الطبقات الجيني التركيبات: منصة لالمشارك ثقافة بالسكان خلية غير المتجانسة

Summary

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

Abstract

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Introduction

الضغط الحاملة الأنسجة مثل الغضاريف المفصلية أو الأقراص الفقرية تتكون من مناطق الأنسجة غير المتجانسة التي تعتبر بالغة الأهمية لكلا ظيفة النشاط الحيوي ومناسبة والميكانيكية تنبيغ في الأنسجة. ليس فقط هو تنظيم الخلوية وظيفة متميزة في مختلف المناطق، ولكن تباينت مصفوفات خارج الخلية (ECM) أيضا في تكوين وتنظيم. على سبيل المثال، والغضروف المفصلي يتكون من ثلاث مناطق رئيسية مع اختلاف شكل الخلية، وظيفة الميكانيكية، وECM. الاختلافات في المبادرة ECM لالتفاضلية المسؤوليات الحاملة. وتشارك الطبقة السطحية في المقام الأول ردا الشد لتحميل، في حين أن المناطق الوسطى وعميقة مسؤولة أساسا للاستجابة لضغط ^1. وبالمثل، في القرص الفقري، وحاصرت النواة اللبية هلامية من التليف رقائقي بالطوق والخلايا داخل هذه المناطق متميزة اثنين من تجربة أنواع مختلفة من المحفزات الطبيعية الحيوية2. في هذا النوع من الأنسجة والخلايا ومصفوفات خارج الخلية داخل طبقات الأنسجة تتفاعل مع بعضها البعض كما يخضع الأنسجة وتستجيب لقوى ميكانيكية.

تبقى خلاصة من هذه الهياكل الأنسجة غير المتجانسة تحديا في هندسة الأنسجة والطب التجديدي، وفهمنا من الأهمية البيولوجية محدودة. هناك حاجة لزراعة منصات لتحليل الأنسجة الطبقية وكذلك شارك في ثقافات مجموعات مختلفة من الخلايا في بناء واحد. في هندسة الأنسجة الغضروف المفصلي، تم تشييد بنيات-سقالة أقل الطبقات عن طريق تسخير قدرة غضروفية مناطقية لإيداع ECM متنوعة لتقليد طبقات مختلفة من هذا النسيج ^3،4. ومع ذلك، توفر بنيات هيدروجيل الطبقات فرصة لتحقيق تفاعل الأنواع المختلفة للسكان الخلية التي تفتقر إلى القدرة على تكوين الأنسجة قوية بشكل مستقل. على سبيل المثال، والبوب ​​مختلفةulations الخلايا الجذعية الوسيطة يمكن أن يشترك في تربيتها داخل بنيات الطبقات. وقد استخدمت هذه السقالات الطبقات مع كل غضروفية والتفريق الخلايا الجذعية الوسيطة لتحسين هندسة الأنسجة ^5. لا يمكن إلا أن يكون شارك في تربيتها السكان مختلفة من الخلايا في طبقات هيدروجيل مماثلة، ولكن يمكن أيضا نوع وحيد الخلية يمكن تربيتها داخل الطبقات التي تم التلاعب بها لديك متفاوتة الصلابة أو المحتوى الكيميائي لانتزاع استجابات مختلفة من الخلايا ^6،7.

وقد استخدمت العديد من الهلاميات المائية بيولوجية مختلفة لطبقة السكان الخلية لهندسة الأنسجة الغضروف مثل تلك التي تستخدم البولي ايثيلين جلايكول أو بولي فينيل الكحول قواعد ^7-9. ومع ذلك، الهلاميات المائية الجينات هي واحدة من أبسط المواد الحيوية من خلالها إنشاء السقالات الطبقات لدراسة السكان الخلية غير متجانسة في الثقافة المشتركة. في حين شكلت أيضا الهلاميات المائية الاغاروز بسهولة، الهلاميات المائية الجينات لها فائدة إضافية تتمثل في السماح السهل هوolation من الخلايا من بناء 3-D لتحليل الخلايا الفردية كما وصفت سابقا ^10. في دراسات سابقة، وقد تم تشكيل الهلاميات المائية الجينات ثنائية الطبقات في صفائح رقيقة ومن هذه الأوراق، وشرائح أقسام (على سبيل المثال، باستخدام لكمة خزعة) لتطبيقات معينة مثل لتحليل المحتوى الكيميائي أو خصائص القص بينية ^11،12. وقد وصفت طريقة أخرى لتشكيل صفائح الجينات رقيقة مع إمكانية التقسيم إلى طبقات متعددة، ولكن لا يزال يتطلب تغيير في هيدروجيل لاستخدامها في اختبار الميكانيكية ^13.

هنا، فإننا نقدم وسيلة لخلق بتكاثر أقراص هيدروجيل الجينات ثنائية الطبقات لاستخدامها في زراعة-المشارك مجموعات مختلفة من الخلايا. هذه المنصة القرص الجينات تمتلك العديد من المزايا. في المقام الأول، وشكل استنساخه وحجم صغير يؤدى لالتحفيز الميكانيكي للخلايا جزءا لا يتجزأ من دون الحاجة إلى خزعة بوNCH ​​أو غيرها من التغيير المادي للهيدروجيل للعديد من التطبيقات. بالإضافة إلى ذلك، لا تزال بقاء الخلية عالية أثناء عملية التصفيف، وبعد تشكيل هلام فصل واضح من السكان الخلية اثنين داخل هلام غير مرئية مع أي منطقة متداخلة الأولية.

Protocol

1. إعداد لتشكيل الجيني أقراص

1. إعداد 4٪ (ث / ت) حل الجينات في الفوسفات مخزنة المالحة 1X Dulbecco ودون كلوريد الكالسيوم وأضاف أو كلوريد المغنيسيوم وقعت في 37 ° C حمام الماء. تركيزات الحل الجينات يمكن أن تختلف، ولكن 1-4٪ (ث / ت) ينصح حلول الجينات.
2. مزيج الحل الجينات في نسبة 1: 1 مع قاعدة الوسائط زراعة الخلايا الحارة (على سبيل المثال، Dulbecco لتعديل النسر متوسطة.) لنوع من الخلايا المطلوبة. تركيز الجينات هو الآن نصف تركيز الأصلي، أي، 2٪ (ث / ت). تعقيم الجينات / حل الوسائط باستخدام معقم 0.2 ميكرومتر مرشحات حقنة النايلون.
3. يعد حمام من معقمة 102 ملم ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم في الماء المعقم مع حل ما يكفي لغمر قوالب (~ 200-300 مل).
4. جمع العقيمة "قالب تشكيل هلام" (6 مم × 3 مم طويل القامة آبار اسطوانية 3 في × 3 في لوحة الألومنيوم، انظر الشكل 1) والصفائح الطرفية (القاع: واحد 3 × 3 في في لوحة الألومنيوم، الأعلى: واحد 1.5 بوصة × 3 في لوحة الألومنيوم) وإعداد قوالب على النحو التالي:
   1. قطع ورقة سميكة فلتر (مرشح ورقة نشافة) وغشاء الخلية microsieve (10 ميكرون حجم المسام) لأحجام أعلى وأسفل الصفائح الطرفية ووضعها في الحمام كلوريد الكالسيوم حتى المشبعة، حوالي 1 دقيقة. إذا رغبت في ذلك، وتعقيم ورقة الترشيح سميكة والغشاء microsieve عبر الأوتوكلاف أو الأشعة فوق البنفسجية ضوء لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام.
   2. انشاء نصف (النصف السفلي) من العفن بناء.
      1. وضع العناصر التالية فوق بعضها البعض في الترتيب التالي وتنعيم باستخدام ملعقة العقيمة: endplate كبيرة (3 × 3 في في)، ورق الترشيح سميكة، ثم الغشاء microsieve.
      2. عكس واضغط على العفن على كومة من المناشف الورقية لضمان فقدان محلول كلوريد الكالسيوم الزائد.
      3. وضع "هلام تشكيل العفن" مع آبار اسطوانية على أعلى جالذراع غشاء microsieve وبلطف ربط القالب معا على الجانبين باستخدام مقاطع الموثق على الجانبين الأيسر والأيمن. تأكد من ترك مساحة كافية لendplate أعلى (1.5 بوصة × 3 في) لتغطية الآبار في وقت لاحق تماما.
   3. انشاء النصف الثاني (النصف العلوي) من العفن بناء.
      1. وضع العناصر التالية فوق بعضها البعض في الترتيب التالي وتنعيم: endplate صغيرة، ورق الترشيح سميكة، وغشاء microsieve.
      2. عكس والضغط على هذا النصف من العفن على كومة من المناشف الورقية لضمان فقدان محلول كلوريد الكالسيوم الزائد. لا أربط هذا الشوط من العفن باستخدام مقاطع الموثق في هذا الوقت.
5. ثقافة الخلايا كما أوصى في تعليمات الشركة الصانعة. حصاد الخلايا المطلوبة لتضمينها في الهلاميات المائية الجينات الطبقات. كثافة الخلية الموصى بها هي 1-2 × 10 ⁶ خلية / مل، ولكن هذا يمكن أن تختلف اعتمادا على التجارب المطلوبة.
   ملاحظة: عند استخدام هذا الأسلوبلجعل الطبقات مع أنواع مختلفة من الخلايا، للتأكد من أنواع الخلايا ثقافة اثنين بشكل متواز لطبقات. الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة) المصنفة في مناطق ذات كثافة خلية من 1 × 10 ⁶ خلية / مل سوف تستخدم كمثال لبروتوكول التالي. عدد الخلايا وعدد القرص يمكن زيادتها لتجارب حسب الحاجة.
   1. أسبوع إلى أسبوعين قبل التضمين، الخلايا الجذعية الوسيطة البذور في مناطق ذات كثافة خلية من 3000 - 5000 خلية / سم ² في 10 مل من وسائط النمو القاعدية (Dulbecco لتعديل النسر متوسطة، و 10٪ مصل بقري جنيني، 2٪ L-الجلوتامين، 1 ٪ غير الاساسيين الأحماض الأمينية، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين) في T-75 قوارير.
   2. إزالة وسائل الاعلام وقضي كل 2-3 أيام واستبدالها مع 10 مل من وسائط النمو القاعدية حتى الخلايا هي 80-90٪ متموجة.
   3. حصاد الخلايا، وإزالة وسائل الاعلام المستهلك، وماصة 3 مل من الفوسفات مخزنة المالحة 1X Dulbecco ودون كلوريد الكالسيوم المضافة أو كلوريد المغنيسيوم لشطف الخلايا. إزالة هذا الحل، ماصة 3 مل من 0.25٪ في محاولةpsin-EDTA على نمو الخلايا في T-75 قوارير، واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد خلايا رفعت من على سطح الأرض ملتصقة، إضافة 6-9 مل من وسائط النمو القاعدية.
   4. اللجان الدائمة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، نضح طاف، وإعادة تعليق في 1-5 مل من وسائط النمو القاعدية. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات باستخدام تعليمات الجهاز.
   5. إزالة 1 × 10 ⁶ خلايا من إجمالي إعادة تعليق الخلية، وأجهزة الطرد المركزي التي تستخدم نفس الظروف، ونضح طاف.

2. تشكيل خلية المصنفة الجيني أقراص

1. إعادة تعليق بيليه خلية مع 1 مل من محلول الجينات / وسائل الإعلام العقيمة لتحقيق كثافة الخلية من 1 × 10 ⁶ خلية / مل. سوف الخليط الخلية الجينات يكون غائما متجانس في المظهر عندما خلايا ممزوجة بشكل مناسب.
2. ماصة 130 ميكرولتر من خليط الخلية الجينات إلى ستة 6 مم × 3 مم الآبار طويل القامة في النصف السفلي من العفنبناء قطرة قطرة، حتى لا تخلق أي فقاعات. وينبغي أن يكون الغضروف المفصلي محدب طفيف مرئية فوق حافة كل بئر.
3. تنعيم بعناية النصف العلوي من العفن بناء باستخدام ملعقة معقمة وتحويل أكثر من ذلك، حتى أن غشاء الخلية microsieve على رأس الآبار. مكان القالب بناء على أعلى من الآبار، مع التأكد من تغطية الآبار التي تحتوي على خلية وخليط الجينات تماما.
4. رفع القالب بناء تحميلها، وأثناء الضغط لأسفل بشدة على المركز، الموثق كليب الجانبين المتبقية (العلوي والسفلي) لربط شطري العلوية والسفلية من القالب بناء. الحلول الخلية الجينات يجب أن تقع بشكل آمن في الآبار في هذا الوقت.
5. تزج بناء العفن تثبيتها في الحمام كلوريد الكالسيوم 102 ملم، والتأكد من أن بناء كامل مغمورة. احتضان في الخلية هود الثقافة في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة.
6. في نهاية ال 90 دقيقة، وإزالة بناء قالب من كلوريد الكالسيوم 102 مليحمام ومكان على كومة من المناشف الورقية في الخلية هود الثقافة. إزالة جميع مقاطع الموثق أربعة وفصل نصفي القالب بناء. الهلاميات المائية التي تشكلت في الآبار لا ينبغي أن يكون أي فقاعات، وينبغي ملء الآبار تماما.
7. باستخدام ملعقة، وتتبع بعناية حافة الآبار التي تحتوي على الهلاميات المائية لتخفيف بعناية ووتد من الهلاميات المائية. بعد إزالة الهلاميات المائية من العفن بناء، وإسقاط الهلاميات المائية مباشرة إلى حمام من الفوسفات مخزنة المالحة 1X Dulbecco ومع كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم. تغطية المواد الهلامية تماما ليغسل محلول كلوريد الكالسيوم الزائد عن 1-5 دقائق.
8. نقل الهلاميات المائية إلى حل القاعدية وسائط النمو في طبق المطلوب (على سبيل المثال، 6 لوحات أيضا) التي تغطي تماما الهلاميات المائية. احتضان لمدة لا تقل عن 1 ساعة في الحاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ قبل المتابعة إلى الخطوة طبقات.
   ملاحظة: الهلاميات المائية التي تحتوي على خلايا يمكن أن تبقى فيهو المطلوب حاضنة الثقافة الخلية إلى أجل غير مسمى في هذا الوقت حتى طبقات من المواد الهلامية مع السكان خلية أخرى، شريطة أن يتم الانتهاء من التغييرات وسائل الاعلام كل 2-3 أيام.

3. طبقات من الجينات أقراص

1. خلال النصف ساعة الأخيرة من حضانة 1 ساعة، جمع وإعداد قوالب معقمة وحل لوالصلب والمواد الهلامية.
   1. إعداد "العفن قطع" بواسطة الربط قالب التي لديها آبار نصف ذروة "هلام تشكيل العفن" (6 مم × 1.5 مم الآبار طويل القامة في 3 في × 3 في لوحة الألومنيوم) إلى endplate (3 في العاشر 3 في لوحة الألومنيوم) باستخدام مقاطع الموثق على الجانبين الأيسر والأيمن.
   2. إعداد "القالب الصلب" بواسطة الربط قالب الذي هو 3 مم أكبر في القطر من "تشكيل العفن هلام" (مم 9 × 3 مم الآبار طويل القامة في 3 في × 3 في لوحة الألومنيوم) إلى endplate (3 في العاشر 3 في لوحة الألومنيوم) باستخدام مقاطع الموثق على الجانبين الأيسر والأيمن.
   3. يعد حل100 ملي سترات الصوديوم / 30 ملي EDTA (الصوديوم سترات ثنائي الهيدرات، ethylenediaminetetraacetic حمض رباعي ملح ثنائي الهيدرات) في الماء المعقم.
2. إزالة المواد الهلامية من السكان الخلية المطلوبة (في هذا المثال، اثنين من الأقراص مع hMSCs) من وسائل الإعلام في الطبق، وتضع في الآبار "قطع قالب". كل هلام ينبغي أن تناسب بشكل مريح في الآبار مع نصف من هلام جاحظ فوق القالب.
3. باستخدام مشرط، شريحة الجل على طول سطح القالب (وهذا سوف يقلل هيدروجيل في نصف). الوجه النصف العلوي من هلام ووضعه في العفن جيدا مفتوحة. يجب النصف من هلام أيضا تناسب بشكل مريح في القالب بشكل جيد، ولكن الآن كل من المواد الهلامية نصف ينبغي أن يكون ارتفاع القالب مع السطح الداخلي قطع مرئية. كرر مع هلام الثاني.
   ملاحظة: تحذير: سوف فقط قطع الأسطح الداخلية تشكل أقراص الطبقات. وذلك باستخدام الأسطح الخارجية يؤدي إلى فصل نصفين. ويشتبه في أن نسيج من الغشاء microsieve نقلها على سطح هلام منعالصورة نجاح عملية الصلب.
4. ضع قطعة من جفاف الغشاء الخلوي microsieve على الجزء العلوي من الآبار، والتأكد من أن غشاء microsieve على اتصال مع كل من نصفي هلام إلى أن صلب وتغطيتها تماما. ضع ورق الترشيح سميكة على رأس الغشاء microsieve، مع التأكد من تغطية المواد الهلامية تماما.
5. ماصة حل من 100 ملي سترات الصوديوم / 30 ملي EDTA (ثنائي الهيدرات سيترات الصوديوم، Ethylenediaminetetraacetic حمض رباعي ملح ثنائي الهيدرات) على ورقة الترشيح سميكة حتى يتشبع بها. ما يقرب من 750 ميكرولتر كافية لأربعة آبار.
6. احتضان المواد الهلامية لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم، وإزالة غشاء الخلية microsieve وورق الترشيح سميكة والتخلص منها. إزالة لقطات الموثق وفتح القالب.
7. لكل جيل صلب، ونقل احد سيترات الصوديوم / المعالجة EDTA نصف هيدروجيل إلى استعداد "القالب الصلب" مع سطح قطع متجهة لأعلى. وسيكون هذا نصف CONST صلبruct.
8. باستخدام ملعقة، ورفع ووضع سيترات الصوديوم الثاني / المعالجة EDTA نصف هلام (قد تحتوي على نوع من الخلايا المختلفة) على هلام بالفعل في "القالب الصلب"، التقليب هذا الشوط الثاني جل بحيث سطح الخفض هو في الاتصال مع سطح قطع من هلام بالفعل في "القالب الصلب".
9. اضغط بلطف إلى أسفل على المواد الهلامية اثنين باستخدام ملعقة لإزالة أي فقاعات بين لالهلام اثنين. أيضا، إعادة المواد الهلامية حسب الحاجة للتأكد من أن أنها مباشرة على رأس واحد آخر.
10. رفع بلطف "القالب الصلب" ويغرق في حمام كلوريد الكالسيوم 102 ملي لمدة 30 دقيقة. لا تغطي الآبار مع endplate.
11. بعد حضانة 30min في، إزالة "القالب الصلب" ووضعه على مناشف ورقية. إزالة لقطات الموثق وفصل القالب من endplate.
12. باستخدام ملعقة، وجمع المواد الهلامية صلب ووضعها في الفوسفات مخزنة المالحة و1X Dulbecco ومع كلوريد الكالسيوم ومحمام كلوريد agnesium لغسل المواد الهلامية. وفي وقت لاحق، ونقل الهلاميات المائية صلب وسائل الإعلام ثقافة الخلية في طبق المطلوب (على سبيل المثال، لوحة 6 جيدا) للثقافة.

النتائج

الشكل 1 يصور تشكيل وطبقات من الهلاميات المائية الجينات. أكملت المواد الهلامية ثنائية الطبقات يحمل الفصل الأول كاملة من السكان الخلية كما هو مبين في الشكل 2. بقاء الخلية من الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان) جزءا لا يتجزأ من داخل هذه ?...

Discussion

هنا، نحن تصف بروتوكول لتشكيل الطبقات أقراص هيدروجيل الجينات لدراسة شارك في ثقافات السكان الخلية متعددة، مثل تلك الموجودة في الأنسجة الطبقات من الناحية الفسيولوجية، على سبيل المثال، والغضروف. هياكل الطبقات، مثل منصة الثقافة وصفها، ويمكن استخدامها لدراسة التف?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alginic Acid sodium salt	Sigma Aldrich	A1112	Solution made in wt% using DPBS (-/-)
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-/-)	Gibco Life Technologies	14190
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (+/+)	Gibco Life Technologies	14190
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco Life Technologies	11965	Example. Use desired medium type
Syringe Filters (0.02 μm Nylon)	FisherBrand	0979C
Calcium Chloride Dihydrate	Fisher Bioreagents	BP510	Prepare solution in sterile water
Criterion Blotter Filter Paper	Biorad	1704085	Cut to size of endplates for mold formation
Cell Microsieve Membrane (10 μm pore size)	Biodesign Inc of New York	N10R	Cut to size of endplates for mold formation
Sodium citrate dihydrate	FisherScience	S93364
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA)	FisherBioreagent	BP121
Fetal Bovine Serum	Gibco Life Technologies	26140	Used in example mesenchymal stem cell basal growth media
Penicilin/Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco Life Technologies	15140	Used in example mesenchymal stem cell basal growth media
L-Glutamine (200 mM)	Gibco Life Technologies	25030081	Used in example mesenchymal stem cell basal growth media
Non-essential Amino Acids (100x)	Gibco Life Technologies	11140050	Used in example mesenchymal stem cell basal growth media