إعداد العينات MALDI متجانسة للتطبيقات الكمية

Summary

ويتجلى بروتوكول للحد من التغاير المكانية إشارات أيون في مطياف الكتلة MALDI من خلال تنظيم درجة حرارة الركيزة أثناء عمليات تجفيف العينة.

Abstract

This protocol demonstrates a simple sample preparation to reduce spatial heterogeneity in ion signals during matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry. The heterogeneity of ion signals is a severe problem in MALDI, which results in poor data reproducibility and makes MALDI unsuitable for quantitative analysis. By regulating sample plate temperature during sample preparation, thermal-induced hydrodynamic flows inside droplets of sample solution are able to reduce the heterogeneity problem. A room-temperature sample preparation chamber equipped with a temperature-regulated copper base block that holds MALDI sample plates facilitates precise control of the sample drying condition. After drying of sample droplets, the temperature of sample plates is returned to room temperature and removed from the chamber for subsequent mass spectrometric analysis. The areas of samples are examined with MALDI-imaging mass spectrometry to obtain the spatial distribution of all components in the sample. In comparison with the conventional dried-droplet method that prepares samples under ambient conditions without temperature control, the samples prepared with the method demonstrated herein show significantly better spatial distribution and signal intensity. According to observations using carbohydrate and peptide samples, decreasing substrate temperature while maintaining the surroundings at ambient temperature during the drying process can effectively reduce the heterogeneity of ion signals. This method is generally applicable to various combinations of samples and matrices.

Introduction

Mass spectrometry (MS) is one of the most important analytical techniques for analyzing the molecular compositions of complex samples. Among all the ionization methods used in MS, matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) is the most sensitive and widely used method in bioanalytical applications.¹ In comparison to other ionization techniques, MALDI has the highest sensitivity and high tolerance to salt contaminants. Such analytical properties make MALDI the first choice for carbohydrate analysis and many proteomics applications. However, sample preparation is a crucial step for obtaining high quality data in MALDI-MS.

The most commonly used sample preparation method for MALDI-MS is the dried-droplet method, in which sample droplets are deposited on a surface and dried under ambient conditions. This drying method is simple and generally effective.^2-5 However, a common problem in the dried-droplet method is that the resultant analyte/matrix crystals normally distribute irregularly. In many cases, the crystals aggregate at the periphery of sample areas, resulting in the so-called ring-stain formation.^6-8 The heterogeneous crystal morphologies affect the spatial distribution of analyte molecules, which results in severe fluctuation in ion signal over sample areas. Such severe signal fluctuations and poor data reproducibility are known as the "sweet spot" problem in MALDI-MS.⁹ Thus, there is a great need for reducing spatial heterogeneities in MALDI-MS dried droplet applications.

Hydrodynamic flows in the sample droplet play an important role in determining the spatial distribution of samples prepared with the dried-droplet method.^10-12 It was found that the evaporation of solvent induces outward capillary flows within droplets, which are responsible for the ring-stain formation.^7,10 In contrast, recirculation flows induced by tangential surface-tension gradients may counterbalance the outward capillary flows.¹³ If the recirculation flow speeds are higher than that of the outward capillary flows, the samples can be efficiently redistributed to reduce the heterogeneity problem.¹⁴

In this work, we demonstrate a detailed protocol for preparing samples with a simple drying chamber to induce efficient recirculation flows during droplet drying processes. Droplet drying conditions are precisely controlled, including the temperatures of the sample plate and its surroundings, and the relative humidity within the chamber. The model analytes include maltotriose and bradykinin chain (1-7). The matrix used for the demonstration is 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP). The samples are examined with time-of-flight (TOF) MS, and the data are analyzed quantitatively to show the reduction of heterogeneity.

Protocol

ملاحظة: تم تطوير هذا البروتوكول للحد من عدم التجانس المكاني للمالتوتريوز والبراديكينين جزء (1-7) التي أعدت مع أسلوب المجفف قطرة. يتكون البروتوكول من ثلاث خطوات رئيسية، بما في ذلك إعداد وشروط مسبقة، عينة ترسب والتجفيف، وتحليل البيانات مطياف الكتلة. وترد الإجراءات وصفها في مزيد من التفاصيل أدناه:

1. إعداد وشروط مسبقة

1. تنظيف لوحة عينة
   1. ارتداء قفازات النتريل وغسل اليدين لوحة عينة بلطف مع المنظفات والمقطر، منزوع الأيونات الماء (أحواض دبي الجافة العالمية).
   2. شطف لوحة عينة مع الميثانول (MeOH) وأحواض دبي الجافة العالمية.
   3. إدراج لوحة عينة في مل دورق 600 وملء مع أحواض دبي الجافة العالمية.
   4. يصوتن لوحة عينة في أحواض دبي الجافة العالمية لمدة 15 دقيقة في حمام بالموجات فوق الصوتية (200 واط، 40 كيلو هرتز).
   5. إزالة أحواض دبي الجافة العالمية من الدورق وملء الكأس مع MeOH.
   6. يصوتن لوحة عينة في MeOH لمدة 15 دقيقة في حمام بالموجات فوق الصوتية (200 واط، 40 كيلو هرتز).
   7. ينفخون قطرات المذيبات على لوحة مع غاز النيتروجين والحفاظ على لوحة عينة جافة قبل عينة الترسيب.
2. تنظم غرفة التجفيف درجة الحرارة
   ملاحظة: إن غرفة التجفيف هو 35 × 20 × 45 سم ³ (العرض × العمق × الارتفاع) غرفة الاكريليك ويبين الشكل 1 صورة من هذا النظام التجفيف. يتم إزالة الغرفة مع غاز النيتروجين درجة حرارة الغرفة من خلال مقياس الجريان الغاز بمعدل تدفق مستمر للحفاظ على انخفاض النسبية الرطوبة حالة رصدها من قبل الرطوبة معايرة مثبتة داخل غرفة التجفيف. ويستخدم كتلة قاعدة من النحاس في غرفة التجفيف مجهزة ثابت دائري درجة حرارة الماء مبرمجة لاستيعاب لوحات عينة الفولاذ المقاوم للصدأ. كتلة قاعدة النحاس قادرة على تنظيم درجة حرارة لوحة عينة 5-25 درجة مئوية. ويتم رصد درجات الحرارة من الهواء، كتلة قاعدة من النحاس، ولوحة عينة من K- نوع المزدوجات الحرارية.
   1. فتح الباب ووضع بسرعة لوحة العينة على النحاسكتلة قاعدة ثم أغلق الباب.
   2. ضبط يدويا الجريان الغاز لضبط معدل تدفق النيتروجين إلى 10 قدم مكعب في الساعة (SCFH).
   3. مراقبة الرطوبة النسبية في غرفة التجفيف من قبل الرطوبة وتهذيب الجريان الغاز لضمان الرطوبة النسبية هي دائما أقل من 25٪.
   4. رصد درجات الحرارة من لوحة عينة من K- نوع المزدوجات الحرارية وضبط درجة الحرارة شكل دائري المياه يدويا حتى تصل لوحة عينة 5 درجة مئوية لمدة التجربة أو درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) من أجل السيطرة.
      ملاحظة: من أجل تحقيق الاستقرار في لوحة العينة عند درجة حرارة تصميم، وعادة ما ضبط درجة الحرارة شكل دائري المياه 0-5 درجة مئوية أقل من عينة تصميم. على سبيل المثال، للحفاظ على 5 درجات مئوية في لوحة عينة، وتحديد درجة الحرارة في شكل دائري المياه في حدود 0-2 درجة مئوية. للحفاظ على لوحة العينة في درجة حرارة 25 درجة مئوية، وتحديد درجة الحرارة في شكل دائري المياه في حدود 23 إلى 25 درجة مئوية.
   5. ضمان وصلت درجات الحرارة المطلوبة والرطوبة النسبية (الجدول 1) قبل عينة الترسيب.
      ملاحظة: يتم عرض جميع المعلمات وكذلك القيم محيطهم لعمليات التجفيف مع مختلف درجات الحرارة عينة لوحة في الجدول 1.
      ملاحظة: في انخفاض درجة حرارة العينة لوحة، قد يحدث تكثف الماء على لوحة عينة إذا كان باب الغرفة مفتوحا لفترة طويلة. في حالة حدوث تكاثف المياه، ويغلق الباب ولا إيداع أي عينة على ذلك حتى يتم تجفيفها تكاثف المياه.
3. إعداد مصفوفة وتحليلها حلول
   1. إعداد مصفوفة حلول
      1. إعداد 0.1 حل M ثاب مع 50٪ الأسيتونتريل (إيه سي): 50٪ أحواض دبي الجافة العالمية محلول مائي.
   2. إعداد التحاليل
      1. إعداد 10 ^-4 M حل مالتوتريوز مع أحواض دبي الجافة العالمية.
      2. إعداد 10 ^-5 M البراديكينين جزء (1-7) حل في 50٪ الأسيتونتريل(إيه سي): 50٪ أحواض دبي الجافة العالمية محلول مائي.

2. ترسب العينة والتجفيف

1. بريمكس 0.25 ميكرولتر من 0.1 M حل ثاب و 0.25 ميكرولتر من 10 ^-4 M مالتوتريوز أو 10 حلول في أنبوب microcentrifuge ^-5 M البراديكينين جزء (1-7).
2. دوامة حل مختلط لمدة 3 ثانية.
3. أجهزة الطرد المركزي في حل مختلط لمدة 2 ثانية (2000 x ج) لجمع الحل في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي.
4. فتح باب غرفة التجفيف، بعناية إيداع 0.1 ميكرولتر من الحل على طبق من ذهب العينة مع ماصة وإغلاق الباب على الفور.
5. انتظر الحبرية عينة لتجف.
   . ملاحظة: تجفيف مرات عادة لاحظت مع مختلف درجات الحرارة عينة لوحة مدرجة في الجدول (1) لدرجة حرارة العينة لوحة من 5 درجات مئوية، ومتوسط وقت التجفيف هو 800 إلى 1000 ثانية؛ لدرجة حرارة العينة لوحة من 25 درجة مئوية، ومتوسط ​​وقت التجفيف هو 100-150 قالمفوضية الأوروبية.
6. بعد التجفيف، وفتح باب غرفة التجفيف.
7. ضبط درجة الحرارة شكل دائري المياه إلى درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية).
   ملاحظة: تخطي هذه الخطوة إذا بقيت لوحة عينة باستمرار في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) أثناء عملية التجفيف.
8. بعد العينة تعود درجة الحرارة لوحة لدرجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية)، وإزالة لوحة عينة من غرفة التجفيف.
9. دراسة مورفولوجية العينة تحت مجهر تشريحي 5X وأخذ لقطة صورة مشرق الميدان.
   ملاحظة: إذا لم يكن يتوقع مثل الأشكال التضاريسية وضوح الشمس، فمن الضروري إعداد نموذج جديد مع نفس الإجراء. وتظهر الأشكال التضاريسية الكريستال نموذجية في لوحات العلوي من الشكل 2.
   ملاحظة: في الحالات مع انخفاض درجات الحرارة لوحة عينة، مثل 5 درجات مئوية، فمن المهم أن الاحماء لوحة العينة إلى درجة حرارة الغرفة قبل إخراجها من غرفة التجفيف. عند إيداع العينات، لا تبقي لمحلول خلطن في غيض من ماصة أكثر من 10 ثانية. لا تستخدم الحل خلط مرة أخرى بعد إيداع العينات. لوحات العليا من الشكل 2 تظهر الصور مشرق الميدان من عينات أعدت مع مختلف درجات الحرارة عينة لوحة.

تحليل 3. الطيف الكتلي البيانات

1. الطيف الكتلي الحصول على البيانات
   ملاحظة: بعد التحضير، ويمكن تحليل العينة باستخدام مطياف التصوير كتلة. في الدراسة الحالية، وتجرى التجارب MS التصوير باستخدام مزامنة TOF ثنائي القطبية المدمج مختبر (DP-TOF) مطياف التصوير كتلة ¹⁵ التجاري MALDI-TOF الطيف كتلة مع القدرة على التصوير أيضا مناسبة لمثل هذه التجارب. ويتم تشغيل مطياف الكتلة في استخراج الخطي وسائط أيون إيجابية مع تأخير استخراج الأمثل. الطاقة الحركية للأيونات 20 كيلو فولت. حجم شعاع الليزر هو 35 ميكرون في القطر على سطح العينة، وطيف من كل بقعة هو افيالغضب من 5 طلقات الليزر.
   1. إدراج لوحة عينة في مطياف الكتلة MALDI.
   2. أداء التصوير تحليل الطيف الكتلي للعينة أعد الخطوات 2،1-2،9.
   3. حدد ذروة كتلة مميزة من قائمة الكتلة هو مبين في إطار النتيجة وانقر على "2D" إلى رسم صورة أيون ثنائي الأبعاد.
      ملاحظة: للحصول على مالتوتريوز مختلطة مع ثاب، وsodiated القمم مميزة مالتوتريوز، ثاب البروتونية، وsodiated ثاب. لجزء البراديكينين (1-7) مختلطة مع ثاب، وتشمل القمم مميزة البروتونية جزء البراديكينين (1-7)، البروتونية ثاب، وsodiated ثاب.
   4. انقر على أزرار التعديل في نافذة منبثقة لتحديد الحدود العليا والدنيا لشدة الإشارة والنقر على "حفظ الصورة". ويحدد هذا الإعداد على النقيض من الصور أيون.
      ملاحظة: في كل مجموعة من الأفراد من البيانات، يتم استبعاد المناطق متصدع وبقع فارغة تظهر سطوع منخفض.
   5. مراقبة ومقارنة أيونصورة مع صورة مشرق الميدان الذي اتخذ في خطوة 2.9.
      ملاحظة: التصوير قياس الطيف الكتلي وبناء الصور من أيونات معينة يمكن أن يتحقق مع الأوراق التجارية. ويرجع ذلك إلى مجموعة متنوعة من الحصول على البيانات وبرامج التحليل، يجب على المستخدمين متابعة تعليمات البرامج المقدمة من قبل بائع أداة للحصول على صور ذات جودة عالية.
2. تحليل البيانات
   ملاحظة: يتم تحليل التباين العينات كميا. في هذه المظاهرة، وينقسم كل عينة إلى مناطق مركزية متعددة من قبل البرامج المطورة داخليا لتحليل التوزيع المكاني للأيونات. كما يمكن إجراء التحليل باستخدام برنامج تحليل بيانات قائمة بذاتها.
   1. انقر على بقع فارغة والمناطق تصدع في الصورة أيون هو مبين في إطار النتيجة لإزالة المناطق غير مهم.
      ملاحظة: يعرف هذا الإجراء المنطقة الأساسية للصورة أيون.
   2. انقر على "تجد حافة" الزر للعثور على طبقة قصوى للصورة أيون.
   3. انقر على "خصم" لحفظ المعلومات أيون فرة من طبقة قصوى في قاعدة بيانات وإزالة هذه الطبقة من الصورة أيون في وقت واحد. وهناك خانة الاختيار تمثل هذه الطبقة قصوى تظهر في قائمة "بيانات الناتج" من النافذة نتيجة.
   4. كرر الخطوات من 3.2.2 و 3.2.3 حتى يتم تعريف مركز الصورة أيون.
   5. انقر وتحديد كافة خانات الاختيار في قائمة "بيانات الناتج" وفوق "تصدير" لتصدير البيانات.
   6. فتح البيانات التي تم تصديرها باستخدام برنامج جداول البيانات لحساب متوسط ​​وفرة ايون من كل طبقة للحصول على معلومات التوزيع المكاني للأيونات.

النتائج

وتظهر الصور مشرق الميدان وكذلك الصور MS من مالتوتريوز والبراديكينين جزء (1-7) التي أعدت مع درجة حرارة العينة لوحة من 5 و 25 درجة مئوية في الشكل 1. وفي حالة مالتوتريوز sodiated، في إشارة أيون أساسا بملء في محيط منطقة العينة عند إعدادها مع درجة حرار...

Discussion

استنادا إلى التنبؤات النظرية السابقة، يمكن أن تدفقات الهيدروديناميكية التي يسببها درجة الحرارة داخل قطرات التغلب الخارج التدفقات الشعرية الناجمة عن تبخر المذيبات. ومما يعزز كفاءة هذا التعميم الداخلي للجزيئات عندما التدرجات درجة الحرارة في زيادة قطرة. ووفقا للنتا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Detergent powder	Alconox	242985
Methanol	Merck	106009
Acetonitrile	Merck	100003
2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP)	Sigma-Aldrich	T64602
Bradykinin fragment (1-7)	Sigma-Aldrich	B1651
Maltotriose	Sigma-Aldrich	47884
Pipette tips	Mettler Toledo	17005091
Microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
Equipment
Milli-Q water purification system	Millipore	ZMQS6VFT1
Powder-free nitrile gloves	Microflex	SU-690
600 ml beaker	Duran	2110648
Ultrasonic cleaner	Delta	DC300H
Hygrometer	Wisewind	5330
Nitrogen gas flowmeter	Dwyer	RMA-6-SSV
K-type thermocouples	Digitron	311-1670
Centrifuge	Select BioProducts	Force Mini
Pipette	Rainin	pipet-lite XLS
Stereomicroscope	Olympus	SZX16
Temperature controllable drying chamber	this lab
Synchronized dual-polarity time-of-flight imaging mass spectrometer (DP-TOF IMS)	this lab
MALDI-TOF stainless steel sample target	this lab