Böbrek Bağışıklık Hücreleri Güvenilir ve Yüksek Verimlilik Ekstraksiyon

Özet

Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

Özet

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.

Giriş

Bağışıklık sistemi aktivasyonu çoklu böbrek hastalıkları ve patofizyolojik süreçlerde ^6,10,11,13 oluşur. aktif bir araştırma için potansiyel alanlar, bağışıklık sistemi aktivasyonu için çeşitli tetikleyiciler kapsayan, çeşitli hücre türleri dahil, belirli bir hastalık ortamda sitokin / kemokin desen gibi, belirli bir ilaç tarafından bahsedilen işlemlerin tümünü modülasyonu iskemi-reperfüzyon olarak, Örnek vermek gerekirse, yaralanma (akut böbrek hasarı için bir model), (6 hafta sonra) ⁵ tamir veya fibrozis dönem boyunca sürekli bir kaç saat içinde hematopoietik hücreleri ya da CD45 ⁺ hücrelerinden oluşan bağışıklık hücreleri veya kemik iliği içinde bir artış ^{vardır, 12.} Bu bağışıklık hücreleri, tamir ^5,12 işlemini düzenlemek için pro-enflamatuar ve anti-inflamatuar sitokinler ve kemokinler, hem salgılar. Şu anda, tek bir hücre süspansiyonu hücre popülasyonlarının etiket aynı anda birden fazla fluorophores kullanma yeteneği reklamla arttıdört beş lazerler ile makinelerin sitometri, modern akış havalandırma. Bu büyük ölçüde onların fonksiyonel durumu ^3,7 dayalı hücre popülasyonlarının ayrımcılık yeteneği ekledi. F4 / 80, ^düşük CD11b ^yüksek Ly6b ^{yüksek CD206, düşük,} en az 3 fazla flüoroforlar canlı hücreler, CD45 + (lökositler) ve Ly6G- (nötrofiller) ve bulunmaktadır kapısı aynı numune hacmi içindeki gerekli olacaktır Örneğin, doğru bir makrofaj etiket Bu çok mümkün yeni akış sitometrelerinde ³ beraberdir. Ancak, sitokin salgılanması, hücre proliferasyonu, sitotoksisite, makrofaj aktivasyonu ve lenfositlerin ve monositlerin çeşitli alt kümeleri sayısı ölçümü için alt deneyler sadece kaliteli (canlı hücreleri, tekli), fakat hücrelerinin yeterli sayılarda gerekmektedir.

Böbrek bağışıklık sistemi adaptif ve bileşenleri ve birden fazla hücre tipleri ^1,7,13 hem oluşur. Örneğin farelerde, iki çocuk(1.4 x 10 ⁶ hücre) ve bunların yaklaşık% 5-15 (1,400-4,200) izole edilmiş toplam böbrek bağışıklık hücrelerinin Neys birlikte 2-17% içerdiği rapor edilmiştir (28,000-266,000) CD45 ⁺ hücreleri, CD4 ⁺ hücreleri ¹ olan ^{, 5,12.} Bu CD4 + hücrelerinin küçük bir yüzdesi (% 5-15, 70-630) FoxP3 + hücreleri (Şekil 1) ¹ vardır. Nedeniyle (bu durumda CD45 + CD4 + FoxP3 + hücrelerinde) hücrelerin yüzdelerinde, bu adım adım azalmalar, ilgi konusu zaman hücre popülasyonuna 100 ° sadece hücreler tarafından temsil edilmektedir. CD45 + CD4 + FoxP3 + hücrelerinin az sayıda zorunludur toplam hücrelerin çok sayıda izole edilir ve hücreler, sitokin salgılama tahlillerinde alt-çalışmalar için iyi kalitede olmasını sağlar. Ayrıca, subpopülasyonunun ölçülebilir deneyleri gerçekleştirmek için yeterince yüksek sayıda temsil edilmemektedir çünkü 2-3 farelerin böbrek birleştirmek gerekebilir. Bu nedenle, böbrek mononükleer hücre popülasyonlarının güvenilir ve etkin izolasyon damızlık için arzu ediliry böbrek hastalıkları ile ilişkili immünolojik spektrum.

Geleneksel olarak, böbrek mononükleer hücrelerin izolasyonu için, araştırmacılar, bu DNase 1 ^1,5,12 içeren kolajenaz 1A veya II gibi enzimatik sindirim çeşitli kullandık. İyi kollajenazlar uygun konsantrasyon ve inkübasyon ^4,14,15 süresince titrasyonu zorunludur, lot numaraları ve imalat şirketi tarafından değişir enzimatik etkinliğe sahip olduğu bilinmektedir. Buna ek olarak, kollajenaz ile sindirim küçük parçalar halinde böbrek kıyma zaman ekler, reaksiyonun durdurulması için EDTA inkübasyon için ısıtılmış (37 ° C) banyo ve ek süre böbrek parçalarının inkübasyon gerektirmektedir. Buna ek olarak, daha az steril hücre kültürü ihtiyaç duyan bir alt işlemler için elde edilebilir. Daha da önemlisi, ilgili araştırmacı ve tüm değişkenlere bağlı olarak, bu laboratuarlar arasında veri ve yorumlanması değişkenlik yol açar. Son zamanlarda, ilemekanik doku bozucular / homojenizatör ¹⁶ geliştirilmesi, kolajenaz sindirimi aşama tamamen kaçınılması ve böbrekler ² basit bir mekanik bozulma ile değiştirilir. Bu yazıda, gündelik bağışıklık hücre ekstraksiyon için böbrek bağışıklık hücrelerinin izolasyonu için basit ama etkili bir yöntem ortaya koymaktadır. Önemli olarak, bu teknik, örneğin karaciğer ve beyin ¹⁶ gibi diğer yumuşak ve lifsiz dokular adapte edilebilir.

Protokol

gerçekleştirilen tüm protokol adımları gözden ve Missouri Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi (ACUC) tarafından onaylanmıştır. herhangi bir yaşta herhangi bir teorik kemirgen deneyleri için de kullanılabilir, ancak bu protokol için, 15 haftalık, erkek C57BL / 6 fareleri kullanılmıştır. Bu bir hayatta olmayan cerrahi olduğu için, ötenazi kan kaybından ve bilateral pnömotoraks ile sağlanır.

Böbrekler 1. perfüzyon

Not: kalp, karaciğer ve böbrek gibi organların Perfüzyon verilerin yorumlanması ile engel olabilir kanı temizler. Mümkünse Bu nedenle, biz her zaman organlar serpmek.

1. o hareketsiz kadar (3 ml / dak) indüksiyon odası, bir izofluran fare yerleştirin. Sonra, odanın dışında fare kaldırmak diseksiyon masaya dorsal yattı ve fare burun üzerinde izofluran koni yerleştirin ve regülatör ile 1.5 ml / dk hızında izofluran itin.
2. ayak tutam tepk kontrolhayvan anestezi cerrahi uçağı elde etti ise cımbız ile e değerlendirmek. tuzlu su ile ventral karın temizleyin ve makas ile karın kesip açmak ve farenin sol tarafına (cerrahi alanı dışında kalan) karın organları itin.
3. ile inferior vena kava kan toplayın 25 gauge 1 cc şırınga iğne sabit ve 0.5M EDTA 10 ul içeren bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp ekleyin.
   Not: Kan Toplama isteğe bağlıdır. Plazma biyokimyasal ölçümler için de kullanılabilir. Lökositler akış sitometri deneyleri için kullanılabilmektedir.
4. makas kullanarak, sağ atriyum küçük bir kesim sonraki adımda kan ve PBS karışımı izin yapmak.
5. 50 cc şırınga alın ve buz soğukluğunda PBS (20-30 cc) ile doldurun. Sonra, bir şırınga için 21-25 G iğne takılır (forseps ile yavaşça kalp tutarken) tepe noktası, sol ventrikül delinerek yavaş boyunca fosfat tamponlu tuz, pH 7.4 (PBS) ile sol ventrikül serpmek1-2 dk.
   Not: Kalp hemen perfüzyon ilk birkaç mililitre üzerine blanches. Bu perfüzyon vena kava yoluyla venöz dönüş yoluyla karaciğer kanı drene olduğunu gösterir gibi, haşlama için karaciğer gözlemleyin. Buna ek olarak, bu sağ ventrikül patlağı gösterir gibi akciğer infüzyon sırasında genişleyen değil emin olun. akciğerler genişletmek için olsaydı, biraz geri sol ventrikül içine iğne çekilme ve perfüzyon devam edin. elde edilir ötanazi kadar ilk kesi alınan zaman az 2 dk

Böbrekler 2. Diseksiyon

1. perfüzyon tamamlandıktan sonra, ekleri (kan damarları, yağ ve adrenal bezler) ve tüketim sağ böbrek incelemek için makas ve forseps kullanabilir.
2. Yavaşça kesme ve forseps ile diseksiyon ile böbrek kaplayan kapsülü kaldırın. böbrek tartılır.
   Not: böbrek Tartı isteğe bağlıdır. Bununla birlikte, bazı deneylerBöbrek boyutu / doku gramı başına hücre verimi normalize etmek için kullanılabilmektedir ağırlık değişikliği ile sonuçlanabilir.
3. böbrek Tartıldıktan sonra,% 0.5 FBS ihtiva eden RPMI-1640 içinde 1 ml koyun veya lekelenme tampon çözeltisi sitometrisi (50 ml konik vidalı kapaklı tüp) akar ve daha sonra kullanılmak kadar buz üzerinde tüp yerleştirin.
   Not: açıklaması kolaylığı, biz boyama tampon çözelti flow sitometri bağışıklık hücrelerinin izolasyonu kalan anlatacağız için. Her iki böbrek veya böbrek 1 + 1/3 ^Rd (isteğe bağlı) alt deneylere bağlı olarak kullanılabilmesine rağmen ek olarak, tek bir böbrekten bağışıklık hücrelerinin izolasyonu anlatacağız. Böbrek 1/3 ^üçüncü protein / RNA deneyler için dondurulmuş olabilir ve 1/3 ^rd immünohistokimya veya transmisyon elektron mikroskobu için tamponlar içinde yerleştirilebilir.

Böbrekler 3. Homojenizasyon

1. örnek tanımlama bilgileri içeren bir 5-80 ml kapasiteli homojenizasyon çanta Etiket,iç süzgeci (STR) kaldırmak ve atın. buz Sitometrisi lekeleme tampon maddesi çözeltisi, 5 ml torbayı doldurmak tampona böbrek aktarın. İkinci numune veya işleme ihtiyaç daha fazla örnek için bu işlemi tekrarlayın.
2. bir yarım Akış Sitometri lekeleme tampon maddesi çözeltisi içine daldırılmış böbrek, diğer yarısı ise sadece üzerine katlanır, böylece, devre homojenleştirme torba katlayın.
3. Doku homojenleştirici açın ve hızlı (ayar) rpm olarak ayarlayın. alt kenarına yakın raket karşı karşıya böbrek katlanmış homojenizasyon çantası yerleştirin ama çanta alt uç kürekler alt sınırının altında kayan olmadığından emin olun.
   1. 2 kürek olduğu gibi aynı zamanda ikinci örnek işleyin. 120 sn olarak süreyi seçin. kürekler böbrekler homojenize için ileri ve geri hareket gözlemleyin.
      Not: Bu arada, bu kesinti ilk iki işlem sırasında örnekleri 2 fazla böbrek (veya başka doku) hazırlamak için kullanılabilir.
4. homojenizasyon birinci seti ile tamamladıktan sonra, buz torbaları aktarmak ve böylece bir sonraki numune seti ve doku homojenleştirici yükleyin. Görme böbrekler yeterince homojenize ve hiçbir büyük parçalar görünür olduğundan emin olun.
   Not: Genellikle, hızlı rpm'de doku homojenleştiricisi içinde 2 dakika böbrek için yeterlidir.
5. buz üzerinde 50 ml konik tüp içine 100 mikron hücre süzgeç yerleştirin. Sonra, hücre süzgecinden tamamen üzerinde Homojenat pipetle. 4 ° C de 1 dakika 50 xg bir taban santrifüj ayarlamak ve santrifüj örnekleri yükleyin.
   Not: Santrifüj Tüm homojenat (ihtiva eden hücreler) bir hücre süzgecinden geçirildi olduğunu garanti eder.
6. santrifüj tüpleri çıkarın ve buz üzerinde geri koyun. Hücre süzgeçler atın ve Homojenat tutun. eşit miktarda ekleyin (~ 6 mi) üniform bir hücre süspansiyonu yapmak için hücre peleti / yüzer tabakanın ve pipet ve aşağı yukarı birkaç kez 1 x RBC parçalama tamponu. visuaLly hemen süspansiyon azalma kırmızı rengin bazı gözlemleyin. Maksimum RBC parçalama elde etmek için 5 dakika boyunca buz üzerinde tüpler bırakın.
   Not: Araştırmacı böbrek perfüzyon ve daha az hücre manipülasyonu istenen emindir ise RBC parçalama adım atlanabilir. Biz RBC lizis hücre süspansiyonu tabi değil tarafından böbrek hücre veriminde önemli bir artış gözlemledik.
7. 5 dakika bir hücre tanesinin oluşturulması için 500 x g'de, 4 ° C olarak ayarlandı santrifüj tüpleri dönerler.
   Adımlar 3.6 ve 3.7 sırasında koloidal silika (Percoll) tabanlı yoğunluk gradyan santrifüj hazırlamak Not:.
   1. alt polipropilen tüpler yuvarlak 10 ml alın ve ilgili örnek numaraları ile onları etiketlemek ve bir tüp rafa koyun.
      Not: Aşağıdaki 4 böbrek örnekleri için yeterli yoğunluk gradyan reaktifler yapmak açıklamaktadır.
   2. Sitometrisi Boyama Tampon çözeltisi 7 ml alın ve bir 15 ml konik tüp içine pipetle. 2 M sükroz, 1 ml ilave edilir0.25 M sukroz hazırlar.
   3. Sonra, başka bir 15 ml konik tüp içine yoğunluk gradyan reaktif ve pipet bunu 7.2 ml alır. % 72 yoğunluk gradyan reaktif ve doğrudan 0.25 M sükroz hazırlamak Sitometrisi lekeleme tampon maddesi çözeltisi 1.55 mi, 2 M sukroz, 1.25 ml ilave edilir.
   4. Pipet her bir örnek için bir yuvarlak dipli polipropilen tüpe% 72 yoğunluk gradyan ayıracı 1 ml.

4. dereceli santrifüj

1. Adım 3.7 sonra tüpleri almak ve yavaşça tek bir hareketle yavaşça süpernatant süzün ve ayrıca tüp baş aşağı tutulurken oluşturan sıvının bir sonraki damla süzün.
   Not: Bu adım verimleri varyasyon oluşturmak için yeterli yoğunluk gradiyenti değiştirebilirsiniz aşırı sıvı geride bırakarak beri önemlidir. Tüp dik geri ayarlandığında, ~ sıvı 200-300 ul hücre pelet ile kalır.
2. Pipet ve yavaşça ama kuvvetlice hücre pelet üzerine 0.25 M sükroz 1 ml yukarı pipet ve Brin aşağıg muntazam süspansiyonuna hücreleri. Sonra,% 36 yoğunluk gradyan maddesi oluşturmak için hücreleri karıştırmak için şiddetle pipetle bir kez daha 1 ml% 72 yoğunluk gradyan reaktifi (3.7.4) hücre süspansiyonu ekleyin ve.
3. polipropilen Pasteur (transfer) pipet içine% 72 yoğunluk gradyan reaktif 1 ml alın. ampul bile basınç, yavaşça hücre süspansiyonu altına Pasteur pipeti (% 36 yoğunluk gradyan reaktif) eklemek ve bir oluşturmak için% 72 yoğunluk gradyan reaktifi boşaltın (ucunda sıvı sütunu tutar ve kabarcık oluşumunu engeller) farklı ağır tabaka.
4. yavaşça numune tüpleri almak ve bu aşama için, oda sıcaklığında bir santrifüj içine yerleştirin. 500 x g'de 20-30 dakika süreyle Spin.
5. Bu arada, gelen örnek tanıtıcı ile alt santrifüj tüpleri yuvarlak polipropilen başka iki takım hazırlamak.
6. Adım 4.4 tamamlandıktan sonra, en az çalkalanarak yavaşça polipropilen tüpler içeren örneği kaldırmak ve aşağı ayarlayınTüp raf.
7. İlk örnek tüp ve ilgili boş tüp Pick up. Bir polipropilen Pasteur pipeti ile nazikçe ama iyice ölçülen emme ile üst "önemsiz katmanı" veya "yapışkan malzeme" kaldırmak ve boş yuvarlak dipli santrifüj tüpüne koyun.
   1. (Kırmızımtırak bir renk [kırmızı kan hücreleri] off-beyaz görünebilir) ulaşıldığında "buffy coat" kadar degrade üst kısmını kaldırarak devam edin. ~ 3 mm yükseklik "buffy coat" ulaşılır ise emiş durdurun.
      Not: Bu malzeme tamamen emme devam etmeden önce degrade üst kısmından gitti olduğundan emin olun.
8. taze Pasteur pipet ve taze bir yuvarlak dipli santrifüj tüpü alın ve yavaşça buffy coat çıkarın. Hücrelerin en toplanmış ve uygun numune tanımlayıcı ile ^2. yeni yuvarlak dipli tüpe eklenir sağlamak için, buffy coat altında 5 mm - 3 emme devam ediyor.
9. 1-2 ml o Eklef Sitometrisi Boyama Tampon ^2. tüp çözüm ve yukarı ve aşağı pipetleme ile iyice karıştırın.
10. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 xg'de hücreleri dönerler. Sitometrisi Boyama Tampon çözeltisi ile ^2. yıkama adım isteğe bağlıdır. Sitometrisi Boyama Tampon çözeltisinin 500 ul ve yeniden süspanse hemasitometre kullanarak hücreleri saymak geçin.

5. İsteğe bağlı (Hücre Etiketleme)

1. hücrelerin aynı sayıda, her numune Aliqout. 10 ⁶ hücre başına 0.5 ug (anti-CD16 / CD32 FcR) bir seyreltme bloke antikor ilave edin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
2. önce gerçek deneyler, araştırmacı tarafından birbirleri ile iyi çalışması için belirlenir (uygun fluorophores konjuge) primer antikorlar istenen kokteyl ekleyin. 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Hücrelerin PBS ile yıkayın.
   Not: Bu yazının böbrek bağışıklık hücre etiketleme gösteri için, T-ly kullanılanmphocyte ve makrofaj / dendritik hücre paneli. BV421, Anti-Foxp3 (Clone: ​​FJK-16'lar) APC, Anti-CD127 (Klon: A7R34): T-lenfosit paneli tamir edilebilir Canlılık Leke FVS510, anti-CD45 (30-F11 klonu) oluşuyordu PE / Cy7, anti CD44 (Klon: IM7) PerCP / Cy5.5, anti-CD4 (klon: RM4-5) APC-Cy7, anti-CD8 (Klon: 53-6,7) BV785. BV421, Anti-Ly6G (Klon: 1A8) FITC, anti-CD11 b (Klon: M1 / ​​70) PerCP-Cy5.5, Anti: makrofaj paneli tamir edilebilir Canlılık Leke FVS510, anti-CD45 (30-F11 klonu) oluşuyordu F4 / 80 (Klon: BM8) APC, anti-CD11c (Klon: N418) BV785.
3. Fixable Canlılık Leke ekleyin ve 5 dakika boyunca tezgah üstünde bırakın. Fixable Canlılık Stain fazlalığını ortadan kaldırmak için Sitometrisi Boyama Tampon çözeltisi ile hücreleri yıkayın.
4. Sabitleme / Permeabilization reaktif ekleyin ve 4 ºC de gece inkübe edin. permeabilizasyon çözeltisi içinde yıkanır.
5. hücre içi leke, 10 dakika süreyle, anti-CD16 / 32 FCR ile tekrar engeller. hücre içi lekeleri ekleyin ve 20-30 dakika inkübe edilir. pe yıkayın 2xrmeabilization çözeltisi.
6. FACS makine ^3,9 ile Sitometrisi Boyama Tampon çözümü ve çalışma örneklerinde süspanse.

Sonuçlar

çalıştırılabilir panel sayısı güvenilir böbrekler üzerinden elde edilebilir bağışıklık hücrelerinin sayısına bağlıdır. Bu yazıda, 2 panel, T-lenfositlerinin için ve makrofajlar / dendritik hücreler için bir çalıştırma yeteneğini göstermek. T-lenfosit panelinde, ilk forward scatter (FSC) ve yan dağılım (SSC) şekline bakmak ve Şekil 1 (sol üst nokta arsa) 'de gösterildiği gibi ilgi nüfusu tasvir. Daha sonra, bir canlılık markö...

Tartışmalar

Biz burada güvenilir ve verimli bir şekilde böbrek bağışıklık hücreleri elde etmek için bir metodoloji sunduk. Yaygın olarak kullanılan kolajenaz sindirimi aşama (doku mekanik tahrip) başlıca modifikasyonu yaklaşık 30 dk tasarruf sağlar ve uygun bir bağışıklık hücreleri, çok sayıda yalıtım 4 Böbrek örnekleri için iki saatten az sürer. Ayrıca, bizim araştırma sorusu bağlı olarak, şimdi tek bir böbrek kullanmak bağışıklık hücre izolasyonu için (diğer böbrek Western lekeleri,...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stomacher 80 Biomaster lab system	Seward
Stomacher 80 Classic bags	Seward	BA6040/STR
Sorvall Legend XFR Centrifuge	Thermo Scientific		Or equivalent equipment
Hemocytometer	Electron Microscopy Sciences	63514-11
Analytical flow cytometer	BD LSR-X20 Fortessa
Percoll	Sigma	P1644
Dulbecco’s phosphate buffered saline 1x (DPBS)	Gibco, Life Technologies	14190-250
Polypropylene tubes, no cap	Becton Dickinson	352002
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	FVS510,  564406
Anti-CD16/32 (Clone: 93)	EBioscience	14-0161
anti-CD45 (clone: 30-F11)  BV421	BD Pharmingen	103133/4
Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC	EBioscience	17-5773
Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7	Biolegend	135013/4
anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5	Biolegend	103031/2
anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7	Biolegend	100413/4
anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785	Biolegend	100749/50
Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC	Biolegend	127605/6
Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5	Biolegend	101227/8
Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC	Biolegend	123115/6
Anti-CD11c (Clone: N418) BV785	Biolegend	117335/6
Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7	Biolegend	145705/6
Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE	Biolegend	137803/4
100 μm filter	Fisher Scientific	22363548
Fisherbrand Tubes 50 ml	Fisher		Or equivalent equipment
Fisherbrand Tubes 15 ml	Fisher		Or equivalent equipment
Sucrose	Fisher chemical	S5-3
Transfer pipette fine tip	Samco Scientific	232	Or equivalent equipment
Flow Cytometery Staining Buffer Solution	EBioscience	00-4222-26	Or equivalent equipment
1x RBC Lysis Buffer	EBioscience	00-4333-57	Or equivalent equipment