Layered Alginate Konstrukten: Eine Plattform für Co-Kultur von heterogenen Zellpopulationen

Zusammenfassung

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

Zusammenfassung

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Einleitung

Auflast Lager Gewebe wie Gelenkknorpel oder Bandscheiben bestehen aus heterogenen Gewebebereiche, die sowohl für biomechanische Funktion und geeignete mechano-Übertragung im Gewebe entscheidend sind. Nicht nur zelluläre Organisation und Funktion verschieden in den verschiedenen Regionen, aber die extrazellulären Matrizes (ECM) sind ebenfalls in der Zusammensetzung und Organisation variieren. Zum Beispiel besteht Gelenkknorpel von drei primären Zonen mit unterschiedlichen Zellmorphologie, mechanische Funktion und ECM. Die Unterschiede in ihren ECM führen tragende Verantwortung Differential; die oberflächliche Schicht wird in Zugwirkung zu laden, während die mittleren und tiefen Zonen sind in erster Linie verantwortlich für die Reaktion auf Kompression ¹ in erster Linie beteiligt. Ebenso in der Bandscheibe, eine gelartige Nucleus pulposus durch eine lamellar Annulus fibrosis und die Zellen in diesen zwei unterschiedlichen Bereichen erfahren verschiedene Arten von Stimuli biophysikalischen umgeben2. In dieser Art von Gewebe, Zellen und der extrazellulären Matrix innerhalb der Gewebeschichten miteinander interagieren , wenn das Gewebe unterzogen wird und reagiert auf mechanische Kräfte.

Rekapitulation eines solchen heterogenen Gewebestrukturen bleibt eine Herausforderung im Tissue Engineering und der regenerativen Medizin und unser Verständnis für ihre biologische Bedeutung ist begrenzt. Es besteht ein Bedarf für die Kultivierung von Plattformen für die geschichtete Gewebe sowie Co-Kulturen von verschiedenen Populationen von Zellen innerhalb eines Konstrukts analysiert. Im Gelenkknorpel Tissue Engineering , gerüstlosen Schichtaufbauten wurden durch die Nutzung der Fähigkeit der zonalen Chondrozyten zu deponieren variiert ECM zu imitieren , die verschiedenen Schichten dieses Gewebes ^3,4 aufgebaut. Jedoch liefern geschichtete Hydrogels Konstrukten eine Möglichkeit für das Zusammenspiel von verschiedenen Arten von Zellpopulationen untersucht, der die Fähigkeit fehlt, unabhängig eine robuste Gewebe zu bilden. Zum Beispiel können verschiedene Populations von mesenchymalen Stammzellen können in Schichtkonstrukten co-kultiviert werden. Solche Schicht Gerüste wurden mit beiden Chondrozyten und Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen für eine verbesserte Tissue Engineering ⁵ verwendet. Nicht nur können unterschiedliche Zellpopulationen in ähnlicher Hydrogelschichten co-kultiviert werden, aber ein Zelltyp kann auch innerhalb der Schichten gezüchtet werden , die manipuliert wurden variierende Steifheit oder biochemische Gehalt zu haben , um verschiedene Antworten von Zellen ^6,7 hervorzurufen.

Viele verschiedene Biomaterial Hydrogele wurden ^7-9 zu Schicht Zellpopulationen für die Knorpelgewebetechnik , wie sie unter Verwendung von Polyethylenglykol oder Polyvinylalkohol Basen verwendet. Jedoch Alginat-Hydrogele sind eine der einfachsten Biomaterialien, aus denen für die Untersuchung heterogene Zellpopulationen in Kokultur geschichtete Gerüste zu schaffen. Während Agarose Hydrogele auch leicht gebildet werden, weisen Alginat-Hydrogele den zusätzlichen Vorteil, dass einfach ist,polation von Zellen aus dem 3-D - Konstrukt für die Analyse von einzelnen Zellen , wie bereits zuvor beschrieben ^10. In früheren Studien wurden zweischichtige Alginat - Hydrogele wurden in dünnen Blechen gebildet und aus diesen Folien wurden die Schnitte geschnitten (z. B. eine Biopsie Stanze verwendet wird ) für bestimmte Anwendungen , wie beispielsweise für die Analyse von biochemischen Inhalte oder Grenzflächenschereigenschaften ^11,12. Ein anderes Verfahren zur Bildung dünner Blätter Alginat wurde mit dem Potential für Schichtung in mehreren Schichten beschrieben, aber dennoch würde Veränderung des Hydrogels für die Verwendung in mechanischen Prüfung ¹³ erfordern.

Hier stellen wir ein Verfahren zur zweischichtigen Alginat Hydrogelscheiben zur Verwendung in Co-Kultivierung von verschiedenen Populationen von Zellen reproduzierbar zu schaffen. Diese Alginat-Disc-Plattform besitzt mehrere Vorteile. In erster Linie die reproduzierbare Form und die geringe Größe ist für die mechanische Stimulation der eingebetteten Zellen förderlich, ohne eine Biopsie pu erfordernnch oder andere physikalische Veränderung des Hydrogels für viele Anwendungen. Darüber hinaus bleibt die Lebensfähigkeit der Zellen während des Beschichtungsprozesses hoch, und nach der Gelbildung eine klare Trennung der beiden Zellpopulationen innerhalb des Gels ist sichtbar ohne anfängliche Überlappungsbereich.

Protokoll

1. Vorbereitung für die Bildung von Alginate Discs

1. Vorbereiten eines 4% (w / v) Alginatlösung in 1x Dulbecco-Phosphat-gepufferter Saline ohne Zusatz von Calciumchlorid oder Magnesiumchlorid und in einem 37 ° C Wasserbad. Konzentrationen der Alginatlösung kann variieren, aber von 1 bis 4% (w / v) Alginatlösungen werden empfohlen.
2. Mischen Sie die Alginat - Lösung in einem Verhältnis von 1: 1 mit warmem Zellkulturmedien Base (beispielsweise Dulbeccos modifiziertes Eagle - Medium.) Für den gewünschten Zelltyp. Die Alginat - Konzentration ist jetzt die Hälfte der ursprünglichen Konzentration, dh., 2% (w / v). Sterilisieren Alginat / Media-Lösung steril 0,2 um Nylonspritzenfilter verwenden.
3. Bereiten Sie ein Bad aus sterilen 102 mM Calciumchloriddihydrat in sterilem Wasser mit genug Lösung Formen zu versenken (~ 200 bis 300 ml).
4. Sammeln Sie die sterile "Gelbildung Form" (6 mm Durchmesser x 3 mm groß zylindrischen Vertiefungen in einer 3 in x 3 in Aluminiumplatte, siehe Abbildung 1) und Endplatten (Unten: ein 3 in x 3 in Aluminium - Platte, oben: eine 1,5 in x 3 in Aluminiumplatte) und Formen herzustellen , wie folgt:
   1. Schneiden dick Filterpapier (blotter Filterpapier) und die Zelle Mikrosieb Membran (10 & mgr; m Porengröße) zu den Größen der oberen und unteren Endplatten und legen Sie sie in das Bad Calciumchlorid bis zur Sättigung, ca. 1 min. Falls gewünscht, sterilisiert die dicke Filterpapier und die Membran über Mikrosieb Autoklaven oder ultraviolettem Licht für 30 min vor der Verwendung.
   2. Set-up die Hälfte (die untere Hälfte) des Form Konstrukt.
      1. Legen Sie die folgenden Elemente übereinander in der folgenden Reihenfolge und glätten einen sterilen Spatel mit: große Endscheibe (3 in x 3 Zoll), dickes Filterpapier, und dann die Mikrosieb Membran.
      2. Umkehren und drücken Sie die Form auf einen Stapel von Papierhandtüchern Verlust von überschüssigem Calciumchloridlösung zu gewährleisten.
      3. Legen Sie die "Gel-Bildung Form" mit den zylindrischen Vertiefungen auf der Oberseite des cell Mikrosieb Membran und befestigen Sie sanft die Form zusammen auf zwei Seiten mit Binder Clips auf der linken und rechten Seite. Achten Sie darauf, genügend Platz für die obere Endscheibe (1,5 Zoll x 3 Zoll) zu verlassen, die Vertiefungen vollständig später zu decken.
   3. Set-up in der zweiten Hälfte (die obere Hälfte) des Form Konstrukt.
      1. Legen Sie die folgenden Elemente übereinander in der folgenden Reihenfolge und glätten: kleine Endscheibe, dickes Filterpapier, Mikrosieb Membran.
      2. Umkehren und drücken Sie diese Hälfte der Form auf einen Stapel von Papierhandtüchern Verlust von überschüssigem Calciumchloridlösung zu gewährleisten. mit Binder Clips zu diesem Zeitpunkt nicht über diese Hälfte der Form zu befestigen.
5. Kulturzellen als den Anweisungen des Herstellers empfohlen. Ernten Sie die gewünschten Zellen in den geschichteten Alginat Hydrogele einbetten. Die empfohlene Zelldichte von 1 bis 2 x 10 ⁶ Zellen / ml, dies kann jedoch je nach gewünschter Experimenten variiert werden.
   Hinweis: Bei Verwendung dieser Methodefür Schichten mit unterschiedlichen Zelltypen zu machen, machen die Kultur zwei Zelltypen parallel sicher für die Schichtung. Mesenchymale Stammzellen (MSCs) in einer Zelldichte von 1 x 10 ⁶ Zellen / ml wird als ein Beispiel für das folgende Protokoll verwendet werden. Die Zellzahl und Disc-Nummer kann für Experimente skaliert werden nach Bedarf.
   1. Ein bis zwei Wochen vor dem Einbetten, seed mesenchymalen Stammzellen in einer Zelldichte von 3000 - 5000 Zellen / cm ² in 10 ml basale Wachstumsmedien (Dulbeccos Modified Eagle Medium, das 10% fötales Rinderserum, 2% L-Glutamin, 1 % nicht-essentielle Aminosäuren, 1% Penicillin / Streptomycin) in T-75-Flaschen.
   2. Entfernen Sie verbrauchte Medien alle 2 - 3 Tage und ersetzen mit 10 ml basale Wachstumsmedium, bis die Zellen 80 sind - konfluenten 90%.
   3. Ernten Zellen, verbrauchtes Medium zu entfernen, und die Pipette 3 ml 1x Dulbecco-Phosphat-gepufferter Saline ohne Zusatz von Calciumchlorid oder Magnesiumchlorid zu spülen Zellen. Entfernen Sie diese Lösung, Pipette 3 ml 0,25% VersuchenPSIN-EDTA auf Zellen in T-75-Kolben wachsen, und bei 37 ° C für 5 min inkubiert. Nachdem die Zellen von der Haftfläche angehoben haben, fügen Sie 6 - 9 ml basale Wachstumsmedien.
   4. Zentrifuge MSCs bei 600 xg für 5 min bei Raumtemperatur, saugt den Überstand und resuspendiere in 1 bis 5 ml der basalen Wachstumsmedien. Zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Zählkammer Gerät Anweisungen.
   5. Entfernen Sie 1 x 10 ⁶ Zellen aus der gesamten Zelle Aufwirbelung, Zentrifuge die gleichen Bedingungen verwendet, und den Überstand aspirieren.

2. Bildung von Zell Gesetzt Alginate Discs

1. Resuspendieren des Zellpellets mit 1 ml der sterilen Alginat / Medien - Lösung mit einer Zelldichte von 1 x 10 ⁶ Zellen / ml zu erreichen. Das Zell-Alginat-Gemisch wird in Aussehen homogen trübe sein, wenn die Zellen in geeigneter Weise gemischt werden.
2. Pipette 130 ul der Zell-Alginat-Mischung in sechs 6 mm Durchmesser x 3 mm tall Vertiefungen in der unteren Hälfte der FormKonstrukt tropft, um keine Luftblasen zu erzeugen. Ein leicht konvexer Meniskus sollte über dem Rand jeder Vertiefung sichtbar.
3. Sorgfältig glätten sie über die obere Hälfte der Form Konstrukt, das eine sterile Spachtel und drehen, so dass die Zelle Mikrosieb Membran auf der Oberseite der Brunnen ist. Legen Sie die Form auf der Oberseite der Brunnen bauen, um sicherzustellen, die Vertiefungen, die die Zelle und Alginat-Gemisch vollständig zu bedecken.
4. Heben Sie die beschickte Form Konstrukt und unten drücken und fest auf der Mitte, Heftklammer, die verbleibenden zwei Seiten (oben und unten), um die oberen und unteren Hälften der Form Konstrukt zu befestigen. Die Zell-Alginat-Lösungen sollten sicher in den Vertiefungen zu diesem Zeitpunkt eingebettet werden.
5. Tauchen Sie die befestigte Form Konstrukt in der 102 mM Calciumchlorid-Bad, um sicherzustellen, dass das gesamte Konstrukt eingetaucht ist. Inkubieren der Zellkultur Haube bei Raumtemperatur für 90 min.
6. Am Ende der 90 Minuten, entfernen Sie das Form Konstrukt aus dem 102 mM CalciumchloridBad und auf einen Stapel von Papierhandtüchern in der Zellkultur Kapuze. Entfernen Sie alle vier Binder Clips und trennen die beiden Hälften der Form Konstrukt. Hydrogele in den Vertiefungen gebildet werden, sollten keine Blasen haben und die Vertiefungen vollständig ausfüllen sollte.
7. Mit einem Spatel, Spuren sorgfältig den Rand der Vertiefungen der Hydrogele enthaltend die Hydrogele sorgfältig lösen und Keil aus. Nachdem die Hydrogele aus der Form Konstrukts Entfernen Drop die Hydrogele direkt in ein Bad aus 1x Dulbecco Phosphat-gepufferte Saline mit Calciumchlorid und Magnesiumchlorid. Decken Sie die Gele vollständig abzuwaschen das überschüssige Calciumchloridlösung für 1 - 5 min.
8. Übertragen Sie die Hydrogele in basalen Nährmedien Lösung in gewünschte Schale (z. B. 6 - Well - Platten) , die vollständig der Hydrogele abdeckt. Mindestens 1 Stunde in der Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C und 5% CO ₂ für vor zur Schichtungsschritt fort.
   Anmerkung: Hydrogele Zellen enthält, kann gehalten werden indie Zellkultur-Inkubator auf unbestimmte Zeit zu dieser Zeit, bis der Gele mit einem anderen Zellpopulation Schichtung gewünscht wird, vorausgesetzt, dass Medienwechsel alle 2 abgeschlossen sind - 3 Tage.

3. Layering von Alginate Discs

1. Während der letzten halben Stunde der 1-stündigen Inkubation sammeln und bereiten sterile Formen und Lösung für die Gele Glühen.
   1. Bereiten Sie die "Stanzform" durch eine Form Befestigung, die Vertiefungen der Hälfte der Höhe der "Gelbildung Form" (6 mm Durchmesser x 1,5 mm groß Brunnen in einem 3 in x 3 in Aluminiumplatte) zu einer Endscheibe (3 in x hat 3 in Aluminiumplatte) -Bindemittel Clips auf der linken und rechten Seite verwendet wird.
   2. Bereiten Sie die "annealing mold" durch eine Formbefestigungs, die 3 mm im Durchmesser größer als der "Gelbildung mold" (9 mm Durchmesser x 3 mm tall Vertiefungen in einer 3 in x 3 in Aluminiumplatte) zu einer Endplatte (3 in x 3 in Aluminiumplatte) -Bindemittel Clips auf der linken und rechten Seite verwendet wird.
   3. Eine Lösung aus100 mM Natriumcitrat / 30 mM EDTA (Natriumcitrat-Dihydrat, dihydrat Ethylendiamintetraessigsäure-Tetranatriumsalz) in sterilem Wasser.
2. Entfernen Sie Gele der gewünschten Zellpopulationen (in diesem Beispiel zwei Scheiben mit hMSCs) von den Medien in der Schale, und legen Sie in die "Stanzform" Brunnen. Jedes Gel sollte eng anliegen in die Vertiefungen mit der Hälfte des Gels über der Form vorsteht.
3. Mit einem Skalpell schneiden, das Gel auf der Oberfläche der Form (dies wird das Hydrogel in Hälften geschnitten). Drehen Sie die obere Hälfte des Gels und legen Sie sie in eine offene Form gut. Die Hälfte des Gels sollte auch eng in die Form passt gut, aber jetzt beide Halb Gele sollte die Höhe der Form mit dem ausgeschnittenen Innenfläche sichtbar sein. Wiederholen Sie mit dem zweiten Gel.
   Hinweis: Achtung: Es werden nur die inneren Schnittflächen werden geschichteten Scheiben bilden. die Außenflächen Verwendung in der Hälften Trenn führen. Es ist diese Textur aus der Mikrosieb Membran auf die Geloberfläche übertragen Verdacht verhindernDer Erfolg des Wärmebehandlungsprozesses.
4. Legen Sie ein Stück Trockenzelle Mikrosieb Membran auf der Oberseite der Vertiefungen, um sicherzustellen, dass die Mikrosieb Membran in Kontakt mit allen der Gel-Hälften werden geglüht und bedeckt sie vollständig. Legen Sie dickes Filterpapier auf der Oberseite der Mikrosieb Membran, um sicherzustellen, die Gele vollständig zu bedecken.
5. Pipettieren einer Lösung von 100 mM Natriumcitrat / 30 mM EDTA (Natriumcitratdihydrat, dihydrat Ethylendiamintetraessigsäure -tetranatriumsalz) auf den dicken Filterpapier, bis er gesättigt ist. Ungefähr 750 & mgr; l ist für vier Brunnen ausreichend.
6. Inkubieren der Gele für 1 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie dann die Zelle Mikrosieb Membran und dicke Filterpapier und entsorgen Sie sie. Entfernen Sie die Binder Clips und öffnen Sie die Form.
7. Für jede geglüht Gel, Transfer ein Natriumcitrat / EDTA-behandelten Hälfte des Hydrogels auf die vorbereitete "Glühen Form" mit der Schnittfläche nach oben. Dies wird eine Hälfte des geglüht const seinein- em.
8. Mit einem Spatel, Lift und legen Sie eine zweite Natriumcitrat / EDTA-behandelten Halb Gel (eine andere Zelltyp enthalten kann) auf das Gel bereits in der "Glühen Form", diese zweite Halb Gel Spiegeln, so dass die Schnittfläche in ist Kontakt mit der Schnittfläche des Gels bereits in der "Glühen Form".
9. Drücken Sie vorsichtig auf die beiden Gele mit einem Spatel keine Blasen zwischen den beiden Gele zu entfernen verwenden. Auch neu positionieren die Gele nach Bedarf, um sicherzustellen, dass sie direkt auf voneinander.
10. Heben Sie die "Glühen mould" und es in der 102 mM Calciumchlorid-Bad für 30 Minuten untertauchen. Sie nicht die Brunnen mit einer Endscheibe decken.
11. Nach der 30 Minuten Inkubation, entfernen Sie das "Glühen mould" und es auf Papiertücher legen. Entfernen Sie die Binder Clips und trennen Sie die Form von der Endscheibe.
12. Mit einem Spatel, sammeln die geglüht Gele und sie in einer phosphatgepufferten Salz des 1x Dulbecco mit Calciumchlorid und magnesium Chlorid-Bad die Gele zu waschen. Anschließend übertragen geglüht Hydrogele Zellkulturmedien in einer gewünschten Schale (z. B. 6-well - Platte) für die Kultur.

Ergebnisse

1 zeigt die Bildung und die Schichtung der Alginat - Hydrogele. Abgeschlossen zweischichtigen Gele zeigen eine vollständige anfängliche Trennung von Zellpopulationen , wie in 2 gezeigt. Die Lebensfähigkeit der Zellen von humanen mesenchymalen Stammzellen) eingebettet in diesen Hydrogelen und geschichtete bleibt hoch und vergleichbar mit den bulk Hydrogele wie in Figur 3 gezeigt ist . Die Lebensfähigkeit wurde bewertet nach dem Temper...

Diskussion

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Bildung von geschichteten Alginat Hydrogelscheiben zur Untersuchung Kokulturen von mehreren Zellpopulationen, wie sie in physiologisch geschichteten Geweben, beispielsweise Knorpel. Schichtstrukturen, wie beispielsweise die Kulturplattform beschrieben, kann das Zusammenspiel zwischen zwei verschiedenen Zellpopulationen zu derselben Kulturumgebung oder unter Belastung zu untersuchen, verwendet werden.

Alginate ein anionisches lineares Polysaccha...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alginic Acid sodium salt	Sigma Aldrich	A1112	Solution made in wt% using DPBS (-/-)
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-/-)	Gibco Life Technologies	14190
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (+/+)	Gibco Life Technologies	14190
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco Life Technologies	11965	Example. Use desired medium type
Syringe Filters (0.02 μm Nylon)	FisherBrand	0979C
Calcium Chloride Dihydrate	Fisher Bioreagents	BP510	Prepare solution in sterile water
Criterion Blotter Filter Paper	Biorad	1704085	Cut to size of endplates for mold formation
Cell Microsieve Membrane (10 μm pore size)	Biodesign Inc of New York	N10R	Cut to size of endplates for mold formation
Sodium citrate dihydrate	FisherScience	S93364
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA)	FisherBioreagent	BP121
Fetal Bovine Serum	Gibco Life Technologies	26140	Used in example mesenchymal stem cell basal growth media
Penicilin/Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco Life Technologies	15140	Used in example mesenchymal stem cell basal growth media
L-Glutamine (200 mM)	Gibco Life Technologies	25030081	Used in example mesenchymal stem cell basal growth media
Non-essential Amino Acids (100x)	Gibco Life Technologies	11140050	Used in example mesenchymal stem cell basal growth media