הפקת יעילות אמינה גבוהה של תאים מכליות חיסון

Summary

Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

Abstract

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.

Introduction

הפעלת מערכת חיסונית מתרחשת מחלות כליה מרובות ותהליכי pathophysiological ^6,10,11,13. אזורים מסוכנים של מחקר פעיל להקיף את טריגרים שונים עבור הפעלת המערכת החיסונית, סוגי תאים שונים מעורבים, דפוס ציטוקינים / chemokine באווירה מחלה מסוימת, אפנון של כל התהליכים הנ"ל על ידי תרופה מסוימת וכו 'כדי להדגים, ב-רה-פרפוזיה איסכמיה פציעה (מודל אי-ספיקת כליות חריפה), יש עלייה בתאי המערכת החיסונית או מח עצם שמקורם בתאי hematopoietic או CD45 ⁺ תאים בתוך כמה שעות, הנסמך דרך תקופת תיקון או סיסטיק (לימים 6 שבועות) ^{5, 12.} תאים חיסוניים אלו מפרישים הן פרו-דלקתיים ואנטי-דלקתי ציטוקינים chemokines לתזמר את תהליך תיקון ^5,12. נכון לעכשיו, את היכולת להשתמש fluorophores המרובה בו זמנית לתייג אוכלוסיות תאי השעית תא בודדת גדלה עם המודעהפורקן של זרימה המודרנית cytometry מכונה מארבעה עד חמישה לייזרים. זו הוסיפה משמעותית את היכולת להפלות אוכלוסיות תאים בהתבסס על המצב התפקודי שלהם ^3,7. לדוגמה, כדי לתייג מקרופאג בצורה מדויקת ככל F4 / 80 ^נמוך CD11b ^גבוהה Ly6b ^גבוהה CD206 ^נמוך, לפחות עוד 3 fluorophores יהיה צורך במדגם נפח זהה לשער עבור תאים חיים, CD45 + (לויקוציטים) ו Ly6G- (נויטרופילים) ו זה מאוד אפשרי עם cytometers התזרים החדש ^3. עם זאת, המבחנים במורד הזרם עבור הפרשת ציטוקינים, התפשטות תאים, cytotoxicity, הפעלת מקרופאג כימות של מספרים של תת השונה של לימפוציטים ומונוציטים לא רק צריכים באיכות טובה (תאי חיים, singlets) אבל מספר הולם של תאים.

המערכת החיסונית בכליות מורכבת משני רכיבים אדפטיבית מולד סוגי תאים מרובים ^1,7,13. לדוגמא, בעכברים שני הילדneys יחד מדווח להכיל 2-17% (28,000-266,000) CD45 ⁺ תאים של תאי חיסון הכוללות כליות המבודדות (1.4 x 10 ⁶ תאים) וכ 5-15% (1,400-4,200) אלה הם CD4 ⁺ תאי ^{1 , 5,12.} אחוז קטן (5-15%, 70-630) של CD4 + אלה התאים FoxP3 + תאים (איור 1) ^1. בשל הפחתות החכמות צעד אלה באחוזים של תאים, לפעמים אוכלוסיית עניין התא (במקרה זה CD45 + CD4 + FoxP3 + תאים) מיוצג על ידי גרידא ~ 100 תאים. המספר הקטן של CD45 + CD4 + FoxP3 + תאים עושה את זה הכרחי כי מספר גדול של תאים הכוללים מבודדים התאים הם באיכות טובה ללימודים במורד כגון מבחני הפרשת ציטוקינים. יתר על כן, ייתכן שיהיה צורך לשלב כליות מעכברים 2-3 מאז subpopulations אינם מיוצגים במספרים גבוהים מספיק כדי לבצע מבחנים לכימות. לפיכך, בידוד אמין ויעיל של אוכלוסיות תאים mononuclear כליות רצוי כדי הרבעהy הספקטרום אימונולוגיים הקשורים למחלות כליה.

באופן מסורתי, לבידוד תרמי של תאים mononuclear בכליות, החוקרים השתמשו במגוון של digestions האנזימטית כגון collagenase 1A או II כולל DNase 1 ^1,5,12. עובדה ידועה היא כי יש collagenases הפעילות האנזימטית משתנה עם הרבה מספרים ועל ידי חברה של ייצור, דבר המחייב טיטרציה עבור הריכוז האופטימלי ומשך הדגירה ^4,14,15. בנוסף, מערכת העיכול עם collagenase מוסיף זמן וקוצצים את הכליה לחתיכות קטנות, מחייבת הדגירה של חתיכות כליות באמבט מחוממת (37 מעלות צלזיוס) ואת זמן נוסף הדגירה EDTA להפסקת התגובה. בנוסף, פחות סטריליות עשויים להיות מושגת על כמה נהלים במורד צורך תרבית תאים. יתרה מכך, בהתאם החוקר וכל המשתנים המעורבים, זה מוביל השתנות נתונים ופרשנות על פני מעבדות. לאחרונה, עםפיתוח משבשי רקמה המכאני / homogenizers ^16, צעד עיכול collagenase הוא נמנע לחלוטין ובמקומו הפרעה מכאנית פשוטה של הכליות ^2. בזאת, אנחנו מדגימים שיטה פשוטה אך יעילה עבור הבידוד של תאים חיסוניים כלית עקירות תא חיסון היומיום. חשוב לציין, טכניקה זו ניתן להתאים רקמות רכות והלא-סיביות אחרות כגון כבד ומוח ^16.

Protocol

כל הצעדים פרוטוקול ביצע היו נבדקה ואושרה על ידי אוניברסיטת טיפול בבעלי חיים מיזורי ועדת שימוש (ACUC). עבור פרוטוקול זה, זכר C57Bl / 6 עכברים בני 15 שבועות נוצלו אמנם תיאורטית כל מכרסם בכל גיל יכול לשמש בניסויים. מאז, זה הוא ניתוח שאינו הישרדות, המתת חסד מושגת על ידי exsanguination ו pneumothorax בין שתי המדינות.

זלוף 1. של הכליות

הערה: זלוף של איברים כמו לב, כבד וכליות מסיר את הדם אשר עלולים להפריע הפרשנות של נתונים. לפיכך, אם אפשר אנחנו תמיד perfuse האיברים.

1. מניחים את העכבר בתוך isoflurane (3 מ"ל / דקה) תא אינדוקציה עד שזה נייח. בשלב הבא, להסיר את העכבר מתוך החדר, ולהניח אותה dorsally על שולחן הניתוח והמקום חרוט isoflurane על האף העכבר ולדחוף isoflurane בשיעור של 1.5 מ"ל / דקה דרך הרגולטור.
2. בדוק את respons קמצוץ הבוהןדואר עם פינצטה כדי להעריך אם החיה השיגה מטוס של הרדמה כירורגית. נקו את הבטן הגחון עם מליחים לחתוך את הבטן עם מספריים לדחוף את אברי הבטן (מתוך בתחום כירורגית) אל הצד השמאלי של העכבר.
3. איסוף דם מן הווריד הנבוב נחות עם מד 25-קבוע מחט מזרק 1 סמ"ק ולהוסיף אותו צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge המכיל 10 μl של 0.5M EDTA.
   הערה: אוסף של דם הוא אופציונלי. פלזמה ניתן להשתמש למדידות ביוכימיים. לויקוציטים ניתן להשתמש עבור מבחני cytometry הזרימה.
4. בעזרת מספריים, לעשות חתך קטן הפרוזדורים זכות לאפשר את התערובת של דם PBS מהשלב הבא.
5. קח מזרק 50 סמ"ק ולמלא עם PBS קר כקרח (20-30 סמ"ק). לאחר מכן, לצרף מחט G 21-25 על המזרק, לנקב את החדר השמאלי בשיא גודלה היחסי (תוך כדי לחיצה על הלב בעדינות בין מלקחיים) ולאט לאט perfuse החדר השמאלי עם pH בופר פוספט 7.4 (PBS) במשךשל 1-2 דקות.
   הערה: הלב מייד מחוויר על המ"ל של זלוף הראשון. שים הכבד לצורך לבן, כמו זו מצביעה על כך זלוף ניקוז דם מתוך הכבד באמצעות החזר ורידי דרך הווריד הנבוב. בנוסף, לוודא כי הריאות הם אינם מרחיבים במהלך העירוי כמו זה מציין לנקב של החדר הימני. אם הריאות היו להתרחב, לשלוף את המחט מעט לאחור לתוך החדר השמאלי ולהמשיך זלוף. הזמן שלוקח מן החתך הראשון עד המתת חסד מושגת הוא פחות מ -2 דקות

Dissection 2. של הכליות

1. לאחר זלוף תושלם, השתמש מספריים מלקחיים לנתח בכליה הימנית מן ונספחיו (כלי דם, שומן ובלוטות יותרת הכליה) ובלו.
2. הוצא בעדינות את הקפסולה כיסוי הכליה ידי גזירה לנתח עם מלקחיים. לשקול את הכליה.
   הערה: שקילת הכליה היא אופציונלית. עם זאת, כמה ניסוייםעלול לגרום לשינוי גודל כליה / משקל אשר עשוי לשמש כדי לנרמל תשואת תא לגרם של רקמות.
3. לאחר שקילת כליות, למקם אותו 1 מ"ל של RPMI-1640 המכיל FBS 0.5% או cytometry זרימה פתרון חיץ מכתים (צינור מתברג חרוטי 50 מ"ל) והמקום צינור על הקרח עד לשימוש נוסף.
   הערה: על מנת להקל על התיאור, נתאר את שאר בידוד של תאים חיסוניים זרימת cytometry פתרון חיץ מכתים. בנוסף, נתאר בידוד של תאים חיסוניים כליה אחת, אם כי שתי הכליות או 1 + 1/3 ^rd של הכליות ניתן להשתמש בהתאם הניסויים במורד הזרם (לא חובה). 1/3 ^rd של הכליה יכול להיות קפוא לניסויים חלבון / RNA ו- 1/3 ^rd ניתן להציב מאגרים עבור במיקרוסקופ אלקטרונים אימונוהיסטוכימיה או שידור.

המגון 3. כליות

1. לייבל שקית המגון קיבולת 5-80 מ"ל עם פרטי זיהוי מדגם,להסיר את המסננת בפנים (STR) וזורק אותו. מלא את השקית עם 5 מיליליטר של קרח קר cytometry זרימת פתרון מכתים הצפה ולהעביר כליות למאגר. חזור על תהליך זה למדגם שני או יותר דגימות כי צריך עיבוד.
2. מקפלים את השקית המגון לשניים, כאלה שחצי אחד יש את הכליה שקוע בפתרון מכתים הצפת cytometry זרימה ואת החצי השני הוא מקופל פשוט על זה.
3. הפעל את homogenizer רקמות ולהגדיר אותו מהר סל"ד (הגדרה). מניח את שקית המגון המקופלת עם הכליות מול ההנעה, קרובה לקצה התחתון אבל לוודא את החלק התחתון של השקיות אין לרדת אל מתחת לגבול התחתון של המשוטים.
   1. לעבד המדגם השני בו זמנית שכן ישנם 2 משוטים. בחר זמן כמו 120 שניות. שימו לב משוטים לנוע קדימה ואחורה כדי homogenize הכליות.
      הערה: בינתיים, השבתה זו ניתן להשתמש כדי להכין 2 כליות יותר (או רקמות אחרות) דגימות בעוד השניים הראשונים מעבדים.
4. לאחר שסיים עם סט של הומוגניזציה ראשון, להעביר את השקיות לקרח וטען מחדש את homogenizer הרקמות עם הסדרה הבאה של דגימות וכן הלאה. ראייה להבטיח כי הכליות הן הומוגני כראוי ולא נתחים גדולים גלויים.
   הערה: באופן כללי, 2 דקות בתוך homogenizer רקמות בסל"ד מהר היא נאותה עבור הכליה.
5. מניחים מסננת תא 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל על הקרח. הבא, פיפטה homogenate לחלוטין על מסננת התא. גדר בצנטריפוגה רצפה 50 XG דקות 1 ב 4 ° C ו לטעון את הדגימות לתוך צנטריפוגות.
   הערה: צנטריפוגה יבטיח שכל homogenate (התאים המכילים) עברו דרך מסננת התא.
6. הסר את הצינורות מתוך צנטריפוגה ומניח אותם בחזרה על קרח. מחק את מסננות תא ולשמור את homogenate. להוסיף נפח שווה (~ 6 מ"ל) של חיץ תמוגה 1x RBC אל התא גלולה / supernatant ו פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי לעשות השעיה תא אחיד. Visually, להתבונן חלק הצבע האדום בירידת ההשעיה מיידית. השאירו את הצינורות על קרח למשך 5 דקות כדי להשיג תמוגה RBC מקסימלית.
   הערה: צעד תמוגה RBC ניתן לדלג אם החוקר הוא בטוח של זלוף כליות מניפולצית תא פחות היא רצויה. ראינו עלייה משמעותית בתשואה תא כליות בכך שלא להעמיד את ההשעיה תא תמוגה RBC.
7. ספין צינורות בצנטריפוגה כי הוגדרה 500 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי ליצור תא גלולה.
   הערה: במהלך שלבים 3.6 ו -3.7, להתכונן סיליקה colloidal (Percoll) צנטריפוגה שיפוע צפיפות מבוססת.
   1. קח 10 מיליליטר עגול צינורות פוליפרופילן תחתונים ומדביק תוויות עם מספרי מדגם מקבילים ומניח אותם מתלים צינור.
      הערה: להלן תיאור איך לעשות ריאגנטים שיפוע צפיפות מספיק ל -4 דגימות כליות.
   2. קח 7 מ"ל של cytometry זרימה פתרון מכתים הצפת פיפטה אותו לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. הוסף 1 מ"ל של 2 M סוכרוזלהכין 0.25 M סוכרוז.
   3. לאחר מכן, לקחת 7.2 מ"ל של ריאגנט מפל צפיפויות פיפטה אותו לתוך 15 מ"ל צינור אחר חרוטי. להוסיף 1.55 מ"ל של cytometry זרימה פתרון מכתים הצפת 1.25 מ"ל של 2 M סוכרוז להכין 72% מגיב צפיפות שיפוע 0.25 M סוכרוז.
   4. פיפטה 1 מ"ל של ריאגנט שיפוע צפיפות 72% לתוך צינור פוליפרופילן אחד עגול התחתונה עבור כל דגימה.

4. צנטריפוגה שיפוע

1. לאחר שלב 3.7, לקחת את הצינורות החוצה בעדינות למזוג supernatant בתנועה אחת חלקה גם למזוג הטיפה הבאה של נוזל המהווה תוך הצינור מוחזק במהופך.
   הערה: שלב זה חשוב מאז והותיר אחריו נוזל עודף יכול לשנות את שיפוע הצפיפות מספיק כדי ליצור וריאציה בתשואות. כאשר הצינור מוגדר בחזרה זקוף, ~ 200-300 μl של נוזל נשאר עם תא גלולה.
2. פיפטה 1 מ"ל של 0.25 M סוכרוז על תא גלולה בעדינות אך בתקיפות פיפטה מעלה ומטה כדי בריןg לתאי השעיה אחידה. לאחר מכן, להוסיף את ההשעיה תא 1 מ"ל ריאגנט שיפוע צפיפות 72% (3.7.4) ושוב פיפטה במרץ לערבב את התאים כדי ליצור מגיב שיפוע צפיפות 36%.
3. קח 1 מ"ל של מגיב שיפוע צפיפות 72% לתוך פיפטה פוליפרופילן פסטר (העברה). עם לחץ גם על הנורה (שומר על העמודה הנוזלת בקצה ומונע היווצרות בועה), הכנס את פיפטה פסטר לתחתית השעית התא (מגיב שיפוע צפיפות 36%) בעדינות ולפרוק מגיבים שיפוע צפיפות 72% כדי ליצור שכבת כבד ברורה.
4. פיק דוגמיות בעדינות ומניחים לתוך צנטריפוגות, שהוא בטמפרטורת החדר למשך שלב זה. ספין במשך 20-30 דקות ב g 500 x.
5. בינתיים מכין עוד שני סטים של פוליפרופילן עגול צינורות צנטריפוגה בתחתית עם מזהי מדגם המקבילים.
6. לאחר שלב 4.4 יושלם, להסיר את המדגם המכיל צינורות פוליפרופילן בעדינות, עם רעד מינימאלי ולהגדיר אותו למטהעל מתלה צינור.
7. תרים את צינור הדגימה הראשון שפופרת הריקה המתאימה לו. עם טפטפת פוליפרופילן פסטר, בעדינות אך ביסודיות עם שאיבה נמדדת, להסיר את "שכבת זבל" העליונה או "חומר דביק" והכניס אותו לתוך הצינור צנטריפוגות תחתי העגול הריק.
   1. המשך הסרת החלק העליון של שיפוע עד "מעיל באפי" הוא הגיע (עשוי להופיע מחוץ לבן עם גוון אדמדם [תאי הדם האדומים]). עצור שאיבת אם לגובה של ~ 3 מ"מ הוא הגיע מן "מעיל באפי".
      הערה: ודא כי החומר הזה נעלם לחלוטין מהחלק העליון של השיפוע לפני שתמשיך יניקה.
8. קח פיפטה פסטר טרי צינור צנטריפוגות תחתית עגול טרי בעדינות להסיר את המעייל באפים. המשך כדי לשאוב 3 - 5 מ"מ מתחת מעיל באפי, על מנת להבטיח כי רוב התאים נאספים והוסיף אל הצינור התחתון ה -2 ^nd חדש עם מזהה מדגם המתאים.
9. להוסיף 1-2 מ"ל of cytometry זרימה מכתים הצפת הפתרון הצינור 2 ^nd ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה.
10. ספין למטה התאים ב XG 500 עבור 5 דקות ב 4 ° C. צעד לשטוף 2 ^nd עם פתרון חיץ מכתים cytometry זרימה הוא אופציונלי. Resuspend ב 500 μl של פתרון cytometry זרימה מכתים הצפת והמשך לספור תאים באמצעות hemocytometer.

5. אופציונלי (תיוג תא)

1. Aliqout כל דגימה עבור אותו מספר של תאים. מוסיפים את הנוגדן חסימת בדילול של 0.5 מיקרוגרם לכל 10 ⁶ תאים (CD16 אנטי / CD32 FCR) דגירה על קרח למשך 15 דקות.
2. מוסיפים את קוקטייל הרצוי של נוגדנים ראשוניים (מצומדות כדי fluorophores המתאים) אשר נקבעים לעבוד היטב אחד עם השני על ידי החוקר, לפני הניסויים בפועל. דגירה על קרח למשך 30 דקות. שוטפים את התאים עם PBS.
   הערה: ההפגנה של תיוג תא חיסון כלית כתב היד הזה, השתמשנו T-lymphocyte ולוח תא מקרופאג / הדנדריטים. הפאנל T-לימפוציטים כללה FVS510 הכתם הכדאיות ניתן לתקן, אנטי CD45 (שיבוט: 30-F11) BV421, אנטי-Foxp3 (Clone: ​​FJK-16s) APC, אנטי-CD127 (Clone: ​​A7R34) PE / Cy7, אנטי CD44 (Clone: ​​IM7) PerCP / Cy5.5, אנטי CD4 (Clone: ​​RM4-5) APC-Cy7, אנטי CD8 (Clone: ​​53-6.7) BV785. פנל מקרופאג כלל FVS510 כתם הכדאיות ניתן לתקן, אנטי CD45 (שיבוט: 30-F11) BV421, אנטי-Ly6G (Clone: ​​1A8) FITC, אנטי-CD11b (Clone: ​​M1 / ​​70) PerCP-Cy5.5, Anti- F4 / 80 (Clone: ​​BM8) APC, אנטי CD11c (Clone: ​​N418) BV785.
3. מוסיף את כתם הכדאיות ניתן לתקן ולהשאיר על-גבי ספסל למשך 5 דקות. שוטפים את התאים עם פתרון מכתים הצפת cytometry זרימה כדי להסיר עודפי של Stain הכדאיות ניתן לתקן.
4. הוסף מגיב קיבוע / Permeabilization דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף בתמיסת permeabilization.
5. עבור כתם תאי, לחסום שוב עם אנטי CD16 / 32 FCR עבור 10min. מוסיפים את כתמי תאיים דגירה במשך 20-30 דקות. 2x לשטוף PEפתרון rmeabilization.
6. Resuspend ב cytometry זרימה מכתים מאגר דגימות פתרון וברח דרך FACS מכונת ^3,9.

תוצאות

מספר פאנלים שניתן להפעיל תלוי במספר של תאי מערכת החיסון שניתן להפיק באופן אמין מן הכליות. בזאת, אנחנו מדגימים את היכולת להפעיל 2 לוחות, אחד עבור לימפוציטים מסוג T ואחד מקרופאגים / תאים דנדריטים. בלוח T-לימפוציטים, אנחנו נסתכל קודם כל על פיזור קדימה (FSC) ?...

Discussion

הצגנו כאן מתודולוגיה להשיג תאים חיסוניים מהכליה באופן אמין ויעיל. השינוי המרכזי לשלב עיכול collagenase בשימוש הנרחב (הפרעה מכאנית של רקמה) חוסך כ -30 דקות והבידוד של מספר רב של תאי קיימא חיסוניים לוקח פחות משעות עבור 4 דגימות כליות. יתר על כן, בהתאם שאלת המחקר שלנו, אנחנו עכשי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stomacher 80 Biomaster lab system	Seward
Stomacher 80 Classic bags	Seward	BA6040/STR
Sorvall Legend XFR Centrifuge	Thermo Scientific		Or equivalent equipment
Hemocytometer	Electron Microscopy Sciences	63514-11
Analytical flow cytometer	BD LSR-X20 Fortessa
Percoll	Sigma	P1644
Dulbecco’s phosphate buffered saline 1x (DPBS)	Gibco, Life Technologies	14190-250
Polypropylene tubes, no cap	Becton Dickinson	352002
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	FVS510,  564406
Anti-CD16/32 (Clone: 93)	EBioscience	14-0161
anti-CD45 (clone: 30-F11)  BV421	BD Pharmingen	103133/4
Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC	EBioscience	17-5773
Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7	Biolegend	135013/4
anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5	Biolegend	103031/2
anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7	Biolegend	100413/4
anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785	Biolegend	100749/50
Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC	Biolegend	127605/6
Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5	Biolegend	101227/8
Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC	Biolegend	123115/6
Anti-CD11c (Clone: N418) BV785	Biolegend	117335/6
Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7	Biolegend	145705/6
Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE	Biolegend	137803/4
100 μm filter	Fisher Scientific	22363548
Fisherbrand Tubes 50 ml	Fisher		Or equivalent equipment
Fisherbrand Tubes 15 ml	Fisher		Or equivalent equipment
Sucrose	Fisher chemical	S5-3
Transfer pipette fine tip	Samco Scientific	232	Or equivalent equipment
Flow Cytometery Staining Buffer Solution	EBioscience	00-4222-26	Or equivalent equipment
1x RBC Lysis Buffer	EBioscience	00-4333-57	Or equivalent equipment