Las construcciones en capas de alginato: Una plataforma para el co-cultivo de poblaciones celulares heterogéneas

Resumen

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

Resumen

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Introducción

los tejidos de soporte de carga de compresión tales como el cartílago articular o discos intervertebrales consisten en regiones de tejido heterogéneas que son críticos tanto para la función biomecánica y apropiado mecano-transducción en el tejido. No sólo es la organización celular y función distinta en las diferentes regiones, pero las matrices extracelulares (ECM) son también variados en su composición y organización. Por ejemplo, el cartílago articular se compone de tres zonas principales con diferentes morfología celular, la función mecánica, y ECM. Las diferencias en su ventaja ECM a la diferencia de las responsabilidades de soporte de carga; la capa superficial está implicado principalmente en respuesta a la tracción a la carga, mientras que las zonas medias y profundas son principalmente responsables de la respuesta a la compresión ^1. Del mismo modo, en el disco intervertebral, un núcleo pulposo de gel está rodeada por una fibrosis lamelar anillo y las células dentro de estas dos áreas distintas experimentar diferentes tipos de estímulos biofísicos2. En estos tipos de tejidos, células y las matrices extracelulares dentro de las capas de tejido interactúan entre sí ya que el tejido se somete a y responde a fuerzas mecánicas.

Recapitulación de tales estructuras de tejidos heterogéneos sigue siendo un desafío en ingeniería de tejidos y medicina regenerativa, y nuestra comprensión de su importancia biológica es limitada. Hay una necesidad para el cultivo de las plataformas para el análisis de tejidos estratificados, así como co-cultivos de diferentes poblaciones de células dentro de una construcción. En la ingeniería de tejido de cartílago articular, las construcciones de andamio-menos capas se han construido mediante el aprovechamiento de la capacidad de los condrocitos de zona para depositar variada ECM para imitar las diferentes capas de este tejido ^3,4. Sin embargo, las construcciones de hidrogel en capas proporcionan una oportunidad para la investigación de la interacción de diversos tipos de poblaciones de células que carecen de la capacidad para formar un tejido robusto de forma independiente. Por ejemplo, el pop diferenteulations de células madre mesenquimales se puede co-cultivadas dentro de construcciones en capas. Tales andamios capas se han utilizado con ambos condrocitos y diferenciación de las células madre mesenquimales para la ingeniería de tejidos mejorada ^5. No sólo se pueden cultivar conjuntamente diferentes poblaciones de células en capas de hidrogel similares, pero un solo tipo de células también pueden ser cultivadas dentro de las capas que han sido manipulados para tener rigidez variable o contenido bioquímico para provocar diferentes respuestas de las células ^6,7.

Muchos diferentes hidrogeles de biomateriales se han utilizado para la capa poblaciones de células para la ingeniería de tejido de cartílago, tales como los que utilizan polietilenglicol o bases alcohol polivinílico ^7-9. Sin embargo, los hidrogeles de alginato son uno de los biomateriales más simples desde el que crear andamios en capas para el estudio de las poblaciones de células heterogéneas en co-cultivo. Mientras que los hidrogeles de agarosa también se forman fácilmente, los hidrogeles de alginato tienen la ventaja añadida de que permite un fácil esolation de células de la construcción de 3-D para el análisis de células individuales como se ha descrito previamente ^10. En estudios anteriores, los hidrogeles de alginato bi-capas se han formado en láminas delgadas y de estas hojas, se cortaron secciones (por ejemplo., Usando un punzón de biopsia) para aplicaciones particulares, tales como para el análisis de contenido bioquímico o propiedades de cizallamiento interfacial ^11,12. Otro método para la formación de hojas de alginato delgadas se ha descrito con el potencial para la estratificación en múltiples capas, pero aún así se requiera la modificación al hidrogel para su uso en ensayos mecánicos ^13.

A continuación, presentamos un método para crear de forma reproducible discos de hidrogel de alginato bi-capas para su uso en el cocultivo de diferentes poblaciones de células. Esta plataforma disco alginato posee varias ventajas. En primer lugar, la forma reproducible y pequeño tamaño es propicio para la estimulación mecánica de las células embebidas sin necesidad de una biopsia de la PUnch u otra alteración física al hidrogel para muchas aplicaciones. Además, la viabilidad celular se mantiene alta durante el proceso de estratificación, y después de la formación de gel de una clara separación de las dos poblaciones de células dentro del gel es visible sin región de superposición inicial.

Protocolo

1. Preparación para la Formación de Discos de alginato

1. Preparar un 4% (w / v) en solución de alginato de 1x solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin cloruro de calcio añadido o cloruro de magnesio y el lugar en un baño de agua C 37 °. Las concentraciones de la solución de alginato pueden variar, pero 1-4% (w / v) se recomiendan las soluciones de alginato.
2. Mezclar la solución de alginato en una proporción de 1: 1 con la base de medios de cultivo celular caliente (por ejemplo, de Eagle modificado por Dulbecco.) Para el tipo de célula deseado. La concentración de alginato es ahora la mitad de la concentración original, es decir., 2% (w / v). Esterilizar solución de alginato / media usando filtros de jeringa de nylon 0,2 micras estériles.
3. Preparar un baño de estéril cloruro de calcio dihidrato 102 mM en agua estéril con una solución suficiente para sumergir moldes (~ 200 - 300 ml).
4. Recoger el "molde de formación de gel" estéril (diámetro x 3 mm de altura pozos cilíndricos de 6 mm en un 3 x 3 en la placa de aluminio, véase Figura 1) y placas de extremo (inferior: uno de 3 x 3 en la placa de aluminio, superior: uno de 1,5 pulgadas x 3 en la placa de aluminio) y preparar los moldes de la siguiente manera:
   1. Cortar papel grueso filtro (filtro de papel secante) y la membrana celular microtamiz (10 micras de tamaño de poro) para los tamaños de la parte superior e inferior placas terminales y colocarlos en el baño de cloruro de calcio hasta saturado, aproximadamente 1 min. Si se desea, esterilizar el papel de filtro grueso y la membrana a través de microtamiz autoclave o la luz ultravioleta durante 30 minutos antes de su uso.
   2. Puesta en marcha de la mitad (la mitad inferior) de la construcción de moldes.
      1. Coloque los siguientes artículos encima de la otra en el orden siguiente y suavizar con una espátula estéril: gran placa de extremo (3 x en 3 in), papel de filtro grueso, y luego la membrana microtamiz.
      2. Invertir y pulse el molde sobre una pila de toallas de papel para asegurar la pérdida de exceso de solución de cloruro de calcio.
      3. Coloque el "molde de formación de gel" con los pozos cilíndricos en la parte superior de la cell membrana microtamiz y suavemente sujetar el molde juntos en dos lados con clips de la carpeta en los lados derecho e izquierdo. Asegúrese de dejar suficiente espacio para que la placa terminal superior (1,5 pulgadas x 3 pulgadas) para cubrir los pozos por completo más adelante.
   3. Puesta en marcha de la segunda mitad (la mitad superior) de la construcción de moldes.
      1. Coloque los siguientes elementos uno encima de otro en el siguiente orden y suavizar: pequeña placa terminal, papel de filtro grueso, microtamiz membrana.
      2. Invertir y pulse este medio del molde sobre una pila de toallas de papel para asegurar la pérdida de exceso de solución de cloruro de calcio. No fije esta mitad del molde usando clips de la carpeta en este momento.
5. células de cultivo, tal como recomiendan las instrucciones del fabricante. Recoger las células deseadas para empotrar en los hidrogeles de alginato en capas. La densidad celular recomendada es de 1 - 2 x 10 ⁶ células / ml, pero esto se puede variar dependiendo de los experimentos deseados.
   Nota: Cuando se utiliza este métodopara la fabricación de capas con diferentes tipos de células, asegúrese de que la cultura dos tipos de células en paralelo para todas las ocasiones. Las células madre mesenquimales (MSCs) se sembraron a una densidad celular de las células 1 x 10 ⁶ / ml se utilizará como un ejemplo para el siguiente protocolo. El número de células y el número de disco que se pueden escalar para los experimentos según sea necesario.
   1. De una a dos semanas antes de la incrustación, las células madre mesenquimales de semillas a una densidad celular de 3.000 - 5.000 células / cm ² en 10 ml de medio de crecimiento basal (de Eagle modificado por Dulbecco, 10% de suero fetal bovino, 2% de L-glutamina, 1 % no esenciales Aminoácidos, 1% penicilina / estreptomicina) en matraces T-75.
   2. Retire el medio pasó cada 2 - 3 días y reemplazar con 10 ml de medio de cultivo basal hasta que las células son un 80 - 90% de confluencia.
   3. Para cosechar las células, eliminar el medio gastado, y la pipeta de 3 ml de 1x solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin cloruro de calcio añadido o cloruro de magnesio para enjuagar las células. Eliminar a esta solución, pipeta de 3 ml de 0,25% Trypsin-EDTA en células que crecen en matraces T-75, y se incuba durante 5 min a 37 ° C. Después las células se han levantado de la superficie adherente, añadir 6 - 9 ml de medio de crecimiento basal.
   4. MSC centrifugar a 600 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente, aspirar el sobrenadante y resuspender en 1 - 5 ml de medio de cultivo basal. Contar las células utilizando un hemocitómetro usando las instrucciones del dispositivo.
   5. Eliminar 1 x 10 ⁶ células de la resuspensión celular total, de centrifugación utilizando las mismas condiciones, y aspirar el sobrenadante.

2. Formación de sembrado de células discos de alginato

1. Vuelva a suspender el sedimento de células con 1 ml de la solución de alginato / media estéril para alcanzar una densidad celular de 1 x 10 ⁶ células / ml. La mezcla de células-alginato será homogénea nublado en apariencia cuando las células se mezclan en forma apropiada.
2. Pipetear 130 l de la mezcla de células de alginato en los pocillos de altura seis 6 mm de diámetro x 3 mm de la mitad inferior del moldeconstruir gota a gota, a fin de no crear burbujas. Una ligera menisco convexo debe ser visible por encima del borde de cada pocillo.
3. suavizar cuidadosamente la mitad superior de la construcción del molde con una espátula estéril y darle la vuelta, por lo que la membrana celular es microtamiz en la parte superior de los pozos. Coloca el molde construir en la parte superior de los pozos, asegurándose de cubrir los pozos que contienen el celular y la mezcla de alginato por completo.
4. Levante la construcción del molde cargado y, mientras presiona firmemente en el centro, Clip de la carpeta de los otros dos lados (superior e inferior) para sujetar las mitades superior e inferior de la construcción del molde. Las soluciones de alginato por células deben ser enclavado de forma segura en los pocillos en este momento.
5. Sumergir el constructo molde fijado en el baño de cloruro de calcio 102 mM, asegurándose de que toda la estructura se sumerge. Incubar en la campana de cultivo de células a temperatura ambiente durante 90 min.
6. Al final de la 90 min, eliminar el constructo del molde a partir del cloruro de calcio 102 mMbaño y el lugar en una pila de toallas de papel en la campana de cultivo de células. Retire los cuatro clips de la carpeta y separar las dos mitades de la construcción del molde. Los hidrogeles formados en los pozos no deben tener ningún burbujas y deben llenar los pozos por completo.
7. Usando una espátula, rastrear cuidadosamente el borde de los pocillos que contienen los hidrogeles para aflojar cuidadosamente y calzar los hidrogeles. Después de la eliminación de los hidrogeles de la construcción del molde, la caída de los hidrogeles directamente en un baño de de 1x solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco con cloruro de calcio y cloruro de magnesio. Cubrir por completo los geles para lavar el exceso de solución de cloruro de calcio durante 1 - 5 min.
8. La transferencia de los hidrogeles en solución basal medio de crecimiento en el plato deseado (por ejemplo., Placas de 6 pocillos) que cubre completamente los hidrogeles. Incubar durante al menos 1 hr en la incubadora de cultivo celular a 37 ° C y CO ₂ antes de continuar a la etapa de capas de 5%.
   Nota: Los hidrogeles que contienen células se pueden mantener ense desea la incubadora de cultivo celular indefinidamente en este momento hasta la estratificación de los geles con otra población de células, siempre que los cambios de medios de comunicación se han completado cada 2 - 3 días.

3. Estratificación de Discos de alginato

1. Durante la última media hora de la incubación de 1 hora, recogida, preparación de moldes y solución estéril para recocer los geles.
   1. Preparar el "molde de corte" por la fijación de un molde que tiene pozos medio de la altura de la "molde de formación de gel" (pozos de altura 6 mm de diámetro x 1,5 mm en un 3 en x 3 en la placa de aluminio) a una placa de extremo (3 en x 3 en la placa de aluminio) utilizando clips de la carpeta en los lados izquierdo y derecho.
   2. Preparar el "molde de recocido" por la fijación de un molde que es de 3 mm de diámetro mayor que el "molde de formación de gel" (9 mm de diámetro x 3 mm pozos altos en un 3 en x 3 en la placa de aluminio) a una placa de extremo (3 en x 3 en la placa de aluminio) utilizando clips de la carpeta en los lados izquierdo y derecho.
   3. Preparar una solución de100 mM de citrato de sodio / 30 mM EDTA (dihidrato de citrato de sodio, ácido etilendiaminotetraacético tetrasódico dihidrato de sal) en agua estéril.
2. Eliminar geles de poblaciones de células deseadas (en este ejemplo, dos discos con hMSCs) de los medios de comunicación en el plato, y el lugar en los pocillos de corte "de molde". Cada gel deben encajar perfectamente en los pocillos con medio de gel que sobresale por encima del molde.
3. El uso de un bisturí, cortar el gel a lo largo de la superficie del molde (esto reducirá el hidrogel en medio). Voltear la mitad superior del gel y colocarlo en un pozo de molde abierto. La media del gel también deben encajar perfectamente en el molde así, pero ahora ambos geles medio debe ser la altura del molde con la superficie interna de corte visible. Repita con el segundo gel.
   Nota: Advertencia: Solo las superficies de corte interiores formarán discos en capas. El uso de las superficies externas dará lugar a la separación mitades. Se sospecha que la textura de la membrana microtamiz transferido sobre la superficie del gel impidens éxito del proceso de recocido.
4. Coloque un trozo de membrana microtamiz celular seco en la parte superior de los pocillos, asegurándose de que la membrana microtamiz está en contacto con todas las mitades de gel para ser recocido y que cubre por completo. Colocar el papel filtro grueso en la parte superior de la membrana microtamiz, asegurándose de cubrir por completo los geles.
5. Pipetear una solución de citrato de sodio 100 mM / mM EDTA 30 (dihidrato de citrato de sodio, ácido etilendiaminotetraacético tetrasódico dihidrato de sal) en el papel de filtro grueso hasta que se satura. Aproximadamente 750 l es suficiente para cuatro pozos.
6. Incubar los geles durante 1 min a temperatura ambiente. A continuación, retire la membrana celular y microtamiz papel de filtro grueso y desecharlos. Retire los clips de la carpeta y abrir el molde.
7. Para cada gel de recocido, transferir un citrato de sodio / la mitad tratada con EDTA del hidrogel preparado a la "molde de recocido" con la superficie cortada hacia arriba. Esta será la mitad de la const recocidoRUCT.
8. Usando una espátula, levantar y colocar un citrato segundo sódico / EDTA tratados con medio-gel (puede contener un tipo de célula diferente) en el gel ya en el "molde de recocido", volteando este segundo medio-gel de manera que la superficie de corte está en contacto con la superficie de corte del gel ya en el "molde de recocido".
9. Presione suavemente hacia abajo los dos geles utilizando una espátula para eliminar las burbujas entre los dos geles. Además, cambiar la posición de los geles según sea necesario para asegurarse de que son directamente una encima de la otra.
10. Levante con cuidado el "molde de recocido" y sumergirlo en el baño de cloruro de calcio 102 mM durante 30 min. No cubra los pocillos con una placa terminal.
11. Después de la incubación de 30 minutos, retire el "molde de recocido" y colocarlo sobre toallas de papel. Retire los clips de la carpeta y separar el molde de la placa terminal.
12. Usando una espátula, recoger los geles recocidos y los situará en una de Dulbecco 1x Tampón fosfato salino con cloruro de calcio y mbaño de cloruro de agnesio para lavar los geles. Posteriormente, transferir hidrogeles recocidos para medios de cultivo celular en un plato deseado (por ejemplo., Placa de 6 pocillos) para la cultura.

Resultados

La Figura 1 muestra la formación de capas y de los hidrogeles de alginato. Completado geles bi-capas exhiben una separación inicial completa de las poblaciones de células como se muestra en la Figura 2. La viabilidad celular de las células madre mesenquimatosas humanas) embebido dentro de estos hidrogeles y capas sigue siendo alta y comparable a los hidrogeles a granel como se muestra en la Figura 3. La viabilidad se evaluó después...

Discusión

Aquí, se describe un protocolo para la formación de discos de hidrogel de alginato en capas para el estudio de co-cultivos de múltiples poblaciones de células, tales como los de tejidos fisiológicamente en capas, por ejemplo, el cartílago. estructuras en capas, tales como la plataforma de cultivo descrito, se pueden utilizar para examinar la interacción entre las dos poblaciones de células distintas sometidas al mismo entorno de cultivo o bajo carga.

El alginato es un polisa...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alginic Acid sodium salt	Sigma Aldrich	A1112	Solution made in wt% using DPBS (-/-)
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-/-)	Gibco Life Technologies	14190
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (+/+)	Gibco Life Technologies	14190
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco Life Technologies	11965	Example. Use desired medium type
Syringe Filters (0.02 μm Nylon)	FisherBrand	0979C
Calcium Chloride Dihydrate	Fisher Bioreagents	BP510	Prepare solution in sterile water
Criterion Blotter Filter Paper	Biorad	1704085	Cut to size of endplates for mold formation
Cell Microsieve Membrane (10 μm pore size)	Biodesign Inc of New York	N10R	Cut to size of endplates for mold formation
Sodium citrate dihydrate	FisherScience	S93364
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA)	FisherBioreagent	BP121
Fetal Bovine Serum	Gibco Life Technologies	26140	Used in example mesenchymal stem cell basal growth media
Penicilin/Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco Life Technologies	15140	Used in example mesenchymal stem cell basal growth media
L-Glutamine (200 mM)	Gibco Life Technologies	25030081	Used in example mesenchymal stem cell basal growth media
Non-essential Amino Acids (100x)	Gibco Life Technologies	11140050	Used in example mesenchymal stem cell basal growth media