Layered alginato costrutti: Una piattaforma per la cooperazione culturale delle popolazioni cellulari eterogenee

Riepilogo

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

Abstract

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Introduzione

Compressione portanti tessuti come la cartilagine articolare o dischi intervertebrali sono costituiti da regioni tessuti eterogenei che sono fondamentali sia per la funzione biomeccanica e adeguata meccano-trasduzione nel tessuto. Non solo è l'organizzazione cellulare e funzione distinta in diverse regioni, ma le matrici extracellulari (ECM) sono inoltre variazioni nella composizione e organizzazione. Ad esempio, cartilagine articolare è costituito da tre zone primarie con diversi morfologia cellulare, funzione meccanica e ECM. Le differenze a cambiare ECM al differenziale responsabilità portanti; lo strato superficiale è coinvolto soprattutto in risposta alla trazione per caricare, mentre le zone centrali e profonde sono principalmente responsabili per la risposta alla compressione ^1. Allo stesso modo, nel disco intervertebrale, un nucleo polposo simile a gel è circondato da un anello di fibrosi lamellare e le cellule all'interno di queste due aree distinte sperimentare diversi tipi di stimoli biofisici2. In questi tipi di tessuti, cellule e le matrici extracellulari all'interno degli strati di tessuto interagiscono tra loro come il tessuto subisce e risponde a forze meccaniche.

Ricapitolazione di tali strutture dei tessuti eterogenei rimane una sfida in ingegneria dei tessuti e della medicina rigenerativa, e la nostra comprensione del loro significato biologico è limitato. Vi è la necessità per la coltura piattaforme per analizzare tessuti stratificate nonché co-colture di diverse popolazioni di cellule all'interno di un costrutto. In ingegneria dei tessuti cartilagine articolare, costrutti scaffold meno strati sono stati costruiti sfruttando la capacità dei condrociti zonali per depositare varia ECM per simulare i diversi strati di questo tessuto ^3,4. Tuttavia, a strati costrutti idrogel forniscono un'opportunità per indagare l'interazione di diversi tipi di popolazioni di cellule che non hanno la capacità di formare un tessuto robusto in modo indipendente. Ad esempio, pop diversoulations di cellule staminali mesenchimali possono essere co-coltura all'interno di costrutti a strati. Tali ponteggi strati sono stati utilizzati sia con condrociti e differenziazione delle cellule staminali mesenchimali per migliorare ingegneria tissutale ^5. Non solo è possibile diverse popolazioni cellulari essere co-coltura in strati di idrogel simili, ma un unico tipo di cellule possono anche essere coltivati ​​all'interno di strati che sono state manipolate per avere diversa rigidità o il contenuto biochimico per ottenere risposte diverse dalle cellule ^6,7.

Molti idrogel biomateriali differenti sono stati utilizzati per sovrapporre popolazioni cellulari per l'ingegneria tissutale cartilagine come quelle realizzate con glicole polietilene o basi alcool polivinilico ^7-9. Tuttavia, idrogel alginato sono uno dei biomateriali semplici da cui creare scaffold stratificate per studiare popolazioni cellulari eterogenee in co-coltura. Mentre idrogel agarosio sono anche facilmente formate, idrogel alginato hanno il vantaggio di consentire facile èolation di celle dal costrutto 3-D per l'analisi delle singole celle come è stato descritto in precedenza ^10. In studi precedenti, idrogel alginato bi-strati sono stati formati in fogli sottili e da questi fogli, sezioni sono state fette (ad es., Usando un punzone biopsia) per particolari applicazioni come per l'analisi del contenuto biochimica o proprietà di taglio interfacciali ^11,12. Un altro metodo per formare fogli sottili alginato è stato descritto con il potenziale per la stratificazione in più strati, ma richiederebbe alterazione del idrogel per l'uso in test meccanici ^13.

Qui, vi presentiamo un metodo per la creazione di dischi riproducibile idrogel alginato bi-strati per l'utilizzo in co-coltura di diverse popolazioni di cellule. Questa piattaforma disco alginato possiede diversi vantaggi. Principalmente, la forma riproducibile e piccole dimensioni è favorevole per la stimolazione meccanica delle cellule incorporati senza richiedere una biopsia punch o altra modifica fisica alla idrogel per molte applicazioni. Inoltre, la vitalità cellulare rimane elevato durante il processo di stratificazione, e dopo la formazione del gel netta separazione di due popolazioni di cellule all'interno del gel è visibile senza regione di sovrapposizione iniziale.

Protocollo

1. Preparazione per la Formazione di alginato di dischi

1. Preparare un 4% (w / v) soluzione di alginato a 1x Dulbecco Phosphate Buffered Saline senza cloruro di aggiunta di calcio o cloruro di magnesio e posto in un bagno d'acqua 37 ° C. Le concentrazioni di soluzione di alginato può variare, ma 1 - 4% (w / v) sono raccomandati soluzioni di alginato.
2. Mescolare la soluzione di alginato con un rapporto di 1: 1 con base mezzi di coltura cellulare caldo (ad esempio, di Dulbecco Modified Eagle Medium.) Per il tipo cellulare desiderato. La concentrazione alginato è ora metà della concentrazione iniziale, cioè., 2% (w / v). Sterilizzare alginato / soluzione multimediale utilizzando sterili 0,2 micron filtri di nylon siringa.
3. Preparare un bagno di sterile 102 mM cloruro di calcio diidrato in acqua sterile con soluzione sufficiente per sommergere stampi (~ 200 - 300 ml).
4. Raccogliere la sterile "di stampo formazione di gel" (6 mm di diametro x 3 mm pozzi cilindrici alti in un 3 a 3 x in lamiera di alluminio, vedere Figura 1) e placche (inferiore: uno 3 x 3 in lamiera di alluminio, Top: una 1.5 in x 3 in lamiera di alluminio) e preparare stampi come segue:
   1. Tagliare carta spessa filtro (carta da filtro assorbente) e la membrana cellulare microsieve (10 micron dimensioni dei pori) per le dimensioni della parte superiore e inferiore piastre laterali e metterli nella vasca da bagno di cloruro di calcio fino a saturazione, circa 1 min. Se lo si desidera, sterilizzare il filtro di carta spessa e la membrana microsieve tramite autoclave o luce ultravioletta per 30 minuti prima dell'uso.
   2. Set-up metà (la metà inferiore) del costrutto stampo.
      1. Posizionare i seguenti elementi in cima l'un l'altro nel seguente ordine e lisciare con una spatola sterile: grande endplate (3 x 3), carta da filtro di spessore, e quindi la membrana microsieve.
      2. Capovolgere e premere lo stampo su una pila di tovaglioli di carta per assicurare la perdita di soluzione di cloruro di calcio in eccesso.
      3. Posizionare il "muffe gel" con i pozzetti cilindrici in cima alla cell microsieve membrana e delicatamente fissare lo stampo insieme su due lati con legante clip sui lati destro e sinistro. Assicurarsi di lasciare abbastanza spazio per la placca superiore (1,5 in x 3) per coprire completamente i pozzetti in seguito.
   3. Allestimento seconda metà (la metà superiore) del costrutto stampo.
      1. Posizionare i seguenti elementi in cima l'un l'altro nel seguente ordine e levigare: piccola placca motrice, carta da filtro di spessore, a membrana microsieve.
      2. Invertito e premere questo metà dello stampo su una pila di asciugamani di carta per garantire la perdita di soluzione di cloruro di calcio in eccesso. Non fissare questo metà dello stampo utilizzando clip legante in questo momento.
5. cellule di coltura come raccomandato secondo le istruzioni del produttore. Raccogliere le cellule desiderate per incorporare nelle idrogel alginato strati. La densità raccomandata è 1 - 2 x 10 ⁶ cellule / ml, ma questo può essere variata a seconda esperimenti desiderati.
   Nota: quando si utilizza questo metodoper fare gli strati con differenti tipi di cellule, assicurarsi di cultura due tipi di cellule in parallelo per la stratificazione. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) seminate ad una densità cellulare di cellule 1 x 10 ⁶ / ml sarà utilizzato come esempio per il seguente protocollo. numero di cellulare e numero del disco possono essere scalati per esperimenti, se necessario.
   1. Una a due settimane prima incorporamento, cellule staminali seme mesenchimali ad una densità cellulare di 3.000 - 5.000 cellule / cm ² in 10 ml di terreni di crescita basale (Dulbecco Modified Eagle Medium, 10% siero fetale bovino, 2% L-Glutammina, 1 % non-aminoacidi essenziali, 1% penicillina / streptomicina) in T-75 fiaschi.
   2. Rimuovere media speso ogni 2 - 3 giorni e sostituire con 10 ml di mezzi di crescita basale finché le cellule sono 80 - 90% confluenti.
   3. Per raccogliere le cellule, rimuovere i supporti spesi, e pipetta da 3 ml di 1x Dulbecco Phosphate Buffered Saline senza cloruro di calcio aggiunto o cloruro di magnesio per sciacquare le cellule. Rimuovere questa soluzione, pipetta 3 ml di 0,25% TryPSIN-EDTA su cellule in crescita in T-75 fiaschi, e incubare per 5 min a 37 ° C. Dopo che le cellule hanno sollevato dalla superficie di adesione aggiungere 6 - 9 ml di terreni di crescita basale.
   4. MSC centrifugare a 600 xg per 5 min a temperatura ambiente, aspirare il supernatante e risospendere in: 1 - 5 ml di terreni di crescita basale. Contare le cellule utilizzando un emocitometro utilizzando istruzioni del dispositivo.
   5. Rimuovere 1 x 10 ⁶ cellule dalla risospensione delle cellule totali, centrifugare utilizzando le stesse condizioni, e aspirare il surnatante.

2. Formazione di cellule Seeded alginato dischi

1. Risospendere il pellet cellulare con 1 ml di soluzione di alginato / media sterile per ottenere una densità cellulare di 1 x 10 ⁶ cellule / ml. La miscela di cellule-alginato sarà omogeneamente nuvoloso in aspetto quando le cellule sono mescolati in modo appropriato.
2. Pipettare 130 ml di miscela di cellule-alginato in sei diametro di 6 mm x 3 mm pozzi alti nella metà inferiore dello stampocostruire goccia a goccia, in modo da non creare bolle. Un leggero menisco convesso deve essere visibile sopra il bordo di ciascun pozzetto.
3. lisciare cautela la metà superiore del costrutto stampo usando una spatola sterile e capovolgerlo, in modo che la membrana microsieve cellulare è in cima pozzetti. Posizionare lo stampo costrutto sopra dei pozzetti, facendo attenzione a coprire i pozzetti contenenti le cellule e la miscela alginato completamente.
4. Sollevare il costrutto di stampo caricato e, tenendo premuto con forza sul centro, Fermaglio a molla i restanti due lati (superiore e inferiore) per fissare le due metà superiore e inferiore del costrutto stampo. Le soluzioni cell-alginato devono essere immerso saldamente in pozzetti in questo momento.
5. Immergere il costrutto di stampo fissato in 102 mm bagno di cloruro di calcio, facendo in modo che l'intero costrutto è sommerso. Incubare nel cofano coltura cellulare a temperatura ambiente per 90 min.
6. Alla fine del 90 min, rimuovere il costrutto stampo dal cloruro di calcio 102 mMbagno e posto su una pila di asciugamani di carta nel cofano coltura cellulare. Rimuovere tutte e quattro le clip legante e separare le due metà del costrutto stampo. Gli idrogel formati in pozzetti non dovrebbero avere eventuali bolle e devono riempire completamente i pozzetti.
7. Utilizzando una spatola, accuratamente tracciare il bordo dei pozzetti contenenti gli idrogeli per allentare attentamente e incuneare le idrogel. Dopo aver rimosso i idrogel dal costrutto stampo rilasciare gli idrogeli direttamente in un bagno di 1x Dulbecco Phosphate Buffered Saline con cloruro di calcio e cloruro di magnesio. Coprire i gel completamente per lavare via la soluzione di cloruro di calcio in eccesso per 1-5 min.
8. Trasferire i idrogel nella soluzione basale terreni di crescita in piatto desiderato (ad es., Piastre 6 e) che copre completamente i idrogel. Incubare per almeno 1 ora in incubatrice coltura cellulare a 37 ° C e 5% CO ₂ prima di passare alla fase stratificazione.
   Nota: Gli idrogel che contengono le cellule possono essere tenuti inincubatore di coltura cellulare indefinitamente in questo momento fino stratificazione di gel con un'altra popolazione cellulare è desiderato, purché le modifiche di supporto vengono completati ogni 2 - 3 giorni.

3. Stratificazione di alginato di dischi

1. Durante l'ultima mezz'ora della incubazione 1 ora, raccogliere e preparare stampi sterili e soluzioni per la ricottura i gel.
   1. Preparare la "stampo taglio" fissando uno stampo che ha pozzetti la metà dell'altezza della "muffe gel" (da 6 mm di diametro x 1,5 mm pozzi alti in 3 x 3 in lamiera di alluminio) ad una placca (3 x 3 in lamiera di alluminio) con legante clip sui lati destro e sinistro.
   2. Preparare la "stampo annealing" fissando uno stampo che è di 3 mm di diametro maggiore del "muffe gel" (diametro di 9 mm x 3 mm pozzi alte in un 3 a x 3 in lamiera di alluminio) ad una placca (3 x 3 in lamiera di alluminio) con legante clip sui lati destro e sinistro.
   3. Preparare una soluzione di100 mM citrato di sodio / 30 mM EDTA (citrato di sodio diidrato, etilendiamminotetraacetico tetrasodico dell'acido sale diidrato) in acqua sterile.
2. Rimuovere gel di popolazioni cellulari desiderato (in questo esempio, due dischi con hMSCs) da parte dei media nel piatto, e il luogo in pozzi "di taglio di muffa". Ogni gel dovrebbe andare bene comodamente nei pozzetti con la metà del gel che sporge sopra lo stampo.
3. Usando un bisturi, tagliare il gel lungo la superficie dello stampo (questo intercettato idrogel a metà). Vibrazione la metà superiore del gel e metterlo in un pozzo stampo aperto. La metà del gel dovrebbe adattarsi comodamente nello stampo bene, ma ora entrambi i gel mezzo dovrebbe essere l'altezza dello stampo con la superficie interna tagliata visibile. Ripetere con la seconda gel.
   Nota: Attenzione: solo le superfici di taglio interne formeranno dischi sovrapposti. Utilizzando le superfici esterne comporterà la metà di separazione. Si sospetta che trama dalla membrana microsieve trasferito sulla superficie del gel impedisconos successo del processo di ricottura.
4. Posizionare un pezzo di secca membrana cellulare microsieve sopra dei pozzetti, facendo in modo che la membrana microsieve è in contatto con tutte le metà gel essere ricotto e li copre completamente. Posizionare la carta filtro spesso sulla parte superiore della membrana microsieve, avendo cura di coprire completamente i gel.
5. Pipettare una soluzione di 100 mM di sodio citrato / 30 mM EDTA (sodio citrato diidrato, etilendiamminotetracetico tetrasodico dell'acido sale diidrato) sulla carta filtro spesso fino a saturazione. Circa 750 ml è sufficiente per quattro pozzi.
6. Incubare i gel per 1 min a temperatura ambiente. Poi, rimuovere la membrana microsieve cellulare e carta da filtro di spessore e gettarli. Rimuovere le clip legante e aprire lo stampo.
7. Per ogni gel ricotto, trasferire uno citrato di sodio / trattato con EDTA metà del idrogel al preparato "stampo ricottura" con la superficie di taglio verso l'alto. Questo sarà una metà del const ricottoruct.
8. Utilizzando una spatola, sollevare e posizionare un citrato secondo sodio / trattato con EDTA half-gel (può contenere un diverso tipo di cellula) sul gel già nel "muffa annealing", lanciando questa seconda metà gel in modo che la superficie di taglio è in contatto con la superficie di taglio del gel già nel "stampo annealing".
9. Premere delicatamente verso il basso le due gel utilizzando una spatola per eliminare eventuali bolle tra le due gel. Inoltre, riposizionare i gel come necessario per assicurarsi che essi sono direttamente sopra l'altro.
10. Sollevare delicatamente la "muffa ricottura" e immergerlo nella vasca 102 mm di calcio cloruro per 30 min. Non coprire i pozzetti con una placca motrice.
11. Dopo l'incubazione 30 minuti, rimuovere il "muffa ricottura" e posizionarlo sulla carta assorbente. Rimuovere le clip legante e separare lo stampo dalla placca.
12. Utilizzando una spatola, raccogliere i gel ricotto e metterli in un 1x Dulbecco Phosphate Buffered Saline con cloruro di calcio e mbagno di cloruro di agnesium per lavare i gel. Successivamente, il trasferimento idrogel ricotto per terreni di coltura di cellule in un piatto desiderato (ad es., 6 pozzetti) per la cultura.

Risultati

La figura 1 illustra la formazione e la stratificazione degli idrogel alginato. Completato gel bi-strati presentano una separazione iniziale completa di popolazioni cellulari come mostrato in Figura 2. La vitalità cellulare di cellule staminali mesenchimali umane) incorporato all'interno di questi idrogel e stratificato rimane elevata e paragonabile a idrogel di massa come mostrato in figura 3. La vitalità è stata valutata dopo ri...

Discussione

Qui, descriviamo un protocollo per la formazione di dischi idrogel alginato stratificate per lo studio co-colture di più popolazioni cellulari, come quelli nei tessuti fisiologicamente strati, ad esempio, la cartilagine. strutture stratificate, come la piattaforma coltura descritto, possono essere utilizzati per esaminare l'interazione tra due distinte popolazioni cellulari sottoposti allo stesso ambiente coltura o sotto carico.

Alginato è un polisaccaride lineare anionico che...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alginic Acid sodium salt	Sigma Aldrich	A1112	Solution made in wt% using DPBS (-/-)
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-/-)	Gibco Life Technologies	14190
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (+/+)	Gibco Life Technologies	14190
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco Life Technologies	11965	Example. Use desired medium type
Syringe Filters (0.02 μm Nylon)	FisherBrand	0979C
Calcium Chloride Dihydrate	Fisher Bioreagents	BP510	Prepare solution in sterile water
Criterion Blotter Filter Paper	Biorad	1704085	Cut to size of endplates for mold formation
Cell Microsieve Membrane (10 μm pore size)	Biodesign Inc of New York	N10R	Cut to size of endplates for mold formation
Sodium citrate dihydrate	FisherScience	S93364
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA)	FisherBioreagent	BP121
Fetal Bovine Serum	Gibco Life Technologies	26140	Used in example mesenchymal stem cell basal growth media
Penicilin/Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco Life Technologies	15140	Used in example mesenchymal stem cell basal growth media
L-Glutamine (200 mM)	Gibco Life Technologies	25030081	Used in example mesenchymal stem cell basal growth media
Non-essential Amino Acids (100x)	Gibco Life Technologies	11140050	Used in example mesenchymal stem cell basal growth media