Affidabile e di alta efficienza di estrazione del rene cellule immunitarie

Riepilogo

Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

Abstract

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.

Introduzione

Attivazione del sistema immunitario si verifica in molteplici malattie renali e processi fisiopatologici ^6,10,11,13. Potenziali aree di ricerca attiva comprendono vari inneschi per l'attivazione del sistema immunitario, vari tipi cellulari coinvolti, il pattern di citochine / chemochine in una particolare impostazione di malattia, la modulazione di tutti i processi sopra menzionati un particolare farmaco ecc Per esemplificare, in ischemia-riperfusione lesioni (un modello di danno renale acuto), vi è un aumento delle cellule immuni o di midollo osseo derivate cellule ematopoietiche o cellule CD45 ⁺ in poche ore, che è sostenuto attraverso il periodo di riparazione o fibrosi (6 settimane dopo) ^{5, 12.} Queste cellule immunitarie secernono entrambe le citochine e chemochine pro-infiammatorie e anti-infiammatori per orchestrare il processo di riparazione ^5,12. Attualmente, la possibilità di utilizzare più fluorofori contemporaneamente etichettare popolazioni di cellule in una sospensione singola cella è aumentata con l'annunciosfiato di flusso moderna citometria a macchine con quattro o cinque laser. Ciò ha sostanzialmente aggiunto alla capacità di discriminare le popolazioni cellulari in base al loro stato funzionale ^3,7. Ad esempio, per etichettare con precisione un macrofago come F4 / 80 ^{basso alto alto} CD206 CD11b Ly6b ^basso, almeno altre 3 fluorofori sarebbe necessaria nello stesso volume del campione alla porta per le cellule vive, CD45 + (leucociti) e Ly6G- (neutrofili) e questo è molto possibile con il più recente flusso Citometri ^3. Tuttavia, i saggi a valle per la secrezione di citochine, proliferazione cellulare, citotossicità, attivazione dei macrofagi e la quantificazione del numero di vari sottoinsiemi di linfociti e monociti non ha bisogno solo di buona qualità (cellule vive, canottiere) ma un numero adeguato di cellule.

Il sistema immunitario nel rene è costituito da due componenti adattivi e innate e più tipi di cellule ^1,7,13. Ad esempio, nei topi due kidneys insieme sono segnalati per contenere 2-17% (28,000-266,000) CD45 ⁺ cellule delle cellule immunitarie renali totale isolate (1,4 x 10 ⁶ cellule) e circa il 5-15% (1,400-4,200) di queste sono cellule CD4 ^{+ 1 , 5,12.} Una piccola percentuale (5-15%, 70-630) di queste cellule CD4 + sono FOXP3 cellule + (Figura 1) ^1. A causa di queste passo saggio riduzioni percentuali di cellule, a volte la popolazione di cellule (in questo caso CD45 + CD4 + FoxP3 + cellule) è rappresentato da una semplice ~ 100 cellule. Il piccolo numero di FOXP3 cellule CD45 + CD4 + + rende imperativo che un gran numero di cellule totali sono isolati e le cellule sono di buona qualità per gli studi a valle, come test di secrezione di citochine. Inoltre, può essere necessario combinare reni da 2-3 topi poiché le sottopopolazioni non sono rappresentati in numero sufficientemente elevate per eseguire saggi quantificabili. Pertanto, l'isolamento affidabile ed efficiente di popolazioni di cellule mononucleate rene è auspicabile per vite prigionieray lo spettro immunologica associata a malattie renali.

Tradizionalmente, per l'isolamento delle cellule mononucleari del rene, i ricercatori hanno utilizzato una varietà di digestioni enzimatiche quali 1A collagenasi o II compreso DNasi 1 ^1,5,12. È ben noto che collagenasi hanno attività enzimatica che varia con numeri di lotto e per società di produzione, che richiede la titolazione per la concentrazione ottimale e durata dell'incubazione ^4,14,15. Inoltre, la digestione con collagenasi aggiunge tempo per tritare il rene in piccoli pezzi, necessita incubazione dei pezzi rene in un bagno riscaldato (37 ° C) ed il tempo supplementare per incubazione in EDTA per fermare la reazione. Inoltre, meno sterilità può essere ottenuto ad alcune procedure valle necessitano coltura cellulare. Ancora più importante, a seconda del ricercatore e tutte le variabili coinvolte, porta alla variabilità dei dati e l'interpretazione di tutti i laboratori. Recentemente, con lasviluppo di meccanici tessuto Disgregatori / omogeneizzatori ^16, la fase di collagenasi digestione viene completamente evitato e sostituito da un semplice distruzione meccanica dei reni ^2. Qui, dimostriamo un metodo semplice ma efficace per l'isolamento delle cellule immunitarie di rene per tutti i giorni estrazioni cellule immunitarie. È importante sottolineare che questa tecnica può essere adattato ad altri tessuti molli e non fibrose come il fegato e il cervello ^16.

Protocollo

Tutte le fasi del protocollo eseguiti sono stati esaminati e approvati dalla University of Missouri cura degli animali e del Comitato uso (ACUC). Per questo protocollo, maschi C57BL / 6 topi di età compresa tra 15 settimane sono stati utilizzati anche se teoricamente qualsiasi roditore a qualsiasi età può essere utilizzato per gli esperimenti. Poiché questo è un intervento chirurgico non-sopravvivenza, l'eutanasia si ottiene dissanguamento e pneumotorace bilaterale.

1. perfusione dei reni

Nota: perfusione di organi come cuore, fegato e reni di rimuovere il sangue, che possono interferire con l'interpretazione dei dati. Quindi, se possibile, abbiamo sempre perfusione degli organi.

1. Posizionare il mouse in un isoflurano (3 ml / min) camera di induzione fino a che è immobile. Quindi, rimuovere il mouse fuori della camera, si trovava dorsalmente sul tavolo anatomico e posizionare il cono isoflurano sul naso mouse e spingere isoflurano alla velocità di 1,5 ml / min attraverso il regolatore.
2. Controllare i respons punta pinche con una pinzetta per valutare se l'animale ha raggiunto un aereo chirurgico di anestesia. Pulire la parte ventrale con soluzione salina e tagliare aprire l'addome con le forbici e spingere gli organi addominali (fuori del campo chirurgico) al lato sinistro del mouse.
3. Prelevare il sangue dalla vena cava inferiore con una calibro 25 ago fissato ad una siringa da 1 cc e aggiungerlo a una provetta da 1,5 ml contenente 10 ml di 0,5 M EDTA.
   Nota: raccolta di sangue è opzionale. Il plasma può essere utilizzato per misurazioni biochimiche. I leucociti possono essere utilizzati per le prove citometria di flusso.
4. Utilizzando le forbici, fare un piccolo taglio negli atri giuste per far uscire la miscela di sangue e PBS dal passo successivo.
5. Prendere una siringa da 50 cc e riempire con ghiacciata PBS (20-30 cc). Quindi, fissare un ago G 21-25 alla siringa, forare il ventricolo sinistro al suo apice (tenendo delicatamente cuore tra il forcipe) e profumato lentamente il ventricolo sinistro con tampone fosfato pH 7,4 (PBS) nel corsodi 1-2 min.
   Nota: Il cuore blanches immediatamente dopo i primi millilitri di perfusione. Osservare il fegato per scottare, in quanto questo indica che la perfusione sta prosciugando il sangue dal fegato attraverso ritorno venoso attraverso la vena cava. Inoltre, assicurarsi che i polmoni non sono in espansione durante l'infusione, come indica la puntura del ventricolo destro. Se i polmoni erano per espandere, estrarre l'ago leggermente indietro nel ventricolo sinistro e continuare la perfusione. Il tempo impiegato dalla prima incisione fino eutanasia viene raggiunto è inferiore a 2 min

2. La dissezione di reni

1. Dopo la perfusione è completa, usare le forbici e pinze per sezionare il rene destro dai suoi allegati (i vasi sanguigni, grassi e dalle ghiandole surrenali) e accise.
2. Rimuovere delicatamente la capsula che copre il rene tagliando e sezionando con una pinza. Pesare il rene.
   Nota: Pesatura il rene è opzionale. Tuttavia, alcuni esperimentipuò provocare cambiamenti nella dimensione / peso che può essere utilizzato per normalizzare quantità di cellule per grammo di tessuto renale.
3. Dopo aver soppesato il rene, metterlo in 1 ml di RPMI-1640 contenente 0,5% FBS o citometria a flusso soluzione tampone colorazione (50 ml vite conica tubo cap) e posizionare il tubo in ghiaccio fino a un ulteriore uso.
   Nota: Per comodità di descrizione, si descriverà il resto l'isolamento delle cellule immunitarie nella citometria a flusso soluzione tampone colorazione. Inoltre, descriveremo isolamento delle cellule immunitarie di singolo rene, anche se entrambi i reni o 1 + 1/3 ^° dei reni possono essere utilizzate a seconda delle esperimenti a valle (opzionale). ^1/3 del rene potrebbe essere congelato per proteine ​​esperimenti / RNA e ^1/3 può essere collocato in buffer per la microscopia immunoistochimica o trasmissione di elettroni.

3. omogeneizzazione dei reni

1. Etichettare un sacchetto capacità di omogeneizzazione 5-80 ml con informazioni di identificazione del campione,rimuovere il filtro interno (STR) e gettarlo. Riempire la borsa con 5 ml di soluzione ghiacciata Citometria a flusso di colorazione tampone e trasferire rene al buffer. Ripetere questa procedura per un secondo campione o più campioni che necessitano di trattamento.
2. Piegare il sacchetto omogeneizzazione a metà, in modo tale che una metà ha rene immerso nella soluzione citometria a flusso Staining Buffer e l'altra metà è semplicemente ripiegato su di esso.
3. Accendere l'omogeneizzatore tessuti e impostarlo su veloce (impostazione) rpm. Posizionare il sacchetto omogeneizzazione piegata con il rene fronte alla pala, in prossimità del bordo inferiore ma verificare che l'estremità inferiore dei sacchi non sono scorrevoli sotto del bordo inferiore delle pale.
   1. Elaborare il secondo campione simultaneamente come ci sono 2 pale. Selezionare il tempo come 120 sec. Osservare le pale si muovono avanti e indietro per omogeneizzare i reni.
      Nota: Nel frattempo, questo tempo di inattività può essere utilizzato per preparare più 2 di rene (o di altri tessuti) campioni, mentre i primi due sono l'elaborazione.
4. Dopo aver completato con la prima serie di omogeneizzazione, trasferire i sacchi in ghiaccio e ricaricare l'omogeneizzatore tessuto con il successivo gruppo di campioni, e così via. Visivamente in modo che i reni sono adeguatamente omogeneizzato e non pezzi di grandi dimensioni sono visibili.
   Nota: In generale, 2 min in omogeneizzatore tessuto a regime veloce è sufficiente per il rene.
5. Posizionare un colino cella di 100 micron in tubo da 50 ml su ghiaccio. Successivamente, pipetta la omogenato completamente al colino cella. Impostare una centrifuga pavimento a 50 xg per 1 min a 4 ° C e caricare i campioni nella centrifuga.
   Nota: La centrifugazione farà in modo che tutti i omogenato (contenenti cellule) è passato attraverso il filtro delle cellule.
6. Rimuovere i tubi dalla centrifuga e metterli di nuovo sul ghiaccio. Eliminare i filtri delle cellule e mantenere l'omogeneizzato. Aggiungere volume uguale (~ 6 ml) di tampone di lisi 1x RBC al pellet / surnatante e pipetta su e giù diverse volte per fare una sospensione cellulare uniforme. Visually, osservare alcuni del colore rosso nella diminuzione della sospensione immediatamente. Lasciare i tubi in ghiaccio per 5 minuti per ottenere la massima lisi RBC.
   Nota: la fase di lisi RBC può essere saltato se il ricercatore è convinto della perfusione renale e meno manipolazione cellulare si desidera. Abbiamo osservato un significativo aumento della resa delle cellule renali non assoggettando la sospensione cellulare RBC lisi.
7. Spin le provette nella centrifuga che è stata impostata a 500 xg, a 4 ° C per 5 minuti per formare un pellet di cellule.
   Nota: Durante le fasi 3.6 e 3.7, prepararsi per silice colloidale (Percoll) basato gradiente di densità centrifugazione.
   1. Prendere 10 ml tondi tubi di polipropilene fondo e li etichetta con il numero di campioni corrispondenti e metterli in un rack tubo.
      Nota: La seguente descrive come rendere abbastanza reagenti gradiente di densità per i 4 campioni renali.
   2. Prendere 7 ml di soluzione di Citometria a flusso di colorazione tampone e pipetta in un tubo da 15 ml. Aggiungere 1 ml di 2 M saccarosiopreparare 0,25 M di saccarosio.
   3. Avanti, prendere 7,2 ml di reagente gradiente di densità e pipetta in un altro tubo da 15 ml. Aggiungere 1,55 ml di soluzione di Citometria a flusso di colorazione tampone e 1,25 ml di 2 M di saccarosio per preparare 72% del reagente gradiente di densità e 0,25 M di saccarosio.
   4. Pipettare 1 ml di 72% di reagente gradiente di densità in un unico turno tubo di polipropilene fondo per ogni campione.

4. centrifugazione in gradiente

1. Dopo il punto 3.7, prendere i tubi fuori e delicatamente decantare il surnatante in un unico movimento fluido e anche decantare il prossimo goccia di liquido che si forma mentre il tubo viene tenuto a testa in giù.
   Nota: questo passaggio è importante poiché lasciando dietro di liquido in eccesso può cambiare il gradiente di densità sufficiente a creare variazioni dei rendimenti. Quando il tubo viene arretrato in posizione verticale, ~ 200-300 microlitri di liquido rimane con il pellet di cellule.
2. Pipettare 1 ml di 0,25 M di saccarosio sul pellet e delicatamente ma vigorosamente a pipetta su e giù per Bring le cellule ad una sospensione uniforme. Successivamente, aggiungere la sospensione cellulare a 1 ml 72% di reagente gradiente di densità (3.7.4) e ancora una volta pipettare energicamente per miscelare le cellule a formare un reagente gradiente di densità 36%.
3. Prendere 1 ml del reagente gradiente di densità 72% in un Pasteur (trasferimento) pipetta polipropilene. Con una pressione sul bulbo (mantiene la colonna di liquido nella punta e previene la formazione di bolle), inserire la pipetta Pasteur al fondo della sospensione cellulare (36% reagente gradiente di densità) delicatamente e scaricare il reagente gradiente di densità 72% per formare un distinta strato più pesante.
4. Raccogliere i tubi campione delicatamente e inserire nella centrifuga, che è a temperatura ambiente per questo passaggio. Spin per 20-30 minuti a 500 x g.
5. Nel frattempo, preparare un altro due serie di polipropilene rotondo provette da centrifuga inferiori con gli identificatori di esempio corrispondenti.
6. Dopo il punto 4.4, rimuovere il campione contenente tubi di polipropilene con delicatezza, con un minimo di agitazione e metterlo giùsul portaprovette.
7. Sollevare il primo tubo campione e il suo tubo vuoto corrispondente. Con una pipetta Pasteur in polipropilene, delicatamente ma accuratamente con aspirazione misurata, rimuovere il "livello spazzatura" superiore o "materiale appiccicoso" e metterlo nel tubo fondo centrifuga rotondo vuoto.
   1. Procedere rimuovendo la parte superiore del gradiente fino alla "buffy coat" viene raggiunto (potrebbe apparire off-bianco con una sfumatura rossastra [globuli rossi]). Arrestare l'aspirazione se un'altezza di ~ 3 mm, è raggiungibile dalla "buffy coat".
      Nota: Assicurarsi che questa roba è completamente sparito dalla parte superiore della sfumatura prima di continuare a aspirazione.
8. Prendere una pipetta Pasteur fresco e un tubo tondo fondo centrifuga fresca e rimuovere delicatamente il buffy coat. Continuare ad aspirazione 3 - 5 mm al di sotto del buffy coat, al fine di garantire che la maggior parte delle cellule sono raccolti e aggiunti al tubo 2 ^° nuovo fondo tondo con identificativo campione adeguato.
9. Aggiungere 1-2 ml osoluzione f Citometria a flusso di colorazione tampone al tubo 2 ^° e mescolare accuratamente pipettando su e giù.
10. Centrifugare le cellule a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Una fase di lavaggio 2 ^° con la soluzione tampone di Citometria a flusso di colorazione è opzionale. Risospendere in 500 ml di soluzione di Citometria a flusso di colorazione tampone e procedere per contare le cellule utilizzando un emocitometro.

5. Opzionale (Cell etichettatura)

1. Aliqout ogni campione per lo stesso numero di celle. Aggiungere l'anticorpo bloccante alla diluizione di 0,5 g per 10 ⁶ cellule (anti CD16 / CD32 FcR) e incubare su ghiaccio per 15 min.
2. Aggiungere il cocktail desiderato di anticorpi primari (coniugati con fluorofori appropriate) che sono determinati a lavorare bene con l'altro dallo sperimentatore, prima degli esperimenti attuali. Incubare in ghiaccio per 30 min. Lavare le cellule con PBS.
   Nota: Per la dimostrazione del rene etichettatura delle cellule immunitarie per questo manoscritto, abbiamo utilizzato una T-lymphocyte e un pannello a celle macrofagi / dendritiche. Il pannello di linfociti T consisteva fissabile vitalità Stain FVS510, anti-CD45 (clone: ​​30-F11) BV421, anti-Foxp3 (Clone: ​​FJK-16s) APC, anti-CD127 (Clone: ​​A7R34) PE / Cy7, anti- CD44 (clone: ​​IM7) PerCP / Cy5.5, anti-CD4 (Clone: ​​RM4-5) APC-Cy7, anti-CD8 (Clone: ​​53-6,7) BV785. Il pannello era costituito da macrofagi fissabile vitalità Stain FVS510, anti-CD45 (clone: ​​30-F11) BV421, Anti-Ly6G (Clone: ​​1A8) FITC, anti-CD11b (Clone: ​​M1 / ​​70) PerCP-Cy5.5, Anti- APC, anti-CD11c (Clone: ​​N418): / 80 (BM8 Clone) F4 BV785.
3. Aggiungere il fissabile Viabilità Stain e lasciare sul banco per 5 min. Lavare le cellule con una soluzione di Citometria a flusso di colorazione tampone per rimuovere l'eccesso del fissabile Viabilità Stain.
4. Aggiungere Fixation / reagenti permeabilizzazione ed incubare una notte a 4 ° C. Lavare in soluzione permeabilizzazione.
5. Per macchia intracellulare, bloccare di nuovo con l'anti-CD16 / 32 FcR per 10 minuti. Aggiungere le macchie intracellulari e incubare per 20-30 minuti. Lavare 2x in PEsoluzione rmeabilization.
6. Risospendere in campioni di soluzioni ed eseguire Citometria a flusso di colorazione buffer tramite FACS macchina ^3,9.

Risultati

Il numero di pannelli che possono essere eseguiti dipende dal numero di cellule immunitarie che possono essere estratti in modo affidabile dai reni. Qui, dimostriamo la capacità di eseguire 2 pannelli, uno per i linfociti T e uno per i macrofagi / cellule dendritiche. Sul pannello dei linfociti T, dobbiamo prima guardare al forward scatter (FSC) e side scatter modello (SSC) e delineare la popolazione di interesse come mostrato in Figura 1 (dot plot in alto a sinistra). ...

Discussione

Abbiamo presentato qui un metodo per ottenere cellule immunitarie dal rene in modo affidabile ed efficiente. La modifica principale al passaggio digestione collagenasi ampiamente utilizzato (rottura meccanica del tessuto) risparmiare circa 30 min e l'isolamento di un gran numero di cellule immunitarie vitali richiede meno di due ore per 4 campioni renali. Inoltre, a seconda della nostra domanda di ricerca, ora usiamo un solo rene (l'altro rene può essere utilizzato per l'analisi delle proteine ​​da West...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stomacher 80 Biomaster lab system	Seward
Stomacher 80 Classic bags	Seward	BA6040/STR
Sorvall Legend XFR Centrifuge	Thermo Scientific		Or equivalent equipment
Hemocytometer	Electron Microscopy Sciences	63514-11
Analytical flow cytometer	BD LSR-X20 Fortessa
Percoll	Sigma	P1644
Dulbecco’s phosphate buffered saline 1x (DPBS)	Gibco, Life Technologies	14190-250
Polypropylene tubes, no cap	Becton Dickinson	352002
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	FVS510,  564406
Anti-CD16/32 (Clone: 93)	EBioscience	14-0161
anti-CD45 (clone: 30-F11)  BV421	BD Pharmingen	103133/4
Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC	EBioscience	17-5773
Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7	Biolegend	135013/4
anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5	Biolegend	103031/2
anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7	Biolegend	100413/4
anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785	Biolegend	100749/50
Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC	Biolegend	127605/6
Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5	Biolegend	101227/8
Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC	Biolegend	123115/6
Anti-CD11c (Clone: N418) BV785	Biolegend	117335/6
Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7	Biolegend	145705/6
Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE	Biolegend	137803/4
100 μm filter	Fisher Scientific	22363548
Fisherbrand Tubes 50 ml	Fisher		Or equivalent equipment
Fisherbrand Tubes 15 ml	Fisher		Or equivalent equipment
Sucrose	Fisher chemical	S5-3
Transfer pipette fine tip	Samco Scientific	232	Or equivalent equipment
Flow Cytometery Staining Buffer Solution	EBioscience	00-4222-26	Or equivalent equipment
1x RBC Lysis Buffer	EBioscience	00-4333-57	Or equivalent equipment