바람직Y 신장 질환과 관련된 면역 스펙트럼.

전통적으로, 신장 단핵 세포의 분리를 위해, 연구자들은 1 ^1,5,12 DNase를 포함 콜라게나 1A 또는 II와 같은 효소 digestions 다양한 사용했다. 잘 콜라게나 최적 농도 및 배양 ^4,14,15의 기간 동안 적정을 필요로, 로트 번호와 제조 회사에 따라 다릅니다 효소 활성을 갖는 것으로 알려져있다. 또한, 콜라게나 제와 소화가 작은 조각으로 신장을 닦지 시간을 추가하여 반응을 정지 EDTA의 배양을위한 가열 (37 ℃로) 목욕 및 추가 시간에 신장 조각의 배양을 필요로한다. 또한, 이하 불임은 세포 배양을 필요로하는 일부의 하류 절차에 대해 달성 될 수있다. 더 중요한 것은, 관련 연구자 모든 변수에 따라, 그것을 실험실에 걸쳐 데이터를 해석 가변성 리드. 최근과티슈 기계 교란 / 균질 기 ^(16)의 개발은 콜라게나 제 소화 공정을 완전히 피할 ^신장이 간단한 기계적 파괴로 대체된다. 여기서, 우리는 매일 면역 세포 추출에 대한 신장 면역 세포의 분리를위한 간단하면서도 효율적인 방법을 보여줍니다. 중요한 것은,이 방법은 뇌와 간 ⁽¹⁶⁾ 등의 다른 연질 및 비 섬유 성 조직으로 구성 될 수있다.

프로토콜

수행 모든 프로토콜 단계 검토와 미주리 동물 관리 및 사용위원회의 대학 (ACUC)에 의해 승인되었다. 모든 연령에서 이론적으로 모든 설치류 실험에 사용할 수 있지만,이 프로토콜의 경우, 15주 세 남성 C57BL / 6 마​​우스를 사용 하였다. 이 비 생존 수술 때문에 안락사 방혈 및 양자 기흉에 의해 달성된다.

신장의 1 관류

참고 : 심장, 간, 신장 등 장기의 관류 데이​​터의 해석을 방해 할 수 혈액을 제거합니다. 가능하면 따라서, 우리는 항상 장기를 관류.

1. 그것은 움직이지 될 때까지 (3 ml / 분) 유도 챔버 이소 플루 란에 마우스를 놓습니다. 다음으로, 챔버에서 마우스를 제거 해부 테이블에 등쪽를 놓고 마우스 코의 이소 플루 란 콘을 배치하고 조절을 통해 1.5 ml / 분의 속도로 이소 플루 란을 누릅니다.
2. 발가락 핀치 응 답을 확인동물 마취의 수술 비행기를 달성 한 경우 핀셋 전자는 평가합니다. 식염수 복부 복부를 청소하고 가위로 복부를 열고 잘라 마우스의 왼쪽에 (수술 분야 중) 복부 장기를 밀어 넣습니다.
3. 과 하대 정맥에서 혈액을 수집 25 게이지 1 cc의 주사기에 바늘 고정 0.5M EDTA의 10 μl를 포함하는 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 추가합니다.
   참고 : 혈액의 컬렉션은 선택 사항입니다. 플라즈마 생화학 적 측정을 위해 사용될 수있다. 백혈구는 유세포 분석을 위해 사용될 수있다.
4. 가위를 사용하여, 오른쪽 심방에 작은 상처가 다음 단계에서 혈액과 PBS의 혼합물을 수 있도록 할 수 있습니다.
5. 50 CC 주사기를 타고 얼음처럼 차가운 PBS (20 ~ 30 CC)를 입력합니다. 다음, 주사기에 21 ~ 25 G 바늘을 부착 (집게 사이에 부드럽게 마음을 잡고)의 정점에서 좌심실에 구멍을 천천히 과정을 통해 인산염 완충 식염수 산도 7.4 (PBS)과 좌심실을 관류1 ~ 2 분.
   참고 : 마음이 바로 관류의 처음 몇 밀리리터에 blanches. 이 재관류이 대정맥을 통해 정맥 반환을 통해 간에서 혈액을 배출되어 있음을 나타냅니다 같이 희게의 간을 준수하십시오. 또한,이 우심실의 구멍을 나타냅니다으로 폐 주입시 확대되지 않도록해야합니다. 폐 확장한다면, 약간 뒤로 좌심실에 바늘을 철회하고 재관류를 계속합니다. 달성 안락사까지 제 절개 찍은 시간 미만이 최소 인

신장 2. 해부

1. 관류가 완료되면, 첨부 파일 (혈관, 지방과 부신) 및 소비세의 권리 신장을 해부 가위와 집게를 사용합니다.
2. 부드럽게 절단 및 포셉으로 해부하여 신장을 덮고있는 캡슐을 제거합니다. 신장의 무게를.
   참고 : 신장 무게 것은 선택 사항입니다. 그러나, 일부 실험신장 사이즈 / 조직의 그램 당 셀 수율을 정규화하기 위해 사용될 수있다 중량의 변화가 발생할 수있다.
3. 신장 무게 후, 0.5 % FBS를 포함하는 RPMI-1640 1 ㎖에 배치 또는 염색 완충 용액 세포 계측법 (50 ML 원뿔 스크류 캡 튜브를) 흐름 및 추가 사용까지 얼음에 튜브를 배치합니다.
   참고 설명의 편의상, 우리는 염색 완충액 유세포 면역 세포의 분리의 나머지를 들어 설명한다. 모두 신장 또는 신장의 1 + 1 / 3의 ^{RD (옵션)} 하류의 실험에 따라 사용될 수 있지만, 또한, 단일 신장에서의 면역 세포의 분리를 설명한다. 신장의 1/3 ^{RD 단백질} / RNA 실험에 고정 될 수 있고, 1/3 ^RD는 면역 또는 투과 전자 현미경을위한 버퍼에 배치 될 수있다.

신장의 3 균질화

1. 샘플의 식별 정보와 함께 5 내지 80 ml의 용량 균질화 백 레이블링내부 스트레이너 (STR)를 제거하고 폐기합니다. 차가운 얼음 유동 세포 계측법 염색 완충 용액의 5 ml의 가방을 채우고 버퍼에 신장을 전송합니다. 두 번째 샘플 또는 처리가 필요 이상의 샘플에 대해이 과정을 반복합니다.
2. 절반은 유동 세포 계측법 염색 완충액에 침지 신장을 가지며, 나머지 절반은 단순히 위로 절첩되도록 반으로 균질화 백 접어.
3. 조직 균질의 전원을 켜고 빠른 (설정) rpm으로 설정합니다. 하단 가장자리에 패 직면 신장과 접힌 균질화 가방을 배치하지만 가방의 하단이 패의 아래쪽 테두리 아래로 슬라이딩되지 않습니다 있는지 확인하십시오.
   1. 2 패이 있기 때문에 동시에 두 번째 샘플을 처리합니다. 120 초로 시간을 선택합니다. 패는 신장을 균질화 앞뒤로 이동 관찰한다.
      주 : 한편, 중단이 처음 두가 처리되는 동안 샘플이 더 신장 (또는 다른 조직)을 제조하는데 사용될 수있다.
   2. 균질화의 첫 번째 세트를 완료 한 후, 얼음에 가방을 전송하는 등 다음의 샘플 세트와 함께 조직 균질를 다시로드합니다. 시각적으로 신장이 충분히 균질화하고 더 큰 덩어리를 볼 수 없는지 확인합니다.
      참고 : 일반적으로, 빠른 rpm에서 조직 균질의 2 분의 신장에 적합합니다.
   3. 얼음에 50 ML 원뿔 튜브에 100 μm의 셀 스트레이너를 놓습니다. 다음으로, 셀 스트레이너로 완전하게 균질 피펫. 4 ° C에서 1 분 50 XG에서 바닥 원심 분리기를 설정하고 원심 분리기에 샘플을로드합니다.
      참고 : 원심 분리는 모든 균질 (포함하는 셀)을 셀 스트레이너를 통과 한 것을 보장합니다.
   4. 원심 분리기에서 튜브를 제거하고 얼음에 다시 배치합니다. 셀 스트레이너를 무시하고 균질을 유지합니다. 동일 부피 추가 (~ 6 mL)에 균일 한 세포 현탁액을 만들기 위해 세포 펠렛 / 상등액 피펫 위아래로 수회에 1X RBC 용해 완충액. Visua에서야 베드로, 즉시 정지 감소에 붉은 색의 일부를 관찰합니다. 최대 RBC 용해를 달성하기 위해 5 분 동안 얼음에 튜브를 남겨주세요.
      참고 : 연구자는 신장 관류 적은 세포 조작이 필요한 자신감을 경우 RBC 용해 단계를 건너 뛸 수 있습니다. 우리는 RBC 용해에 세포 현탁액을 실시하지 않음으로써 신장 세포 수율의 현저한 증가를 관찰 하였다.
   5. 5 분 세포 펠렛을 형성하도록 500 XG, 39 ° C로 설정되어있는 원심 분리기에서 튜브를 스핀.
      단계 3.6 및 3.7 동안 콜로 이달 실리카 (퍼콜)를 기반으로 밀도 구배 원심 분리 준비 :합니다.
      1. 바닥 폴리 프로필렌 튜브 라운드 10 mL를 취하여 해당 샘플 번호로 레이블과 튜브 랙에 배치합니다.
         참고 : 다음은 4 신장 샘플에 대한 충분한 밀도 구배 시약을 만드는 방법을 설명합니다.
      2. 유동 세포 계측법 염색 완충 용액 7 mL를 취하여 15 ML 원뿔 튜브로 피펫. 2 M 자당의에 1 ML을 추가0.25 M 자당을 준비합니다.
      3. 다음으로, 또 다른 15 ML 원뿔 관에 밀도 구배 시약과 피펫을 7.2 mL를 취하여. 72 %를 밀도 구배 시약 및 0.25 M 자당을 준비하는 유동 세포 계측법 염색 완충 용액 1.55 mL 및 2 M 자당의 1.25 ML을 추가합니다.
      4. 피펫 각 샘플에 대해 하나의 둥근 바닥의 폴리 프로필렌 튜브에 72 % 농도 구배 시약 1 ㎖.

   4. 그라데이션 원심 분리

   1. 단계 3.7 후, 튜브를 꺼내 부드럽게 한 부드러운 움직임에 뜨는을 가만히 따르다 또한 튜브가 거꾸로 유지되는 동안 형성 액체의 다음 드롭을 가만히 따르다.
      참고 :이 단계는 수익률의 변화를 만들 수있을만큼 밀도 구배를 변경할 수를 초과하는 액체 뒤에 남겨두고 이후 중요하다. 튜브가 수직으로 다시 설정하면 ~ 액의 200 ~ 300 μL은 세포 펠렛으로 남아있다.
   2. 피펫 조심스럽게 그러나 적극적으로 세포 펠렛 상에 0.25 M 자당 1 ml의 최대 피펫 및 브린 아래로g 균일 한 서스펜션에 세포. 다음에, 36 % 농도 구배 시약을 형성하기 위해 세포를 혼합하여 강하게 피펫 다시 1 ㎖의 72 % 밀도 구배 시약 (3.7.4)에 세포 현탁액을 추가.
   3. 폴리 프로필렌 파스퇴르 (전송) 피펫으로 72 %의 밀도 구배 시약 1 mL를 취하여. 전구의 압력도 부드럽게 세포 현탁액의 하단에 파스퇴르 피펫 (36 % 농도 구배 시약)을 삽입하고을 형성하는 72 % 농도 구배 시약을 언로드 (선단에서 액체 열을 유지하고 기포 형성을 방지) 별개의 무거운 층.
   4. 부드럽게 샘플 튜브를 선택하고이 단계 동안 실내 온도에서 원심 분리로 놓는다. 500 X g에서 20 ~ 30 분 스핀.
   5. 한편, 해당 샘플 식별자 바닥 원심 분리기 튜브의 둘레에 폴리 프로필렌의 다른 두 세트를 준비합니다.
   6. 단계 4.4이 완료된 후, 최소한의 진탕 부드럽게 폴리 프로필렌 튜브를 함유하는 샘플을 제거하고 아래로 설정할튜브 랙.
   7. 첫 번째 샘플 튜브 및 해당 빈 튜브를 선택합니다. 폴리 프로필렌 파스퇴르 피펫으로 부드럽게하지만 철저하게 측정 흡입으로, 상단 "정크 층"또는 "끈적 끈적한 물질"을 제거하고 빈 둥근 바닥 원심 분리기 튜브에 넣어.
      1. (붉은 색조 [적혈구]와 오프 화이트 나타날 수 있습니다) 도달 "버피 코트 '까지 그라데이션의 상단 부분을 제거 진행합니다. ~ 3mm의 높이가 "버피 코트"로부터 도달하면 흡인 정지.
         참고 :이 물건이 완전히 흡입을 계속하기 전에 그라데이션의 상부에서 사라 있는지 확인합니다.
   8. 신선한 파스퇴르 피펫과 신선한 둥근 바닥 원심 분리기 튜브를 타고 부드럽게 버피 코트를 제거합니다. 세포의 대부분을 수집하고 적절한 샘플 식별자와 2 ^차 새로운 둥근 바닥 튜브에 추가되도록, 버피 코트 아래 5mm - 3 흡인 계속합니다.
   9. 1-2 ml의 O를 추가F 유동 세포 계측법 염색 버퍼 2 ^{차 튜브에} 용액로 pipetting 아래로 잘 섞는다.
   10. 4 ° C에서 5 분 동안 500 XG에서 세포를 스핀 다운. 유동 세포 계측법 염색 완충 용액와 2 ^{차 세척} 단계는 선택 사항입니다. 유동 세포 계측법 염색 완충 용액 500 μL와에 재현 탁은 혈구를 사용하여 세포를 계산 진행합니다.

   5. 옵션 (셀 라벨)

   1. 동일한 수의 셀에 대한 각 샘플 Aliqout. 10 ⁶ 셀 당 0.5 μg의 (안티 CD16 / CD32 FcRγ 쇄)의 희석에 차단 항체를 추가하고 15 분 동안 얼음에 품어.
   2. 전에 실제 실험에, 연구자에 의해 서로 잘 작동하도록 결정된다 (적절한 형광 접합) 일차 항체의 원하는 칵테일을 추가합니다. 30 분 동안 빙상에서 인큐베이션. PBS로 세포를 씻으십시오.
      참고 :이 원고에 대한 신장 면역 세포 라벨의 데모를 들어, 우리는 T-LY 사용mphocyte 및 대 식세포 / 수지상 세포 패널. BV421, 안티 Foxp3의 (클론 : FJK-16) APC, 안티 CD127 (클론 : A7R34) 다음 T 림프구 패널 고칠 생존 얼룩 FVS510, 항 CD45 (30-F11 클론)로 구성 PE / Cy7, 안티 CD44 (클론 : IM7)를 PerCP / Cy5.5, 안티 - CD4 (클론 : RM4-5) APC-Cy7, 안티 - CD8 (클론 : 53-6.7) BV785. BV421, 안티 Ly6G (클론 : 1A8) FITC, 안티 CD11b를 (클론 : M1 /​​ 70)를 PerCP-Cy5.5, 안티 : 대 식세포 패널 고칠 생존 얼룩 FVS510, 항 CD45 (30-F11 복제) 구성 F4 / 80 (클론 : BM8) APC, 안티의 CD11c (클론 : N418) BV785.
   3. 고 정부 생존 얼룩을 추가하고 5 분 동안 벤치 위에 둡니다. 고 정부 생존 얼룩 초과를 제거하는 유동 세포 계측법 염색 완충 용액으로 세포를 씻으십시오.
   4. 고정 / Permeabilization 시약을 추가하고 4 ºC에서 밤새 품어. permeabilization 용액에 세척 할 것.
   5. 세포 내 얼룩의 경우, 10 분 동안 항 CD16 / 32 FcRγ 쇄 다시 차단합니다. 세포 내 얼룩을 추가하고 20 ~ 30 분 동안 품어. 체육의 워시 2 배rmeabilization 솔루션입니다.
   6. FACS 시스템 ^3.9을 통해 유동 세포 계측법 염색 버퍼 솔루션 및 실행 샘플을 Resuspend.

결과

실행될 수있는 패널들의 수를 확실하게 신장에서 추출 될 수 면역 세포의 수에 의존한다. 여기서, 우리는이 패널, T 림프구 용 및 대 식세포 / 수지상 세포를 실행할 수있는 능력을 입증한다. T 림프구 패널에서, 우리는 먼저 앞으로 분산 형 (FSC)와 사이드 분산 형 (SSC) 패턴을보고 그림 1 (왼쪽 상단 도트 플롯)과 같이 관심의 인구를 묘사. 다음에, 생존 마커,이 ?...

토론

우리는 여기에서 안정적이고 효율적으로 신장에서의 면역 세포를 얻을 수있는 방법을 제시 하였다. 널리 사용되는 콜라겐 분해 공정 (조직의 기계적인 파괴)에 대한 주요 변경은 약 30 분 동안 저장하고, 가능한 면역 세포의 다수의 분리 4 신장 샘플 하에서 2 시간 걸린다. 또한, 연구의 질문에 따라, 우리는 이제 하나의 신장을 사용하는 우리의 면역 세포 분리를위한 (다른 신장은 웨스턴 블랏, PCR?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stomacher 80 Biomaster lab system	Seward
Stomacher 80 Classic bags	Seward	BA6040/STR
Sorvall Legend XFR Centrifuge	Thermo Scientific		Or equivalent equipment
Hemocytometer	Electron Microscopy Sciences	63514-11
Analytical flow cytometer	BD LSR-X20 Fortessa
Percoll	Sigma	P1644
Dulbecco’s phosphate buffered saline 1x (DPBS)	Gibco, Life Technologies	14190-250
Polypropylene tubes, no cap	Becton Dickinson	352002
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	FVS510,  564406
Anti-CD16/32 (Clone: 93)	EBioscience	14-0161
anti-CD45 (clone: 30-F11)  BV421	BD Pharmingen	103133/4
Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC	EBioscience	17-5773
Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7	Biolegend	135013/4
anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5	Biolegend	103031/2
anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7	Biolegend	100413/4
anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785	Biolegend	100749/50
Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC	Biolegend	127605/6
Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5	Biolegend	101227/8
Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC	Biolegend	123115/6
Anti-CD11c (Clone: N418) BV785	Biolegend	117335/6
Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7	Biolegend	145705/6
Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE	Biolegend	137803/4
100 μm filter	Fisher Scientific	22363548
Fisherbrand Tubes 50 ml	Fisher		Or equivalent equipment
Fisherbrand Tubes 15 ml	Fisher		Or equivalent equipment
Sucrose	Fisher chemical	S5-3
Transfer pipette fine tip	Samco Scientific	232	Or equivalent equipment
Flow Cytometery Staining Buffer Solution	EBioscience	00-4222-26	Or equivalent equipment
1x RBC Lysis Buffer	EBioscience	00-4333-57	Or equivalent equipment