Katmanlı Aljinat Yapıları: Heterojen hücre popülasyonlarının Co-kültür için bir platform

Özet

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

Özet

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Giriş

Böyle eklem kıkırdağı veya intervertebral diskleri gibi sıkıştırma yükü taşıyan dokular dokuda hem biyomekanik fonksiyon ve uygun mekano-iletimi için kritik olan heterojen doku bölgeleri oluşur. Sadece hücresel organizasyonu ve farklı bölgelerde farklı işlev, ancak hücre dışı matris (ECM) ayrıca kompozisyon ve organizasyonda çeşitlidir. Örneğin, eklem kıkırdağı değişen hücre morfolojisi, mekanik fonksiyon ve ECM ile üç birincil bölgeler oluşur. Yük taşıyan sorumlulukları diferansiyel kendi ECM kurşun farklılıklar; Orta ve derin bölgeler sıkıştırma ¹ yanıt esas hesap ise yüzeysel bir tabaka esas olarak, yük germe cevap yer almaktadır. Benzer bir şekilde, intervertebral disk, jel benzeri bir çekirdeği pulposus katmanlı bir halka fibrozis ile çevrilidir ve bu iki farklı alanlarda hücreler biyofiziksel uyarıcıların farklı deneyimDoku maruz ve mekanik kuvvetlere yanıt olarak, 2., Doku tabakaları içinde dokular, hücreler ve hücre-dışı matrisler Bu tip birbiriyle etkileşime girer.

Böyle heterojen doku yapılarının Rekapütülasyon doku mühendisliği ve rejeneratif tıpta bir sorun olmaya devam etmektedir, ve biyolojik önemi anlayışımız sınırlıdır. Bir yapının farklı hücre popülasyonlarının tabakalı dokular yanı sıra ko-kültürler analiz etmek için platformlar kültürlenmesi için bir ihtiyaç vardır. Eklem kıkırdak doku mühendisliği, iskele-az katmanlı yapılar bu dokuda ^3,4 farklı katmanlarını taklit etmek çeşitli ECM yatırmak için bölgesel kondrositlerin yeteneği yararlanarak inşa edilmiştir. Ancak, katmanlı hidrojel yapıları bağımsız sağlam dokuyu oluşturmak için yeteneğinden yoksun hücre popülasyonlarının farklı tipleri etkileşimini araştırmak için bir fırsat sağlar. Örneğin, farklı popmezenkimal kök hücrelerin ulations katmanlı yapıları içinde birlikte yetiştirilebilir. Böyle katmanlı iskeleleri kondrosit ve gelişmiş doku mühendisliği için ⁵ mezenkimal kök hücrelerin ayırt hem kullanılmıştır. Sadece farklı hücre popülasyonu içindeki hidrojel tabakaları kültürlenen-co, ancak tek bir hücre tipi, aynı zamanda hücre ^6,7 farklı yanıtlar ortaya çıkarmak için çeşitli sertlik veya biyokimyasal içeriğe sahip manipüle edilmiştir tabakalar içinde kültürlenebilir.

Birçok farklı biyo materyal hidrojeller, örneğin polietilen glikol veya poli vinil alkol bazları ^7-9 kullananlar gibi kıkırdak doku mühendisliği için hücre popülasyonlarının katman kullanılmaktadır. Ancak, aljinat hidrojeller ko-kültür heterojen hücre popülasyonlarının eğitim için katmanlı iskeleleri oluşturmak için basit biyomalzeme biridir. agaroz hidrojeller de kolayca oluşurken, aljinat hidrojeller kolay izin yararı vartek tek hücrelerin analizi için 3-D yapısının bir hücre olation önce ¹⁰ tarif edildiği gibi. Daha önceki çalışmalarda, iki tabakalı aljinat hidrojellerin ince tabakalar halinde oluşmuş ve bu levhalar, kesitler dilimlenmiş (örn., Bir biyopsi yumruk kullanarak) bu tür biyokimyasal içerik veya arayüzey kayma özelliklerinin ^11,12 analizi için olduğu gibi özel uygulamalar için. İnce aljinat tabakaların oluşturulması için bir diğer yöntem, çoklu katmanlar içine sınıflandırması için potansiyel olarak tarif edilmiştir, ama yine de, mekanik test ¹³ kullanım için hidrojel değişiklik gerektirir.

Burada, tekrarlanabilir hücrelerinin ko-kültür farklı popülasyonlarda kullanım için çift tabakalı alginat hidrojel diskler yaratmak için bir yöntem sunulmaktadır. Bu aljinat disk platformu birkaç avantajlara sahiptir. Öncelikle, tekrarlanabilir şekli ve küçük boyutlu bir biyopsi pu gerektirmeden gömülü hücrelerin mekanik uyarılması için elverişlinch veya birçok uygulama için hidrojel diğer fiziksel değişiklik. Buna ek olarak, hücre canlılığı, tabaka oluşturma süreci sırasında yüksek kalır ve jel oluşumu sonrası jel içinde iki hücre popülasyonlarının arasında net bir ayrım: ilk üst üste bölgesi ile görülebilir.

Protokol

Aljinat Disklerin Oluşumunda 1. Hazırlık

1. % 4 Hazırlama (a / h) 37 ° C su banyosu içinde, eklenmiş kalsiyum klorid veya magnezyum klorid ve yer olmadan 1x Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin aljinat çözeltisi. aljinat çözeltisi konsantrasyonları değişebilir, ancak 1-4% (w / v) aljinat çözeltileri önerilir.
2. İstenen bir hücre tipi için sıcak bir hücre kültür ortamı baz ile 1 (ör Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı).: 1 oranında aljinat çözeltisi karıştırın. Alginat konsantrasyonu orjinal konsantrasyonunun yarısı, yani.,% 2 (w / v). Steril 0.2 mikron naylon şırınga filtreleri kullanarak aljinat / medya çözümü sterilize edin.
3. (- 300 ml ~ 200) kalıp daldırın kadar çözelti steril su içinde, steril 102 mM kalsiyum klorür dihidrat banyo hazırlayın.
4. Steril "jel oluşumu kalıp" alüminyum levha içinde x 3 a 3 (6 mm çap x 3 mm uzunluğunda silindirik kuyu toplayın, bkz Şekil 1) ve omurun (Alt: Bir alüminyum plaka x 3 3, en alüminyum plaka x 3, bir 1.5) ve aşağıdaki şekilde kalıplar hazırlamak:
   1. Yaklaşık 1 dakika kalın filtre kağıdı (kurutma filtre kağıdı) ve alt ve üst endplate'lerin boyutları hücre microsieve zarı (10 mikron gözenek boyutu) kesin ve doyana kadar kalsiyum klorür banyosuna koyun. Eğer arzu edilirse, kullanımdan önce, 30 dakika boyunca otoklavda veya ultraviyole ışık ile kalın bir filtre kağıdı ve microsieve membran sterilize edin.
   2. Ayar kalıp yapısının bir yarısının (alt yarısı).
      1. aşağıdaki sırayla birbiri üstüne aşağıdaki öğeleri yerleştirin ve steril bir spatula kullanılarak pürüzsüz: büyük uç plakası, kalın bir filtre kağıdı ve microsieve membran (3 inç x 3 inç olarak).
      2. Ters çevirin ve aşırı kalsiyum klorür çözeltisinin kaybını sağlamak için kağıt havlu yığını üzerine kalıp basın.
      3. c üstünde silindirik kuyuları ile "jel oluşumu kalıp" koyunell microsieve zarı ve hafifçe sol ve sağ tarafta bağlayıcı klipleri kullanarak iki tarafta birbirine kalıp tutturmak. Tamamen sonra kuyuları kapsayacak şekilde (in x 3 1.5) üst plak için yeterli odadan emin olun.
   3. Set-up kalıp yapısının ikinci yarısında (üst yarısı).
      1. aşağıdaki sırayla birbirlerine tepesinde aşağıdaki öğeleri koyun ve pürüzsüz: küçük uç plakası, kalın filtre kağıdı, microsieve membran.
      2. Ters çevirin ve aşırı kalsiyum klorür çözeltisinin kaybını sağlamak için kağıt havlu yığını üzerine kalıp bu yarım basın. Şu anda bağlayıcı klipleri kullanarak kalıp bu yarısını tutturmak yok.
5. Kültür hücreleri olarak üreticinin talimatlarına göre önerilir. katmanlı aljinat hidrojeller gömmek için istenen hücreler hasat. Tavsiye hücre yoğunluğu 1 - 2 x 10 ⁶ hücre / mL, ancak bu arzu edilen deneyler bağlı olarak değişebilir.
   Not: Bu yöntemi kullanırkenfarklı hücre tipleri ile katmanları yapmak için, katman paralel olarak kültür iki hücre tipleri emin olun. Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) 1 x 10 ⁶ hücre bir hücre yoğunluğunda tohumlandı / ml, aşağıdaki protokol için bir örnek olarak kullanılacaktır. gerektiği gibi hücre sayısı ve disk numarası deneyler için ölçeklendirilebilir.
   1. Bazal üreme ortamı, 10 ml (Dulbecco Modifiye Eagle ortamı,% 10 fetal sığır serumu,% 2 L-glutamin, 1 5000 hücre / ^cm2 - bir ya da iki hafta önce 3.000 hücre yoğunluğunda, tohum mezenkimal kök hücreleri gömme T-75 şişelerinde% temel olmayan amino asitler,% 1 penisilin / streptomisin).
   2. 3 gün ve hücreler, 80 kadar bazal üreme ortamı 10 ml yerine - - her 2 harcanan Ortamı çıkarın% 90 konfluent.
   3. ilave kalsiyum klorür veya hücreleri durulama magnezyum klorür olmadan 1x Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu 3 ml, hücreler hasat harcanan ortamı çıkarın ve pipet için. pipet,% 0.25 Try 3 ml bu çözüm çıkarınT-75 şişelerinde büyüyen hücreler üzerine psin-EDTA ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edilir. Bazal büyüme ortamının 9 ml - hücreleri yapışık yüzeyden kaldırılır sonra 6 ekleyin.
   4. Santrifüj MSC'ler, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 600 x g'de, süpernatanı havalandırın, ve 1 ile yeniden askıya - bazal üreme ortamı, 5 ml. Cihaz yönergeleri kullanarak hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
   5. Santrifüj aynı koşullar kullanılarak, toplam hücre yeniden süspanse 1 x 10 ⁶ hücreleri çıkarın ve süpernatant aspire.

Hücre Tohumlu Aljinat Disklerin 2. oluşumu

1. 1 x 10 ⁶ hücre / ml hücre yoğunluğu elde etmek için steril aljinat / ortam çözeltisi 1 ml hücre pelletini yeniden askıya. Hücreler uygun olarak karıştırıldığı zaman hücre alginat karışımı görünüşte homojen bulutlu olacaktır.
2. Pipet kalıbın alt yarısında, altı 6 mm çap x 3 mm uzunluğunda kuyulara hücre alginat karışımı 130 ulkabarcıkları yaratmak için değil, böylece damla damla inşa. Hafif dışbükey menisküsün her bir kenarında üzerinde görünür olmalıdır.
3. Dikkatle steril bir spatula kullanarak kalıp yapısının üst yarısını pürüzsüz ve hücre microsieve zarı kuyularının üstünde olacak şekilde, ters çevirin. Kalıp hücresi ve tamamen aljinat karışımı içeren kuyuları kapsayacak şekilde emin olun, kuyu üstüne inşa yerleştirin.
4. ortasına bastırarak ederken, yüklenen kalıp yapı kaldırın ve bağlayıcı kalıp yapısının üst ve alt yarılarını tutturmak için kalan iki taraf (alt ve üst) klip. Hücre-aljinat çözümleri güvenli şu anda kuyularda sokuldu edilmelidir.
5. Tüm yapı altında olduğundan emin, 102 mM kalsiyum klorür banyosuna bağlanmış kalıp yapı daldırın. 90 dakika için oda sıcaklığında, hücre kültürü kaputu inkübe edin.
6. 90 dakika sonunda, 102 mM kalsiyum klorür kalıp yapı kaldırmaHücre kültürü kaputu kağıt havlu yığını üzerinde banyo ve yer. Dört bağlayıcı klipleri çıkarın ve kalıp yapının iki yarısını ayırın. kuyularda oluşan hidrojeller kabarcıkları olmamalıdır ve tamamen kuyu doldurmalıdır.
7. Bir spatula kullanarak, dikkatli dikkatli gevşetin ve hidrojeller dışarı kama hidrojeller içeren kuyuların kenarına iz. Kalıp yapısı arasında hidrojeller ayrılmasından sonra, doğrudan kalsiyum klorür ve magnezyum klorür ile 1x Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu bir banyo içine hidrojeller bırakın. 5 dakika - 1 için aşırı kalsiyum klorür solüsyonu yıkayın tamamen jelleri örtün.
8. Tamamen hidrojeller kapsayan arzu edilen çanak bazal büyüme ortamı çözeltisine (örn., 6 havuzlu plakalar) içine hidrojeller aktarın. 37 ° C'de hücre kültürü inkübatöründe en az 1 saat% 5 katman adımına devam etmeden önce _CO2 inkübe edin.
   Not: hücreleri ihtiva eden hidrojeller tutulabilir3 gün - başka hücre popülasyonu ile jellerin katman kadar şu anda süresiz hücre kültür inkübatör medya değişiklikleri her 2 tamamlamış olması şartıyla, arzu edilir.

Aljinat Disklerin 3. Katmanlama

1. 1 saat inkübasyon son yarım saat süresince, toplamak ve jeller tavlamak için steril kalıpları ve solüsyon hazırlanır.
   1. x (bir plak için 3 (alüminyum levha içinde x 3 a 3 6 mm çap x 1.5 mm uzunluğunda kuyu) "jel oluşumu kalıp" yüksekliğinin kuyu yarısı olan bir kalıp sıkarak "kesme kalıp" hazırlayın sağ ve sol tarafta bağlayıcı klipleri kullanarak alüminyum levha 3).
   2. x ((alüminyum levha içinde x 3 a 3 9 mm çap x 3 mm boyunda kuyu) bir plak için "jel oluşumu kalıp" den çapı 3 mm daha geniş bir kalıp sıkarak 3 "tavlama kalıp" hazırlayın sağ ve sol tarafta bağlayıcı klipleri kullanarak alüminyum levha 3).
   3. ihtiva eden bir çözelti hazırlayın100 mM sodyum sitrat / 30 mM EDTA, steril su içinde (sodyum sitrat dihidrat, etilendiamintetraasetik asit tetrasodyum tuzu dihidrat).
2. istenen hücre popülasyonlarının jeller çıkarın (bu örnekte, iki hMSCs diskleri) çanak ortamdan ve "kesme kalıbı" kuyu içine koyun. Her jel kalıp üzerinde çıkıntılı jel yarısı ile kuyu içine rahatça oturmalıdır.
3. Bir neşter kullanılarak, kalıp yüzeyi boyunca jel (Bu devre hidrojel kesecek) dilim. jel üst yarısını çevirmek ve açık kalıp kuyunun içine yerleştirin. jel yarısı da iyi kalıp içine rahatça sığacak, ancak şimdi her iki yarım jeller görünür kesilmiş iç yüzeyi ile kalıp yüksekliği olmalıdır. İkinci jel ile tekrarlayın.
   Not: Uyarı: Yalnızca iç kesim yüzeyleri katmanlı diskleri oluşturacaktır. Dış yüzeyler kullanılarak yarıları ayırma neden olur. Bu jel yüzeyi önlemek aktarılır microsieve membrandan bu doku şüphesiTavlama işleminin başarısı.
4. microsieve membran tavlanabilir jel yarılarının her temas halinde olduğundan emin olduktan ve tamamen bunları kapsayan, kuyu üzerine kuru hücre microsieve membranın bir parça yerleştirin. tamamen jelleri kapsayacak şekilde emin olun, microsieve membran üstüne kalın filtre kağıdı yerleştirin.
5. Bu doyana kadar kalın filtre kağıdı üzerine, 100 mM sodyum sitrat / 30 mM EDTA (sodyum sitrat dihidrat, Etilendiamintetraasetik asit tetrasodyum tuzu dihidrat) çözeltisi Pipet. Yaklaşık 750 | il dört kuyu için yeterlidir.
6. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca jeller inkübe edin. Sonra, hücre microsieve zarı ve kalın filtre kağıdı çıkarın ve atın. bağlayıcı klipleri çıkarın ve kalıp açın.
7. Her tavlı jel, kesme yüzeyi yukarı bakacak şekilde hazırlanan "tavlama kalıp" olarak hidrojel bir sodyum sitrat / EDTA ile muamele edilmiş yarısını aktarın. Bu tavlanmış Kat yarısı olacakdürme.
8. kesim yüzeyi olduğunu bu yüzden ikinci yarı jel saygısız, zaten "tavlama kalıp" olarak jel üzerine (bir farklı hücre tipi içerebilir) spatula, asansör kullanma ve ikinci sodyum sitrat / EDTA ile tedavi edilen yarı jel yerleştirin zaten "tavlama kalıp" olarak jel kesim yüzeyi ile temasa geçin.
9. hafifçe aşağı iki jeller arasındaki kabarcıklarını çıkarmak için bir spatula kullanarak iki jeller basın. birbirlerinin üstüne doğrudan olduğundan emin olmak için gerekli olarak da, j eller yerleştirin.
10. Yavaşça "tavlama kalıp" kaldırma ve 30 dakika boyunca 102 mM kalsiyum klorür banyosu içinde daldırın. Bir plak ile kuyu örtmeyin.
11. 30 dakika inkübasyondan sonra, "tavlama kalıp" kaldırmak ve kağıt havlu üzerine koyun. bağlayıcı klipleri çıkarın ve plak kalıp ayırın.
12. tavlanmış jeller toplamak ve kalsiyum klorid ve M ile bir 1 x Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin içine yerleştirin, spatulaagnesium klorür banyo jelleri yıkamak. Daha sonra, arzu edilen bir çanak hücre kültür ortamına tavlanmış hidrojeller transferi (örneğin., 6-yuvalı plaka) kültür.

Sonuçlar

Şekil 1 aljinat hidrojellerin oluşumunu ve katmanlarını gösteriyor. Bu hidrojeller ve tabakalı, yüksek ve dökme hidrojeller karşılaştırılabilir kalır içinde gömülü insan mezenkimal kök hücrelerin Şekil 2. Hücre canlılığı) 'de gösterildiği gibi, Şekil 3' de gösterildiği gibi, hücre popülasyonlarının tam bir başlangıç ​​ayrılma göstermez iki katmanlı jeller tamamlandı. Canlılık değer...

Tartışmalar

Burada, örneğin, örneğin, fizyolojik olarak tabakalı dokularda olanlar, kıkırdak gibi çeşitli hücre popülasyonlarının, ko-kültürlere Katmanlı aljinat hidrojel disklerin oluşturulması için bir protokol açıklar. Bu tarif edilen, kültür platformu olarak tabakalı yapılar, aynı kültür ortamı ya da yük altında maruz iki farklı hücre popülasyonlarının arasındaki etkileşimi incelemek için kullanılabilir.

Aljinat biyolojik olarak uyumlu olduğ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alginic Acid sodium salt	Sigma Aldrich	A1112	Solution made in wt% using DPBS (-/-)
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-/-)	Gibco Life Technologies	14190
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (+/+)	Gibco Life Technologies	14190
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco Life Technologies	11965	Example. Use desired medium type
Syringe Filters (0.02 μm Nylon)	FisherBrand	0979C
Calcium Chloride Dihydrate	Fisher Bioreagents	BP510	Prepare solution in sterile water
Criterion Blotter Filter Paper	Biorad	1704085	Cut to size of endplates for mold formation
Cell Microsieve Membrane (10 μm pore size)	Biodesign Inc of New York	N10R	Cut to size of endplates for mold formation
Sodium citrate dihydrate	FisherScience	S93364
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA)	FisherBioreagent	BP121
Fetal Bovine Serum	Gibco Life Technologies	26140	Used in example mesenchymal stem cell basal growth media
Penicilin/Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco Life Technologies	15140	Used in example mesenchymal stem cell basal growth media
L-Glutamine (200 mM)	Gibco Life Technologies	25030081	Used in example mesenchymal stem cell basal growth media
Non-essential Amino Acids (100x)	Gibco Life Technologies	11140050	Used in example mesenchymal stem cell basal growth media