Em camadas de alginato Constrói: Uma Plataforma para Co-cultura de populações de células heterogéneas

Resumo

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

Resumo

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Introdução

tecidos que suportam cargas de compressão, tais como a cartilagem articular ou discos intervertebrais consistem em regiões de tecidos heterogéneos que são críticas para a função tanto biomecânico e mecano-transdução adequada no tecido. Não só é a organização celular e a função distinta em diferentes regiões, mas as matrizes extracelulares (ECM) são também variou em composição e organização. Por exemplo, a cartilagem articular é constituído por três zonas primárias com morfologia, variando de células, função mecânica, e ECM. As diferenças na sua vantagem ECM para diferencial responsabilidades suporte de carga; a camada superficial está envolvida principalmente em resposta à tração para carregar, enquanto as zonas média e profunda são principalmente responsáveis ​​pela resposta à compressão ^1. Da mesma forma, no disco intervertebral, um núcleo pulposo do tipo gel é rodeado por um anel fibrose lamelar e as células dentro dessas duas áreas distintas experimentar diferentes tipos de estímulos biofísicos2. Nestes tipos de tecidos, células e as matrizes extracelulares no interior das camadas de tecido interagir uns com os outros como o tecido sofre e responde a forças mecânicas.

Recapitulação de tais estruturas de tecidos heterogêneos continua a ser um desafio em engenharia de tecidos e medicina regenerativa, e nossa compreensão de seu significado biológico é limitado. Existe uma necessidade para a cultura de plataformas para analisar tecidos estratificados, bem como co-culturas de diferentes populações de células dentro de uma construção. Na engenharia de tecidos de cartilagem articular, construções de andaime-menos camadas foram construídos através do aproveitamento da capacidade dos condrócitos zonal para depositar ECM variou para imitar as diferentes camadas desse tecido ^3,4. No entanto, as construções de hidrogel em camadas proporcionam uma oportunidade para estudar a interacção de diversos tipos de populações de células que não possuem a capacidade para formar um tecido robusto independentemente. Por exemplo, pop diferenteulations de células estaminais mesenquimais podem ser co-cultivadas dentro de construções em camadas. Tais andaimes em camadas têm sido utilizados com ambas condrócitos e diferenciação de células-tronco mesenquimais para melhorar a engenharia de tecidos ^5. Não só pode ser co-cultivadas em populações de células diferentes camadas de hidrogel semelhantes, mas um único tipo de células também podem ser cultivadas dentro de camadas que foram manipuladas para ter diferentes rigidez ou conteúdo bioquímico para desencadear respostas diferentes a partir de células de ^6,7.

Muitos hidrogeles biomaterial diferentes têm sido utilizados para a camada de populações de células para engenharia de tecidos de cartilagem, tais como aqueles utilizando polietileno-glicol ou álcool polivinílico bases ^7-9. No entanto, os hidrogéis de alginato são um dos biomateriais mais simples do que para criar andaimes em camadas para o estudo de populações de células heterogéneas em co-cultura. Embora os hidrogéis de agarose são também facilmente formado, hidrogéis de alginato tem a vantagem adicional de permitir fácil éolation de células a partir da construção 3-D para a análise de células individuais como foi anteriormente descrito ^10. Em estudos anteriores, os hidrogéis de alginato bi-camadas foram formadas em folhas finas e a partir destas folhas, secções foram cortados (por exemplo., Utilizando um punção de biópsia) para aplicações particulares, tais como por análise de conteúdo bioquímica ou propriedades de cisalhamento interfacial ^11,12. Outro método para a formação de folhas finas de alginato tem sido descrita com o potencial para a estratificação em camadas múltiplas, mas mesmo assim iria requerer uma alteração ao hidrogel para utilização em testes mecânicos ^13.

Aqui, apresentamos um método para criar reproducibly discos de hidrogel de alginato bi-camadas para uso em co-cultura de diferentes populações de células. Esta plataforma disco de alginato possui várias vantagens. Em primeiro lugar, a forma reprodutível e tamanho pequeno é propício para a estimulação mecânica das células incorporados sem a necessidade de uma biópsia PUNCH ​​ou outra alteração física para o hidrogel para muitas aplicações. Além disso, a viabilidade das células permanece elevada durante o processo de separação e, após formação de gel uma clara separação das duas populações de células dentro do gel é visível sem região de sobreposição inicial.

Protocolo

1. Preparação para a Formação de alginato de Discos

1. Prepara-se uma 4% (w / v) em solução de alginato de 1x Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco sem cloreto de cálcio adicionado ou cloreto de magnésio e colocar num banho de água a 37 ° C. As concentrações da solução de alginato pode variar, mas 1-4% (w / v) de soluções de alginato são recomendados.
2. Misturar a solução de alginato a uma razão de 1: 1 com a base de meios de cultura de célula quente (por exemplo, Modified Eagle Médium da Dulbecco.) Para o tipo de célula desejado. A concentração de alginato é agora metade da concentração original, isto é., 2% (w / v). Esterilizar solução de alginato / mídia usando filtros de seringa de nylon de 0,2 um estéreis.
3. Preparar um banho de cloreto de cálcio di-hidratado 102 mM estéril em água estéril com solução suficiente para submergir moldes (~ 200 - 300 ml).
4. Recolher o estéril "molde de formação de gel" (diâmetro x 3 mm poços cilíndricos de altura de 6 mm em um 3 in x 3 em chapa de alumínio, consulte Figura 1) e placas terminais (inferior: um 3 em x 3 em chapa de alumínio, Top: um 1,5 em x 3 em chapa de alumínio) e preparar moldes da seguinte forma:
   1. Cortar papel grosso filtro (filtro de papel mata-borrão) ea membrana microsieve celular (10 de tamanho de poro) para os tamanhos de parte superior e placas terminais inferiores e colocá-los no banho de cloreto de cálcio até à saturação, a cerca de 1 min. Se desejado, esterilizar o papel de filtro grosso e a membrana microsieve através de autoclave ou luz ultravioleta durante 30 min antes da utilização.
   2. Defina-se a metade (metade inferior) da construção de moldes.
      1. Colocar os seguintes itens cima da outra na seguinte ordem e suavizar usando uma espátula estéril: grande placa terminal (3 em x 3 pol), papel de filtro de espessura, e, em seguida, a membrana microsieve.
      2. Invertido e pressionar o molde para uma pilha de toalhas de papel para assegurar a perda de excesso de solução de cloreto de cálcio.
      3. Coloque a "gel de molde de formação", com os poços cilíndricos no topo do cell membrana microsieve e suavemente aperte o molde juntos em dois lados usando grampos da pasta nos lados direito e esquerdo. Certifique-se de deixar espaço suficiente para a parte superior da placa terminal (1,5 in x 3 in) para cobrir os poços completamente mais tarde.
   3. Defina-se a segunda metade (metade superior) da construção de moldes.
      1. Coloque os seguintes itens em cima de um ao outro na seguinte ordem e suavizar: pequena placa terminal, papel de filtro grosso, membrana microsieve.
      2. Invertido e pressiona esta metade do molde sobre uma pilha de toalhas de papel para assegurar a perda de excesso de solução de cloreto de cálcio. Não fixe nesta parte do molde utilizando grampos da pasta no momento.
5. células de cultura, tal como recomendado por instruções do fabricante. Colheita das células desejadas para incorporar nos hidrogéis de alginato em camadas. A densidade celular recomendada é de 1 - 2 x 10 ⁶ células / ml, mas isto pode ser variado dependendo experiências desejadas.
   Nota: Ao usar este métodopara fazer camadas com diferentes tipos de células, certifique-se de cultura dois tipos de células em paralelo para mergulhar. As células estaminais mesenquimais (MSCs) semeadas a uma densidade celular de 1 x 10 ⁶ células / ml será utilizado como um exemplo para o seguinte protocolo. O número de células e o número de disco pode ser dimensionado para as experiências conforme necessário.
   1. Uma a duas semanas antes da incorporação, as células estaminais mesenquimais semente a uma densidade celular de 3000 - 5000 células / ^cm2 em 10 mL de meio de crescimento basal (Dulbecco Modified Eagle Médium, 10% de Soro Fetal Bovino, 2% de L-Glutamina, 1 % Aminoácidos não essenciais, 1% de penicilina / estreptomicina) em frascos T-75.
   2. Remova a mídia passou a cada 2 - 3 dias, e substituir com 10 ml de meio de crescimento basal até que as células são 80 - 90% confluentes.
   3. Para colher as células, remova meio gasto e pipeta de 3 ml de 1x Dulbecco salina de tampão fosfato sem cloreto de cálcio adicionado ou cloreto de magnésio para lavar as células. Remover esta solução, pipeta 3 ml de 0,25% Trypsin-EDTA sobre as células que crescem em frascos T-75, e incubar durante 5 min a 37 ° C. Após as células têm levantado da superfície aderente, adicionar 6 - 9 ml de meio de crescimento basais.
   4. MSCs centrifugue-as a 600 xg durante 5 min à temperatura ambiente, aspirar o sobrenadante e re-suspensão em 1-5 ml de meio de crescimento basais. Contar as células usando um hemocitômetro utilizando as instruções do dispositivo.
   5. Retirar 1 x 10 ⁶ células da resuspensão de células totais, de centrifugação utilizando as mesmas condições, e aspirar o sobrenadante.

2. Formação de celulares Seeded alginato Discs

1. Re-suspender o sedimento de células com 1 ml de solução de alginato / meios estéreis para atingir uma densidade celular de 1 x 10 ⁶ células / ml. A mistura de células-alginato será homogeneamente um aspecto turvo, quando as células são misturadas de forma adequada.
2. Pipete 130 pi da mistura de células-alginato em poços seis altos 6 mm de diâmetro x 3 mm na metade inferior do moldeconstruir gota a gota, de modo a não criar quaisquer bolhas. Um ligeiro menisco convexo deve ser visível acima do bordo de cada poço.
3. Cuidadosamente suavizar a metade superior da construção do molde usando uma espátula estéril e entregá-lo, de modo que a membrana da célula é microsieve na parte superior dos poços. Coloque o molde na construção de topo dos poços, tendo o cuidado de cobrir os poços que contêm células e a mistura de alginato completamente.
4. Levante a construção do molde carregado e, enquanto pressiona firmemente no centro, Mola os restantes dois lados (superior e inferior) para prender as metades superior e inferior da construção do molde. As soluções de células-alginato deve ser firmemente situado nos poços neste momento.
5. Mergulha-se o construto de molde fixada no banho de cloreto de cálcio 102 mM, certificando-se que toda a construção é submerso. Incubar na capa de cultura de células à temperatura ambiente durante 90 min.
6. No final dos 90 minutos, remover a construção do molde a partir do cloreto de cálcio 102 mMbanho e coloque em uma pilha de toalhas de papel na capa de cultura de células. Remove todos os quatro grampos da pasta e separar as duas metades do molde de construção. Hidrogéis formados nos poços não deve ter quaisquer bolhas e deve encher os poços completamente.
7. Com uma espátula, rastrear cuidadosamente o bordo dos poços contendo os hidrogéis para soltar cuidadosamente e cunha os hidrogeles. Depois de retirar os hidrogeles a partir da construção de moldes, soltar os hidrogéis directamente para um banho de 1x Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco, com o cloreto de cálcio e cloreto de magnésio. Cobrir os geles completamente para lavar o excesso de solução de cloreto de cálcio para 1-5 min.
8. Transferir os hidrogeles em solução basal meio de crescimento em prato desejado (por ex., Placas de 6 cavidades) que cobre completamente os hidrogeles. Incuba-se durante pelo menos 1 hora na incubadora de cultura de células a 37 ° C e 5% de CO ₂ antes de continuar para o passo de estratificação.
   Nota: Os hidrogeles que contêm as células podem ser mantidas ema incubadora de cultura de células indefinidamente neste momento até camadas de géis com uma outra população celular é desejada, desde que mudanças de suporte são concluídos a cada 2 - 3 dias.

3. Camadas de alginato de Discos

1. Durante a última meia hora da incubação de 1 hora, recolher e preparar moldes e solução estéril para o recozimento os géis.
   1. Prepara-se o "molde de corte" pela fixação de um molde que tem cavidades de metade da altura do "molde de formação de gel" (6 mm de diâmetro x 1,5 mm de poços altos em um 3 em x 3 na placa de alumínio) a uma placa terminal (3 em x 3 em chapa de alumínio) usando grampos da pasta nos lados direito e esquerdo.
   2. Preparar o "molde de recozimento", fixando um molde que é de 3 mm de diâmetro maior do que o "molde de formação de gel" (9 mm de diâmetro x 3 mm poços altos em um 3 in x 3 em chapa de alumínio) a uma placa terminal (3 in x 3 em chapa de alumínio) usando grampos da pasta nos lados direito e esquerdo.
   3. Prepara-se uma solução decitrato de sódio 100 mM / EDTA 30 mM (di-hidrato de citrato de sódio, di-hidrato de sal tetrassódico etilenodiaminotetra-acético ácido) em água estéril.
2. Remover géis de populações de células desejadas (neste exemplo, dois discos com hMSCs) dos meios de comunicação no prato e colocar nos poços "corte do molde". Cada gel deve caber confortavelmente nas cavidades com metade do gel salientes acima do molde.
3. Utilizando um bisturi, cortar o gel ao longo da superfície do molde (isto reduzirá o hidrogel em meio). Virar a metade superior do gel e colocá-lo em um poço de molde aberto. A metade do gel também deve caber dentro do molde bem, mas agora ambos os géis metade deve ser a altura do molde, com a superfície interior cortado visível. Repita com o segundo gel.
   Nota: Atenção: Só as superfícies de corte interiores irá formar discos em camadas. Usando as superfícies exteriores resultará na separação metades. Suspeita-se que a textura da membrana microsieve transferida para a superfície do gel de evitarO sucesso do processo de recozimento.
4. Coloque um pedaço de membrana celular microsieve seco no topo das cavidades, certificando-se que a membrana microsieve está em contacto com todas as metades de gel a ser recozido e cobrindo-as totalmente. Coloque papel de filtro grossa no topo da membrana microsieve, certificando-se de cobrir completamente os géis.
5. Pipetar uma solução de citrato de sódio 100 mM / EDTA 30 mM (di-hidrato de citrato de sódio, di-hidrato de sal tetrassódico etilenodiaminotetraacético ácido) para o papel de filtro de espessura até que seja saturado. Cerca de 750 ul é suficiente para quatro poços.
6. Incubar os géis durante 1 min à temperatura ambiente. Em seguida, retire a membrana microsieve celular e papel de filtro grosso e descartá-las. Remova os grampos da pasta e abrir o molde.
7. Para cada gel recozido, transferir um citrato de sódio half / tratado com EDTA do hidrogel ao preparado "molde de recozimento", com superfície de corte virada para cima. Isto será um meio de const recozidoruct.
8. Usando uma espátula, levantar e colocar a / half-gel tratado com EDTA citrato de segunda sódio (pode conter um tipo de célula diferente) sobre o gel já no "molde de recozimento", lançando nesta segunda meia-gel para que a superfície de corte está em contacto com a superfície do corte do gel já no "molde de recozimento".
9. Pressione com cuidado os dois géis usando uma espátula para remover quaisquer bolhas de entre os dois géis. Além disso, reposicionar os géis, conforme necessário para garantir que eles estão directamente em cima uns dos outros.
10. Levante cuidadosamente o "molde de recozimento" e submergi-lo no banho de cloreto de cálcio 102 mM durante 30 minutos. Não cubra os poços com uma placa terminal.
11. Após a incubação de 30 minutos, retire o "molde de recozimento" e colocá-lo para toalhas de papel. Remova os grampos da pasta e separar o molde da placa terminal.
12. Com uma espátula, recolher os géis recozidos e colocá-los em uma de 1x Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco, com o cloreto de cálcio e mbanho de cloreto de agnesium para lavar os géis. Subsequentemente, transferir hidrogéis recozidos a meios de cultura de células em um prato desejado (por ex., Placa de 6 poços) durante a cultura.

Resultados

A Figura 1 descreve a formação e estratificação dos hidrogéis de alginato. Completado géis bi-camadas exibem uma separação inicial completa de populações de células, como mostrado na Figura 2. A viabilidade celular das células estaminais mesenquimais humanas) incorporado dentro desses hidrogeles e camadas continua a ser elevada e comparável com os hidrogeles a granel, como mostrado na Figura 3. A viabilidade foi avaliada ap?...

Discussão

Aqui, nós descrevemos um protocolo para a formação de discos de hidrogel de alginato em camadas para estudar a co-culturas de várias populações de células, tais como aqueles em tecidos fisiologicamente em camadas, por exemplo, cartilagem. estruturas em camadas, tal como a plataforma de cultura descrito, pode ser usado para examinar a interacção entre as duas populações de células distintas sujeitos ao mesmo ambiente de cultura ou sob carga.

O alginato é um polissacaríd...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alginic Acid sodium salt	Sigma Aldrich	A1112	Solution made in wt% using DPBS (-/-)
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-/-)	Gibco Life Technologies	14190
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (+/+)	Gibco Life Technologies	14190
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco Life Technologies	11965	Example. Use desired medium type
Syringe Filters (0.02 μm Nylon)	FisherBrand	0979C
Calcium Chloride Dihydrate	Fisher Bioreagents	BP510	Prepare solution in sterile water
Criterion Blotter Filter Paper	Biorad	1704085	Cut to size of endplates for mold formation
Cell Microsieve Membrane (10 μm pore size)	Biodesign Inc of New York	N10R	Cut to size of endplates for mold formation
Sodium citrate dihydrate	FisherScience	S93364
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA)	FisherBioreagent	BP121
Fetal Bovine Serum	Gibco Life Technologies	26140	Used in example mesenchymal stem cell basal growth media
Penicilin/Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco Life Technologies	15140	Used in example mesenchymal stem cell basal growth media
L-Glutamine (200 mM)	Gibco Life Technologies	25030081	Used in example mesenchymal stem cell basal growth media
Non-essential Amino Acids (100x)	Gibco Life Technologies	11140050	Used in example mesenchymal stem cell basal growth media